Name: Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer het screenen van veldverzamelde muggen op virale infecties met behulp van een Vero-celkweekassay. Deze methode detecteert diverse virussen uit verschillende taxonomische families en verbetert het begrip van virale ecologie in muggenpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij dankbaar erkennen de belangrijke bijdragen van Drs. John Anderson, Andrew Main en Shirley Tirrell aan deze studie. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) en het Amerikaanse ministerie van Landbouw (58-6615-1-218, CONH00768, en CONH00773).

1. Mosquito sorteren en identificatie <ol><li> De volgende procedures worden uitgevoerd op een open laboratorium bankje in een speciale bioveiligheidsniveau-2 (BSL-2) laboratorium door medewerkers die zijn opgeleid om te werken met live muggen. Een &quot;koude keten&quot; is gedurende de gehele procedure. </li><li> Verdoven leven volwassen muggen door het plaatsen van mosquito collectie zak in een vriezer -20 ° gedurende 5 minuten. Overdracht opvangzak aan een geïsoleerde container met droog ijs. Sluit het deksel en bloot muggen aan koolstof-dioxide gedurende 1-3 minuten om te zorgen voor een volledige knock-down. </li><li> Tik onder narcose muggen op een pre-gekoelde pan geplaatst op een bed van droog ijs. Afzonderlijke individuele vrouwelijke muggen met fijn pincet en plaats in plastic bekers gedeelte. Dek af met deksel en plaats bekers op nat ijs. </li><li> Identificeer muggen tot de soorten die met behulp van beschrijvende taxonomisch toetsen op basis van externe mug morfologie met behulp van een stereo-installatie dissectiemicroscoop (10-60X zoom) gemonteerd op een elektronische chill tafel. </li><li> Combineer geïdentificeerd muggen soorten in poelen van ≤ 50 personen in 2 ml snap-cap flacons met een koperen BB. Injectieflacons zijn voorzien van een unieke identificatiecode. </li><li> Na de identificatie van alle muggen, zijn flacons geplaatst in gelabelde zakken en hield in een piepschuim koelbox met droog ijs. </li><li> Bewaar mug zwembaden in een temperatuur van -80 ° C vriezer tot virus testen. </li></ol> 2. Bioveiligheid overwegingen om het virus te isoleren van muggen <ol><li> De volgende procedures worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) laboratorium door medewerkers die zijn opgeleid om te werken op dit niveau van insluiting 1. Laboratoriumfaciliteiten, apparatuur, procedures en praktijken zijn onderworpen aan de institutionele, provinciale en federale toezicht op en inspectie. Zoek de passende opleiding en goedkeuring voordat de volgende protocollen. </li><li> Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor elke procedure, zoals disposable jassen, handschoenen, gezicht schilden, en gasmaskers. </li><li> Desinfecteer werken oppervlakken met 70% alcohol voor en na de voltooiing van de procedures. </li><li> Celculturen en potentieel infectieus materiaal worden behandeld in een klasse II bioveiligheid kast (BSC). </li><li> Mosquito zwembaden zijn gehomogeniseerd in een mixer-molen die is geplaatst in een BSC. </li><li> Mosquito homogenaten worden gecentrifugeerd in een aerosol-strakke microcentrifuge. Als deze procedure niet kan worden uitgevoerd binnen een BSC, moet de exploitant een masker te dragen bij het bedienen van en het ophalen van monsters uit de centrifuge. </li><li> Pipetten en pipetpunten werken met dit materiaal in de BSC (bioveiligheid kast) zijn gedrenkt in 10% bleekwater voorafgaand aan de autoclaaf. Alle laboratorium-afval wordt ontsmet door autoclaveren voorafgaand aan de beschikking. </li></ol> 3. Voorbereiding van de Vero-cellen <ol><li> Giet de cultuur van de media een grote weefselkweek vat (175 cm 2) van samenvloeiende Vero-cellen (Clone E6) in afval bekerglas met bleekmiddel. </li><li> Was Vero-cellen door het toevoegen van een 5 ml van PBS en werveling over laag van cellen en langs de zijkanten van kolf en zorg ervoor dat grondig te dekken hele monolaag. </li><li> Giet PBS in afval beker. </li><li> Voeg 2,5 ml trypsine-EDTA en werveling over laag van cellen en zorg ervoor dat grondig te dekken hele monolaag. </li><li> Incubeer kolf in incubator gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Schud