Shape Memory Polymeren voor actieve cel Cultuur

Het algemene doel van deze procedure is om cellen te kweken op een substraat met een topografie die in de loop van de tijd verandert. Dit wordt bereikt door een vormgeheugenpolymeer eerst te programmeren in een permanente vorm die kan worden onthouden. Het vormgeheugenpolymeer wordt vervolgens geprogrammeerd in een tijdelijke vorm waarop de cellen later worden gezaaid.

De laatste stap van de procedure is het triggeren van het vormgeheugenpolymeer om terug te keren naar zijn permanente vorm door de temperatuur te verhogen, waardoor uiteindelijk resultaten kunnen worden verkregen die een verandering in het celgedrag laten zien via fluorescentiemicroscopie. Hallo, mijn naam is Pat Mather. Ik ben professor biomedische en chemische techniek en directeur van het Syracuse Biomaterials Institute hier aan de Syracuse University.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van commerciële of op maat gemaakte apparatuur voor het rekken van cellen is dat we in één enkel polymeer systeem in staat zijn om een grote verscheidenheid aan complexe rekken op cellen toe te passen. Mijn naam is Jay Henderson. Ik ben assistent-professor Biomedische en Chemische Techniek en lid van het Syracuse Biomaterials Institute.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de mechanobiologie, zoals de vraag hoe cellen reageren op dynamische veranderingen in hun fysieke omgeving. Mijn naam is Kevin Davis en ik ben een promovendus aan de Syracuse University in de afdeling Biomedical Engineering and Chemical Engineering. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in 2D mechanische biologie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals vormveranderende 3D-steigers voor tissue engineering.

Bereid vóór aanvang van deze procedure een op maat gemaakte uithardingskamer voor met behulp van een glazen objectglas, een Teflon-afstandhouder van één millimeter dik en een aluminiumplaat. Zet de kamer vast met kleine klemmetjes en injecteer vervolgens NOA 63 in de kamer via een gaatje in de Teflon-afstandhouder met een 18 gauge naald. Plaats de kamer daarna op een warmteplaat die is ingesteld op 125 °C.

Laat de kamer na het verwarmen vijf minuten lang opwarmen tot een uniforme temperatuur. Hard het NOA 63 gedurende 20 minuten uit door een UV-lamp op 6,5 centimeter van het glasoppervlak te plaatsen. Verwijder het NOA 63 met een scheermesje uit de kamer terwijl het nog warm is.

Hard het vormgeheugenpolymeer vervolgens na onder UV-licht gedurende drie uur en 40 minuten, direct op de warmteplaat bij 125 °C. Om het vormgeheugen van NOA 63 te karakteriseren, wordt een haltervormig proefstuk geprepareerd door de uitgeharde film warm te persen met een aangepaste pons. Plaats tot slot het proefstuk in een dynamische mechanische analyse-apparatuur met een trekarmbevestiging.

Stel het instrument in op de krachtgestuurde modus en programmeer de testprocedure zoals beschreven in het schriftelijke protocol dat bij deze video is gevoegd. Het resultaat van de procedure is een isothermisch uitgehard vormgeheugenpolymeer of een SMP-film. Plaats de SMP-film op een warmteplaat en stel de temperatuur in op een waarde boven de glasovergangstemperatuur om de modulus te verlagen en het snijden te vergemakkelijken. Bereid individuele monsters uit de isothermisch uitgeharde SMP-film.

Snijd de s- en p-film met een scheermes op de gewenste monstergrootte. De tijdelijke vorm kan op verschillende manieren worden vastgelegd. Hier wordt een hydraulische tafelpers met platen die kunnen worden verwarmd en gekoeld gebruikt om een tijdelijke topografie te embossen.

Stel eerst de temperatuur van de PLA's in op een temperatuur boven de tg. Voor deze demonstratie is een embosser gemaakt door epoxy uit te harden op een vinylplaat om een tijdelijke vorm van parallelle groeven te creëren. De embosser kan van andere materialen en met verschillende topografieën worden gemaakt, maar moet stijver zijn dan de NOA 63.

Plaats bij de pregekstempeltemperatuur de s- en p-monsters met de voorkant naar beneden op de pregekstempel. Plaats vervolgens de monsters en de pregekstempel in de pers. Breng ongeveer 100 kilopascal voorbelasting aan om contact te maken tussen de verwarmde PLA's en de monsters en houd dit ongeveer vijf minuten aan om de monsters een uniforme temperatuur te laten bereiken.

Zodra een uniforme temperatuur is bereikt, wordt er een druk van één tot zes megapascal op de monsters uitgeoefend, die gedurende één minuut wordt vastgehouden. Het SMP zal fractureren. Indien er een hogere spanning wordt toegepast.

Pas kleinere spanningen toe om topografieën met kleinere amplitudes te introduceren. Nadat de druk is aangebracht, wordt de temperatuur tot onder de TG verlaagd door gebruik te maken van de waterkoelingsfunctie van de persplaten. Wanneer de temperatuur onder de tg ligt, wordt de aangebrachte kracht verwijderd voordat het actieve celkulturexperiment wordt gestart.

Het UV-licht van de biologische veiligheidskast wordt gebruikt om de monsters te steriliseren. Plaats de monsters met de voorkant naar beneden in steriele schalen zonder deksels en schakel het UV-licht zes uur lang in. Draai de monsters vervolgens om en plaats ze met de voorkant naar boven in nieuwe steriele schalen.

