Fluorescerende Nanodeeltjes voor het meten van Ion Concentratie in Biological Systems

Het algemene doel van het volgende experiment is het vervaardigen van natriumnanosensoren voor in vitro en in vivo toepassingen. Dit wordt bereikt door het bereiden van een opto-mengsel dat de sensorcomponenten voor de nanosensoren bevat. In een tweede stap wordt een surfactant in een waterige oplossing gesoneerd om deze gelijkmatig te verspreiden, wat de vorming van nanosensoren mogelijk maakt wanneer de opto wordt toegevoegd.

Vervolgens wordt het opto-mengsel onder sonicatie toegevoegd aan het waterige surfactant-mengsel om de nanosensoren in oplossing te vormen. Deze video demonstreert dat de respons van de sensor instelbaar is. De sensoren kunnen via micro-injectie in hartspiercellen worden gebracht en kunnen daarnaast ook subcutaan in muizen worden geïnjecteerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals fluorescerende indicatorstoffen, is dat we de sensoren kunnen afstemmen op een dynamisch bereik dat overeenkomt met de fysiologische omgeving, een breder scala aan analyten kunnen meten en ratiometrische metingen kunnen uitvoeren voor kwantitatieve analyse. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het, zodra de sensoren zijn gemaakt, ontmoedigend kan lijken om ze in een biologische omgeving te introduceren. Voorraden van droog natriumion four x droog natrium TFPB en chromo four drie moeten voorafgaand aan het maken van de opto worden bereid volgens het beschreven protocol.

Combineer alle materialen in een zuurkast in een glazen vial van 1,5 milliliter. Sluit de vial met een met Teflon gecoate schroefdop en vortex deze voorzichtig totdat alle PVC is opgelost. De oplossing moet er rood uitzien.

Begin met het maken van de nanosensoren door 100 µL van 10 mg/mL PEG-lipide toe te voegen aan een glazen flacon van 4 g. Voeg vervolgens 4 mL van de gewenste waterige oplossing toe, zoals 10 mM HEPES.

Zink een sonicatie-tip zeven millimeter in het vial met behulp van een laboratoriumkrik en pas een laag sonicatievermogen toe gedurende 30 seconden. Combineer in een 0,6 milliliter buis 50 µL van het opto-materiaal en 50 µL dichloormethaan met een pipet om een gelijkmatige menging te garanderen. Start vervolgens een sonicatie van drie minuten.

Voeg bij het begin van de sonicatie 100 µL van het opto-mengsel toe door de pipetpunt onder te dompelen en het volledige volume in één snelle, gelijkmatige injectie toe te voegen. De oplossing kleurt blauw als de pH boven de zeven stijgt en wanneer er geen natrium aanwezig is om het residuele THF en dichloormethaan uit de oplossing te verwijderen. Verplaats de sonicatietip naar een diepte van 2 mm.

Gedurende de resterende drie minuten zal de oplossing troebel worden. Zodra de sonicatie is voltooid, zuigt u de nanosensoroplossing op in een spuit van vijf milliliter. Bevestig een filter en breng de nanosensoroplossing over in een glazen vial met een schroefdop.

Begin met het maken van 10 oplossingen met een progressief toenemende natriumconcentratie, waartegen de gevoeligheid van de nanosensor kan worden gemeten. Combineer natriumvoorraadoplossingen van nul molair en één molair in conische buizen van 50 milliliter. Voeg vervolgens in een 96-wellplaat met optische bodem 100 microliters van elke natriumconcentratie toe aan drie wells in een kolom.

Voeg vervolgens 100 µL vers bereide nanosensoren toe aan elke put, plaats de plaat in een microplaat-fluorimeter en voer de excitatie-, emissie- en cutoff-golflengten in die ideaal zijn voor het gebruikte chromofoor. De keuze van de gemeten golflengten is afhankelijk van de toepassing. Deze golflengten maken metingen van snelle intracellulaire dynamiek of ruisonderdrukking mogelijk.