en draai fles om cellen van onder het oppervlak te verwijderen. De cellen moet gemakkelijk glijden; incubeer een extra 1-5 minuten als de cellen niet gemakkelijk glijden. </li><li> Voeg 5 ml van de Minimal Essential Media (MEM), 5% foetaal bovine serum (FBS), met behulp van een serologische pipet en pipet up-and-down 10-20 keer te breken van de klompen van de cellen. </li><li> Voeg een extra 15 ml MEM, 5% FBS voor een totaal volume van 22,5 ml en meng goed. </li><li> Plaats 40 kleine weefselkweekflessen (25 cm 2) rechtop in twee racks (20 flessen / rek). </li><li> Plaats de rekken met flessen in de bioveiligheid kast en verwijder fles caps, het plaatsen van caps direct voor kolven. </li><li> Doseer 4 ml MEM, 5% FBS in elke kolf met behulp van een serologische pipet. </li><li> Verdeel 0,5 ml gesuspendeerd cellen in elke kolf (~ 1:06 splitsen ratio) Vervang de fles caps. </li><li> Voeg 50 ml MEM, 5% FBS terug naar de oorspronkelijke grote weefselkweek kolf met de resterende celsuspensie (~ 2.5 km) en terug te keren kolf de incubator. Dezelfde grote weefselkweek fles kunnen opnieuw worden gebruikt tot 5 passages en vervolgens een nieuwe fles moet worden opgezet om het te vervangen. </li><li> Plaats kleine weefselkweek kolven in stapels op de tray. Swirl de lade om ervoor te zorgen dat de media gelijkmatig de bodem van de flaks dekt. </li><li> Plaats kleine flesjes in de incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 en &#39;s nachts tot 80-90% confluent groeien. </li></ol> 4. Voorbereiding van de mug zwembaden <ol><li> Houd muggen zwembaden koud tijdens het testen procedures. Gebruik van pre-gekoeldevriezer rekken en mixer-molen cassettes, ijskoude reagentia, en een gekoelde centrifuge bij het verwerken van mug zwembaden. </li><li> Plaats de buisjes met muggen in een pre-gekoelde diepvries rack en voeg 1 tot 1,5 mL PBS-G aan elke buis van de muggen. </li><li> Ophalen mixer-molen cassettes uit de vriezer. Plaats 24 buizen in elke cassette en vervolgens veilig in de mixer-molen. </li><li> Homogeniseren de monsters gedurende 4 minuten bij 25 cycli / seconde. De mixer molen schudt de buizen met hoge snelheid en een metalen BB in elke buis verstoort de mug weefsel. </li><li> Centrifugebuizen gedurende 6 minuten bij 7.000 tpm. </li><li> Plaats de buisjes terug in vriezer rekken totdat geënt in Vero-cellen. </li></ol> 5. Inoculatie van Vero-cellen met een mug zwembad homogenaten <ol><li> Controleer ten minste een weefselkweek kolf van elke serie onder omgekeerde microscoop om een ​​adequate confluentie en de gezondheid van de cellen te verzekeren; verwachten dat ongeveer 80-90% dekking. </li><li> Line up 20 kleine weefselkweekflessen in een rek en een label kolven met de bijbehorende toetreding nummers van elke mug zwembad. </li><li> Draai caps en decanteer het grootste deel van de media uit weefselkweek flessen in afval beker. Laat voldoende media in de kolf volledig vacht cel monolaag. </li><li> Aliquot 100μL van supernatant van elke verwerkte mug zwembad in de overeenkomstige weefselkweek kolf. </li><li> Vervang en draai cultuur fles dop. </li><li> Leg cultuur flessen plat op shaker gedurende 5 minuten (op kamertemperatuur) op 35-40 rpm. </li><li> Return 20 weefselkweek kolven om rechtop in een rek en plaats in de BSC. </li><li> Ontzegeld, 3 weefselkweek flessen in een keer, afzien van 4 ml groei media in elke kolf met behulp van een serologische pipet, te vervangen caps. </li><li> Zorg ervoor dat de pipetpunt niet de cultuur fles nek of lip contact. Verandering pipetpunten zo nodig als contact wordt gemaakt met de kolf. </li><li> Incubeer weefselkweekflessen bij 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 6. Screening Vero cellen voor virusgroei <ol><li> Scherm ingeënt weefselkweek flessen op tekenen van virale infectie, cytopathische effect (CPE), van 3-7 dagen na de inenting. </li><li> Visueel op celculturen voor CPE en / of vervuiling door het kantelen van de flessen en het onderzoeken van de media die zwembaden op de bodem van de kolf. De media zal verschijnen troebel als de cellen verslechteren tijdens de CPE of als gevolg van de groei van gist, schimmel of bacteriële besmetting. </li><li> Opnieuw te