Zet het UV-licht nog zes uur extra aan. De monsters moeten worden geëquilibreerd naar een relatief stabiele toestand voordat ze met cellen worden geplaat. Plaats de monsters in een 96-wellplaat en voeg 150 microliters compleet groeimedium toe.

Medium per well. Plaats de plaat in een incubator van 30 graden Celsius met 5%CO2 tot het gewenste gedeeltelijke herstel is bereikt. Voor deze demonstratie worden de monsters 30 uur geïncubeerd om een voldoende grote amplitude te genereren om de cellen uit te lijnen.

Zodra gedeeltelijk herstel is bereikt, kunnen de monsters met cellen worden geplaatst. Plaats de monsters in een nieuwe 96-wells plaat. Voeg vervolgens 150 microliters celoplossing toe aan elk van de monsters hier, C3 H 10 t en een half.

De meeste embryonale fibroblasten worden gebruikt in een concentratie van 20.000 cellen per milliliter. Om geïsoleerde cellen te verkrijgen, laat men de cellen hechten en uitspreiden op de tijdelijke topografie door deze gedurende 9,5 uur te incuberen bij 30 °C. Analyseer vervolgens de celmorfologie vóór de transitie door monsters te nemen en deze te kleuren en te visualiseren middels fluorescentie-imaging.

Dit materiaal vertoont autofluorescentie gedurende het grootste deel van het UV- en zichtbare bereik; fluoroforen in het verre rode uiteinde van het spectrum, zoals Alexa Fluor 647, worden aanbevolen om de achtergrond te verminderen. Om de monsters te laten herstellen, wordt de plaat in een incubator van 37 °C geplaatst en wordt de cultuur gedurende 19 uur voortgezet. Dit stelt het materiaal in staat om te herstellen en de cellen om hun morfologie aan te passen aan de nieuwe topografie. Na incubatie worden de passende kleurstoffen aangebracht, zoals phalloidine voor beeldvorming van filamenteus actine.

Als laatste stap kunnen de cellen worden afgebeeld op de nieuwe topografie; hier wordt het bulk-éénrichtinggeheugen van een enkele uitgeharde NOA 63 getoond. Drie keer herhaald, waarbij het asterisk het begin van de experimentele uitharding aangeeft. NOA 63 is een transparante, glasachtige vaste stof met uitstekende vormgeheugeneigenschappen.

In dit geval was het materiaal uitgehard en vertoont het een uniforme TG van 51.1 °C, bepaald op basis van het begin van de daling van de opslagmodulus. De hier waargenomen afname in rek vindt plaats bij de gemeten tg. Een groot percentage van de aangebrachte rek van 4.7% bleef gefixeerd na ontlasting bij 20 °C, wat overeenkomt met een fixatieratio van 89.3%. De gefixeerde rek werd vervolgens hersteld met een ratio van 84.4% binnen een relatief klein temperatuurbereik tijdens het verwarmen.

De vormgeheugenprestaties vertoonden geen verslechtering tot drie cycli, zoals blijkt uit het feit dat alle curven vrijwel exact hetzelfde pad volgden. De amplitude van de tijdelijke topografie neemt in de loop van 30 uur bij 30 graden Celsius af. Bij 30 graden Celsius.

De amplitude is met ongeveer 50% verminderd, zoals hier aangegeven op tijdstip nul. In de volgende 9,5 uur neemt deze met nog eens 10% af. Wanneer herstel wordt geïnduceerd door de temperatuur te verhogen naar 37 °C, neemt de amplitude binnen 9,5 uur af tot 0,5% van de initiële amplitude voor de gebruikte embosser en een embossing-spanning van 4,9 MPa.

Dit komt overeen met een functionele overgang van groeven van 13 micrometer naar een nagenoeg vlak oppervlak. Dit polymeer herstelt zich in het temperatuurbereik van 30 tot 37 graden onder celkweekcondities. Dit is te danken aan waterabsorptie uit het kweekmedium; het water plastificeert het polymeer, wat de tg verlaagt, waardoor herstel mogelijk is bij temperaturen onder de droge TG van 51 graden.

Een voorbeeld van celgedrag dat wordt gestuurd door het gebruik van actieve celcultuursubstraten is een verandering in de organisatie van het cytoskelet op tijdelijk gegroefde substraten. Voordat het herstel wordt geactiveerd, richten de actinemicrofilamenten zich uit langs de richting van de groeven. Na herstel door een temperatuurstijging zijn de microfilamenten gereorganiseerd en willekeurig georiënteerd.

Omgekeerd reorganiseren controlemonsters met statische, vlakke of statische groeven niet na een temperatuurstijging. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de geometrie van de uithardingskamer, de transitietemperatuur van het polymeer, de methode van rekfixatie en de samenstelling van het polymeer zelf allemaal kunnen worden aangepast om de gewenste transitie in uw eigen experiment te bereiken na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals real-time PCR, kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de genexpressie verandert als reactie op de mechanische stimulatie van het substraat na de ontwikkeling ervan.

Deze techniek maakte het voor onderzoekers in het veld van de celmechanobiologie mogelijk om het celcytoskelet, reorganisatie en de fysica van zachte materie in twee dimensies te onderzoeken. Bedankt voor uw interesse in ons werk en bedankt voor het kijken.