Om de alfawaarden te bepalen, wordt de verhouding van de intensiteit bij 570 nanometer gedeeld door de intensiteit bij 670 nanometer of 680 nanometer. Zet de alfawaarden uit tegen de logaritme van de natriumconcentratie. Stel de logaritme van een natriumconcentratie van nul in op min één.

Pas nu een sigmoïdale curve aan op de respons en bereken op basis van deze curve de natriumconcentratie waarbij de alfa-waarde 0,5 is. Dit vertegenwoordigt de natriumconcentratie waarbij de sensor optimaal reageert. Gebruik deze informatie om de verhouding tussen natrium iono four x natrium TFPB en chromo iono four three in de opto aan te passen, om nanosensoren te creëren met de optimale natriumconcentratie.

Bijvoorbeeld, responscurves van vijf verschillende nanosensorsets die verschillende opto-formuleringen vertegenwoordigen, waarbij alleen de hoeveelheid natrium van vier 10 varieert. Voor intracellulaire beeldvorming vervangt u het celmedium door een helder medium zoals een Tyro-oplossing en brengt u de cellen over naar een beeldvormingskamer. Vul nu een uitgetrokken glazen pipet vanaf de achterzijde met nanosensoroplossing gemaakt in 5 mg/mL glucose in water.

Bevestig vervolgens de pipet aan een micromanipulator en sluit deze aan op een drukgestuurd injectiesysteem. Laat de pipet zakken tot op de cel en breng deze in het cytoplasma. Soms is het nodig om tegen de houder van de manipulator te tikken om het membraan te doorboren.

Injecteer enkele honderden picoliters van de nanosensoroplossing en trek de pipet snel terug. Anestheseer een CD1-naakte muis met isofluoraan met behulp van een anesthesiekamer. Plaats de muis na de anesthesie in een gedesinfecteerde beeldvormingskamer.

Vul vervolgens een steriele insulinespuit met een naaldmaat van 31 gauge met 10 µL nanosensoren met de juiste KD in 10 mM PBS. Zorg ervoor dat alle luchtbellen met een pincet worden verwijderd. Pak een kleine huidplooi op de rug van de muis vast ter hoogte van de gewenste injectieplaats.

Steek de spuit in de huid met de schuine zijde van de naald naar boven en de naald parallel aan de huid. Trek vervolgens aan de zuiger van de spuit om er zeker van te zijn dat de naald niet in een bloedvat is geplaatst. Om de tegendruk te minimaliseren, wordt de naald voorzichtig naar rechts en links bewogen om een holte in de huid te creëren.

Injecteer vervolgens de sensoren en verwijder de spuit voorzichtig. Oefen zachtjes druk uit op de injectieplaats en veeg eventuele oplossing die uit de injectieplaats is gelekt weg. Meestal worden zes gelijkmatig verdeelde injecties langs de rug toegediend.

Vervang de naald bij het uitvoeren van de procedure op verschillende muizen om ziekteoverdracht en kruisbesmetting te minimaliseren. Leg na de injecties brightfield- en fluorescentiebeelden vast met filtersets die nauw aansluiten bij het excitatie-emissiespectrum van de nanosensoren. Dit minimaliseert tevens de autofluorescentie van de huid.

Deze neonatale hartmyocyten werden gekweekt op een dekglas en geïnjecteerd met natriumnanosensoren. Deze fluorescentieafbeelding is genomen bij een excitatiegolflengte van 639 nanometer. Dit is een brightfield-afbeelding van dezelfde cellen, en dit is een overlay van de twee.

Er treedt enige clustering van sensoren op, maar de cellen vertonen een normale morfologie. Sensoren zijn diffunderen door het cytosol en er is geen nucleaire lokalisatie. Deze overlay van een brightfield- en fluorescentiebeeld toont negen verschillende subcutane injecties van natriumnanosensoren in de subcutane ruimte van een naakte muis.

Zodra de fabricage van nanosensoren eenmaal beheerst is, kan dit in enkele minuten worden voltooid mits correct uitgevoerd, en kan het worden toegepast in elk onderzoek om omkeerbare real-time analyte-flux te meten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe nanosensoren in de intracellulaire of subcutane ruimte kunnen worden geladen voor kwantitatieve metingen in een biologische omgeving.