onderzoeken celculturen die troebel media vertonen onder een omgekeerde microscoop. Virussen veroorzaken cellen misvormd en breekt los van de cultuur kolven. Celculturen met zichtbare verontreinigingen, zoals gist, andere bacteriën, schimmels of zware mug puin, opnieuw worden getest door het passeren van de originele mug zwembad door middel van een injectiespuit 0.22μM filter. </li><li> Aseptisch afzien van 1-2 ml van media van virus-positieve celculturen in gelabelde cryotubes met behulp van een serologische pipet. </li><li> Virus culturen zijn opgeslagen bij -80 ° C tot geïdentificeerd met behulp van de juiste diagnostische testen. </li></ol> 7. Bereiding van reagentia <ol><li> MEM, 5% FBS. Los 37,6 g poeder MEM in een uiteindelijk volume van 4 L van dd H 2 0. Doseer-oplossing in 500 ml porties in de media flessen en autoclaaf. Als oplossing is afgekoeld, aseptisch toe te voegen 26 ml hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 5,2 ml L-glutamine, 5,2 ml anti-biotic/mycotic, en 10,4 ml 7,5% natriumbicarbonaat bij elke fles. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> PBS-G. Los 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na 2 HPO 4, 0,4 g KH 2 PO 4, en 4 ml van 0,5% Phenol Red in 1000 mL dd H 2 0. Pas de pH op 7,1-7,4 met 2 N NaOH (indien nodig). In een aparte beker, warmte 600 ml H 2 0 aan de kook. Verwijderen uit hot-plate, voeg 10 g gelatine, en lossen. Voeg opgeloste gelatine oplossing voor de PBS-oplossing en pas uiteindelijke volume van 2 L met dd H 2 O. Doseer 100 ml van de oplossing in flessen en autoclaaf. Als oplossing is afgekoeld, voeg aseptisch 42,8 ml hitte-geïnactiveerd konijn serum en 1,4 mL anti-biotic/mycotic. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> PBS cel wassen. Voeg 50 ml 10x Dulbecco&#39;s PBS tot 400 ml dd H 2 O. Pas de pH op 7,1 met 2 N NaOH. Pas uiteindelijk volume van 500 ml met dd H 2 O. Filter oplossing met 0.2uM vacuümfilter unit. Doseer in 5 ml porties in 8 ml schroefdop buizen. Bewaren bij 4 ° C. </li></ol> 8. Representatieve resultaten Negen verschillende virussen van vier taxonomische gezinnen werden hersteld van muggen verzameld tijdens continue bewaking gehele staat in Connecticut 1.997 tot 2.010 (tabel 1). Vijf van deze virussen is bekend dat ze ziekten bij de mens de belangrijkste pathogenen die West-Nijl virus-en Oost-equine encephalitis virus veroorzaken. Nieuwe ontdekkingen zijn onder meer: ​​de eerste isolatie van WNV uit muggen verzameld inNoord-Amerika in 1999 2, de eerste isolatie van Potosi virus in het noordoosten van de VS in 2000 3, en de eerste isolatie van La Crosse virus in New England in 2005 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Familie </td><td> Nee isoleert </td><td> Nee locaties </td><td> Nee jaren ontdekt </td><td> Ziekte van de mens </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> West-Nijl virus </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Matige tot ernstige, koorts, encefalitis </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Eastern equine encephalitis virus </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Ernstige, encefalitis </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J virus </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> Niet bekend </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Canyon virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> Milde tot matige koorts, meningitis </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Potosi virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> Niet bekend </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> Milde tot ernstige, koorts, neurologische ziekte in twee gedocumenteerde gevallen </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> Niet bekend </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Matige tot ernstige, encefalitis </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Vlaanderen virus </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> Niet bekend </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Virussen gedetecteerd in het veld verzameld muggen door Vero celcultuur assay. Muggen werden verzameld tijdens de gehele staat surveillance in Connecticut 1,997 tot 2.010.

<ol><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChosewood%2C+LC+%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories</a>. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).</li>
<li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes%2C+crows%2C+and+a+Cooper%27s+hawk+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+collected+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+%28Bunyaviridae%29+isolated+from+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+%28Bunyaviridae%3A+Orthobunyavirus%29+from+field-collected+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+ten-year+analysis%2C+1997-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li>
<li>Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaty%2C+BJ+%22Diagnostic+Procedures+for+Viral%2C+Rickettsial%2C+and+Chlamydial+Infections%22">Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections</a>. , American Public Health Association. 189-212 (1995).</li>
<li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarabatsos%2C+N+%22International+Catalogue+of+Arboviruses+Including+Certain+Other+Viruses+of+Vertebrates%22">International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates</a>. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).</li>
<li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens%2C+field-collected+mosquitoes%2C+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li>
<li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li>
</ol>

Vero celcultuur-test dient als een effectieve methode om het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit van virussen. Dit in tegenstelling tot moleculaire methoden die specifiek zijn gericht op een of een paar virussen van belang. Bovendien hebben we ontdekt dat Vero celcultuur-test ook is, zo niet gevoeliger dan RT-PCR 7 en biedt ons virusisolaten die in onze referentie collectie opgeslagen voor toekomstig onderzoek. Toch kan celkweek systemen niet geschikt zijn in veel gevallen. Deze aanpak maakt...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat NaHCO 3, 7,5% Soln. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamine 200mm 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Poedervorm minimaal essentieel medium (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco&#39;s PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Konijnenserum </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Vero-cellen (Clone E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Kleine weefselkweek flessen, geventileerd caps, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Grote weefselkweek flessen, geventileerd caps, 175 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Koper-gecoate BB&#39;s, 4,5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mixer Mill </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack vriezer rekken </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detectie van infectieus virus van field-muggen verzameld door vero cell culture assay

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Muggen zenden een aantal verschillende virussen waaronder belangrijke menselijke ziekteverwekkers, zoals het West-Nijlvirus, knokkelkoorts virus, en chickungunya virus. Veel van deze virussen zijn toegenomen in hun endemische reeksen en uitgebreid met nieuwe gebieden, noodzakelijk effectief toezicht en controle programma&#39;s om te reageren op deze bedreigingen. Een strategie om te virusactiviteit monitoren omvat het verzamelen van grote aantallen muggen uit endemische sites en testen ze voor virale infectie. In dit artikel beschrijven we hoe te behandelen, verwerken, en het scherm het veld verzameld muggen voor besmettelijke virus door Vero celcultuur assay. Muggen zijn gesorteerd op locatie val en soorten, en gegroepeerd in zwembaden met ≤ 50 individuen. Gepoolde monsters zijn gehomogeniseerd in gebufferde zoutoplossing met behulp van een mixer-molen en de waterige fase wordt geënt op confluente Vero celculturen (Clone E6). Celculturen worden gecontroleerd op cytopathogeen ingang van dag 3-7 na de inoculatie en virussen gekweekt in celkweek worden geïdentificeerd door de juiste diagnostische testen. Door gebruik te maken van deze benadering hebben we geïsoleerde 9 verschillende virussen van muggen verzameld in Connecticut, VS, en onder deze, 5 is bekend dat de menselijke ziekte te veroorzaken. Drie van deze virussen (West-Nijl virus, Potosi virus, en La Crosse virus) vertegenwoordigen nieuwe records voor Noord-Amerika of het New England regio sinds 1999. De mogelijkheid om een ​​grote diversiteit aan virussen te detecteren is essentieel voor het toezicht op zowel gevestigde als opkomende virussen in de mug bevolking.

We beschrijven een methode voor het verwerken en het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit aan virussen door Vero celcultuur assay. Door gebruik te maken van deze techniek, hebben we ontdekt 9 verschillende virussen van vier taxonomische families in muggen verzameld in Connecticut.

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Muggen verspreiden een aantal verschillende virussen, waaronder belangrijke menselijke pathogenen zoals het West-Nijlvirus, het denguevirus en het chikungunya-virus. Veel ...

Het algemene doel van deze procedure is om in het veld verzamelde muggen te screenen op virale infectie middels een Vero-celkweekanalyse. Eerst worden de in het veld verzamelde muggen gesorteerd op soort. De muggen worden vervolgens gehomogeniseerd met behulp van een mengmolen.Zodra de muskietenhomogenaten zijn bereid, worden Vero-cellen gekweekt ter voorbereiding op de virustests; elke Vero-celcultuur wordt vervolgens geïnoculeerd met één enkel muskietenhomogenaat, vijf minuten op een schudmachine geplaatst en daarna geïncubeerd bij 37 °C om de virussen te laten propageren. Ten slotte worden de culturen visueel onderzocht op bewijs van door virussen geïnduceerde cytopathische effecten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals RT-PCR is dat het mogelijk maakt om muskieten te screenen op een grote diversiteit aan virale agentia die in celcultuur groeien.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de medische entomologie, zoals de rol die verschillende muggensoorten spelen bij het ondersteunen van virusoverdracht. Gebruik een faciliteit met biosafety level 2 voor de volgende procedure. Plaats de opvangzak met levende muggen 15 minuten lang bij -20 °C om ze te anesthetiseren.Zodra de insecten zijn genarceerd, brengt u de zak over naar een geïsoleerde container met droogijs en stelt u de muggen één tot drie minuten bloot aan koolstofdioxide om een volledige knockdown te garanderen. Plaats de muggen vervolgens op een vooraf gekoelde pan op een bed van droogijs. Identificeer met een fijne pincet de vrouwelijke insecten en breng deze over naar plastic monsterbekertjes.Vrouwtjes kunnen van mannetjes worden onderscheiden door de monddelen en antennes te bestuderen. Sluit de bekers af en plaats ze op nat ijs. Gebruik hiervoor een stereodissectiemicroscoop op een elektronische koeltafel en een taxonomische sleutel.Identificeer de soort van elke mug en pool muggen van dezelfde soort in gelabelde snap-cap vials van twee milliliter die een koperen balletje bevatten. Er kunnen tot 50 individuen in één buis worden gepoold naarmate deze gevuld raken. Plaats de vials in gelabelde zakken op een styrofoam container met droogijs.Zodra alle muggen zijn geïdentificeerd, kunnen ze worden bewaard bij minus 80 °C tot aan de homogenisatie. Gebruik voor deze procedure een faciliteit met biosafety level 3 en werk in een klasse 2 biosafety cabinet. Voeg ongeveer 1 mL PBSG per buis toe en plaats de buizen met muggen in een vooraf gekoelde mixer mill cassette.Plaats de gevulde cassette stevig in een kolfmolen en homogeniseer de muggenpools gedurende vier minuten bij 25 cycli per seconde. Zodra de muggen zijn gehomogeniseerd, worden de buisjes overgebracht naar een aerosoledichte gekoelde microcentrifuge en gecentrifugeerd. De muggenhomogenaat wordt gecentrifugeerd bij 7.000 RPM gedurende zes minuten.Na centrifugatie kunnen de buisjes worden bewaard bij -80 °C tot aan de virustesten. Giet het kweekmedium uit een T 175-fles met confluente farrow-cellen in een afvalbeker met bleekmiddel. Voeg vijf milliliter PBS toe aan de fles en was de cellen gelijkmatig voordat de PBS in de afvalbeker wordt gegoten.Voeg na het wassen van de cellen 2,5 milliliters tripsin EDTA toe en incubeer de kolf bij 37 °C en 5% CO2 gedurende vijf minuten om de cellen los te maken. Zodra de cellen zijn losgekomen, voegt u vijf milliliters MEM toe en pipetteert u de cellen meerdere keren op en neer om eventuele klonters op te lossen. Voeg vervolgens nog eens 15 milliliters MEM toe.Plaats 40 T 25-kolfjes in twee rekken in de biologische veiligheidskast en verwijder de doppen, waarbij u deze direct voor elk kolfje plaatst. Gebruik een steriele pipet om 4 mL MEM in elk kolfje te pipetteren. Voeg vervolgens 0,5 mL gesuspendeerde vari-cellen toe en sluit de kolfjes met de doppen. Stapel de kolfjes op een plateau en draai ze voorzichtig rond om ervoor te zorgen dat het medium de bodem van de kolfjes gelijkmatig bedekt.Incubeer de culturen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende de nacht of totdat de cellen 80 tot 90% confluent zijn. Haal 20 kleine flessen uit de incubator en label deze met het bijbehorende toegangsnummer van elke muggenpool. Giet het grootste deel van het medium uit elke fles in de afvalbak, waarbij slechts genoeg medium wordt achtergelaten om de cellaag te bedekken.Breng 100 µL supernatant van elk mugenhomogenaat over naar de overeenkomstig gelabelde kolf en sluit de kolven stevig af. Zodra de supernatanten zijn overgebracht, worden de kolven vijf minuten geplaatst op een shaker ingesteld op 35 tot 40 RRP M. Plaats de kolven terug in de veiligheidskast en voeg vier mL groeimedium toe aan elke kolf.Sluit de kolven opnieuw af en incubeer deze gedurende drie tot zeven dagen bij 37 °C en 5% CO2. Zodra de culturen klaar zijn voor screening, wordt het medium eerst visueel geïnspecteerd. Troebel medium duidt op viraal geïnduceerde cytopathische effecten, contaminatie met andere microben, of beide; onderzoek de culturen met troebel medium vervolgens onder een omgekeerde lichtmicroscoop.Virussen zorgen er doorgaans voor dat cellen misvormd raken en loslaten van de kweekflessen. Indien besmetting met bacteriën, gist of schimmels wordt vastgesteld, of als de kweek veel muggenresten bevat, dient de oorspronkelijke muggenpool opnieuw te worden getest na filtratie door een spuitfilter van 0,22 micron. Dispenseer aseptisch gefiltreerde één tot twee milliliter medium van viruspositieve kweken die niet besmet zijn met andere micro-organismen in gelabelde cryobuisjes.Bewaar de virusbevattende monsters bij minus 80 graden Celsius tot aan de identificatie, waarbij de passende diagnostische analyses met deze assay worden gebruikt. Negen verschillende typen virussen uit vier taxonomische families werden teruggevonden in muggen die in Connecticut zijn verzameld tijdens een continue surveillanceperiode in de hele staat van 1997 tot 2010. Verschillende van deze virussen, waaronder het Eastern equine encephalitis virus en het West Nile Virus, staan erom bekend dat ze menselijke ziekten veroorzaken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muggen moet sorteren, verwerken en screenen op virale infectie middels een virale celkweekassay.

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methoden voor het gebruik van Alphavirus transducing systemen om TL-verslaggevers uit te drukken in vitro en in volwassen muggen worden beschreven. Deze techniek kan worden aangepast aan een eiwit van belang uit te drukken in plaats van of naast een verslaggever.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

This video demonstrates an assay to measure antibody-dependent enhancement (ADE) of Dengue virus infection using Zika Virus Convalescent Serum. The assay uses Dengue reporter viral particles (RVPs) encoding a green fluorescent protein. Serum antibodies against the Zika Virus cross-react with RVPs to form a complex. The bound antibodies enhance RVP uptake by cells expressing the Fc receptor, which is detected using flow cytometry.

An In Vitro Assay to Examine the Antibody-Dependent Enhancement of Viral Infection

Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Dit protocol beschrijft een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest om speekselkliersporozoïeten bij muggen te detecteren. Met behulp van gemakkelijk verkrijgbare monoklonale antilichamen maakt de methode kosteneffectieve detectie met hoge doorvoer mogelijk van muggen die Plasmodium falciparum of Plasmodium vivax dragen. De methode is geschikt voor onderzoek naar de overdracht van malaria, inclusief vectoronderzoeken.

Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.

Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie

Talrijke nieuwe virusachtige sequenties zijn gevonden in muggen als gevolg van het uitgebreide gebruik van sequencing-technologieën. We bieden een effectieve procedure voor het isoleren en versterken van virussen met behulp van gewervelde en muggencellijnen, die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies naar muggengerelateerde virussen, waaronder door muggen overgedragen en muggenspecifieke virussen.

Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen

Het huidige protocol beschrijft de verspreiding van het Zika-virus (ZIKV) in niercellen van Vero Afrikaanse groene apen en de kwantificering van ZIKV met behulp van celgebaseerde colorimetrische immunodetectiemethoden in formaten met 24 wells en 96 wells (hoge doorvoer).

Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering

Leer het screenen van veldverzamelde muggen op virale infecties met behulp van een Vero-celkweekassay. Deze methode detecteert diverse virussen uit verschillende taxonomische families en verbetert het begrip van virale ecologie in muggenpopulaties.

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Meer video's verkennen