Name: Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer hoe u een kosteneffectieve cryogene microscoopstage bouwt voor correlative licht- en elektronenmicroscopie. Deze methode maakt betrouwbare beeldvorming van bevroren biologische monsters toegankelijk voor onderzoekslaboratoria.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Brandon J. Zipp en Ken B. Kaplan bedanken voor het verlenen van toegang tot de giststam die in deze studie. De auteurs danken ook Julio Lenin Dominguez-Ramirez voor hulp bij filmen. JEE erkent NIH kredieten verleent subsidie ​​nummer 5RC1GM91755.

1. Fabricage en assemblage <ol><li> Plaats het aluminium koellichaam in de 22,96 cm (9 ") pie pan ongeveer 2 cm van de zijkant van de pan, zoals weergegeven in figuur 1c Met behulp van een zwarte marker pen, markeer de gaten voor de aluminium koellichaam Let op:.. Als het aluminium blok (gekocht bij een lokale schroot winkel of online op <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) wordt niet geleverd met voorgeboorde gaten, moet u regelen dat hebben gaten geboord en vóór verzonken naar stap 1 om de aluminium beveiligen blok naar de taart pan. We gebruikten 5 gaten om het blok vast te zetten van het platform en 4 extra gaten om stikstof gasbellen om te ontsnappen uit onder het aluminium. </li><li> Plaats de cryo-grid box in de buurt van de locatie van het aluminium koellichaam en markeer de inkeping en elke kant. </li><li> Boor gaten voor elke gemarkeerde positie met behulp van een # 17 boor voor de aluminium koellichaam holes en een # 35 boor voor de cryo-grid box gaten. </li><li> Monteer de aluminium koellichaam met behulp van 5 - # 10, 1,9 cm (3 / 4 ") platte kop gleuf bouten en moeren bijbehorende evenals 15 - # 10 ringen Plaats twee ringen onder het aluminium blok en de derde op de achterzijde van de. pie pan voor elke hole. Opmerking: Ongedekte overhangen van het aluminium blok in de buurt van het zichtbare gebied kan leiden tot trillingen, die beeldvorming mogelijkheden van het podium te beperken Controleer of alle bevestigingsbouten goed vastgedraaid.. </li><li> Plaats 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 ") ronde sleuven bouten en bijbehorende moeren van de achterkant van de pie pan te treden als de cryo-grid box te monteren. </li><li> Tape 4 eetstokjes samen in paren met een eetstokje bovenop elkaar. Tape elk paar de tegenovergestelde randen van de taartvorm op te treden als afstandhouders. </li><li> Nat de boven-en onderkant van de cake en taart pannen met respectievelijk DDH 2 O. </li><li> Vul de taartvorm met twee lagen van isolerend schuim spuiten. Bevochtiging elke laag voordat u naar de volgende stap. </li><li> Druk op de taart pan in het schuim. </li><li> Flip de pannen ondersteboven en druk op de taart pan tot de afstandhouders contact op met de pie pan. Plaats geen gewogen object boven op de cake pan en laat zitten 's nachts te genezen. </li><li> Met een gekarteld mes, wegsnijden van de overtollige gedroogde isolerende sproeischuim van de rand van de pannen en verwijder de eetstokjes. </li><li> Haal de taartvorm uit de taart pan. De taart pan met aluminium koellichaam is nu geïsoleerd en wordt aangeduid als de "cryogene stage" (afb. 1a). </li><li> Plaats een doorzichtige plastic klembord (welke kleur en groter dan 3 mm dik) over de bovenkant van de cryogene podium. Markeer met een zwarte stift de locatie van de cryo-grid box monteren door het tekenen van een cirkel van ongeveer 1,5 maal de diameter van een enkele ronde cryo-grid box. Knip gat met een 1,9 cm (3 / 4 ") gatenzaag. Klembord Deze zal worden aangeduid als de" laadscherm "(afb. 1b). </li><li> Doe een nieuwe transparante klembord op de hoogte van de cryogene podium en plaats op de microscoop met het koellichaam direct onder de objectief lenzen. Met een zwarte stift, markeren het pad van de doelstellingen zoals ze draaien. </li><li> Snijd langs de gemarkeerde lijn het verwijderen van een halve cirkel van de rand van het klembord. Dit kan worden bereikt met een decoupeerzaag of met behulp van een 7,62 cm (3 ") gat zagen meerdere keren, zoals in de video. </li><li> Eindelijk gesneden een 1,9 cm (3 / 4 ") gat afstand van de halve cirkel, maar nog steeds binnen het gebied van de schotel. Dit zal de poort worden voor het bijvullen van vloeibare stikstof (lN 2) als daalt, terwijl beeldvorming. Klembord Dit zal worden verwezen als de "beeldscherm" (afb. 1c). </li></ol> 2. Monstervoorbereiding <ol><li> Verdunnen log-fase gistcellen gekweekt in synthetische complete (SC) media om een geschikte concentratie van 1x10 6 cellen / ml in water. </li><li> 2 ml van de verdunde gist worden gepipetteerd op een R2 / 1 400 mesh essen carbon beklede koperen cryo-EM grid (SPI Supplies, West Chester, PA) en laten adsorberen gedurende 15 seconden. </li><li> Blot overtollige vloeistof van de grid oppervlak door het aanraken van de achterkant van de grid op een afgescheurd stukje zachte cellulose weefsel (Kimwipe) gedurende 2 seconden. </li><li> Indien nodig, kan het net worden gewassen met 3 pi druppels water (1-3 keer), en de goddeloze weg als in stap 3 door blotting van de achterkant. </li><li> Voorafgaand aan de finale te wassen, wordt het monster geladen in de pneumatische duik vriezer en de opknoping rooster wordt gewassen zoals in stap 2.4. Na blotting het rooster met een gescheurde tissue papier (Kimwipe) de meerderheid van het water te verwijderen van het oppervlak, is het net ondergedompeld in lN twee gekoelde vloeibare ethaan en overgebracht naar een cryo-grid box voor opslag 1. Opmerking: het is belangrijk om Laat een laagje vloeistof zo dun mogelijk aan de oppervlakte te houden het monster gehydrateerd. Onjuiste blotting zal ofwel uitdrogen van het monster of laat ijs dat is ondoorzichtig voor de elektronenbundel. </li></ol> 3. Cryo-Light Microscopie <ol><li> Vul de cryogene podium metlN 2 en snel te bedekken met het laadscherm (plastic klembord met een 1,9 cm (3 / 4 ") gat). </li><li> Zodra de metalen bereikt lN 2 temperatuur, de overdracht van de cryo-grid box door middel van de 1,9 cm (3 / 4 ") gat van de laad-scherm en in de overdracht berg die door de 3 schroeven in deel A5. Draai de cryo-grid box uit de houder en verwijder de houder voor een betere toegang. Houd de cryo-grid box houder onder lN 2 in een aparte Dewar tot stap 3.10. De cryo-grid box moet ook worden gehouden lN 2 tot en met monster raster opwarming te voorkomen. </li><li> . Vullen lN 2 in de cryogene podium tot net onder de top van het aluminium koellichaam Opmerking: lN twee niveaus moeten periodiek worden gecontroleerd en opnieuw gevuld tijdens het beeldvormingsproces om ervoor te zorgen lN 2 is voortdurend in contact met het koellichaam. In het algemeen, het bijvullen gebeurt elke 10 minuten via de haven in te vullen het beeldscherm. </li><li> Pre-cool de pincet tip in lN 2, vervolgens over je rooster (s) op de vlakke bekijken oppervlak van het aluminium koellichaam met een pincet, het gebruik van de 1,9 cm (3 / 4 ") opening van het laadscherm. </li><li> Voorzichtig gaan de cryo-podium om onder de doelstelling van de gereflecteerde licht microscoop openingen. </li><li> Plaats het transparante beeldscherm boven het laadscherm. Dan langzaam Verwijder de laad scherm door te schuiven onder het beeldscherm. NB: Op dit punt, het monster is het meest kwetsbaar. Alle lucht stromingen rond de microscoop moet worden geminimaliseerd, zoals: ademhaling, een nabijgelegen deuropening, mensen lopen voorbij, etc. We raden het dragen van een gezichtsmasker of ophangen van een transparant gelaatsscherm onder de microscoop oculairs als een voorzorgsmaatregel. </li><li> Draai het objectief lenzen in de koude stikstof gas omgeving van de cryo-podium en scan voor het monster op de platte koellichaam gezichtsveld. Met behulp van standaard helder veld lichtmicroscopie technieken richten zich op de grid met een lage vergroting doelstelling om het centrum te vinden en een overzicht van foto te maken. Specificaties met betrekking tot het licht microscopie lenzen gebruikt voor dit experiment zijn opgenomen in de experimentele materialen sectie. Opmerking: LN 2 komt niet in contact met de objectief lenzen en we hebben nog een achteruitgang van afbeeldingen of schade aan de lenzen zien van het effect van koeling . </li><li> Focus in een hoge vergrotingsfactor op een gebied van belang en het verwerven van gegevens met helderveld, donkere veld, gepolariseerd licht of fluorescentie beeldvorming. Zorg ervoor dat de ligging van het gebied van de rente record op de lage vergroting helder veld de afbeelding voor een toekomst correlatie. Als alle bovenstaande voorzorgsmaatregelen vermeld voor het vullen van de lN 2 worden gevolgd, dan is de positieve druk van de verdampende stikstof is voldoende om een besmetting vrije omgeving (onafhankelijk van de vochtigheid in de ruimte) te behouden voor de duur van beeldvorming. </li><li> Zodra u klaar bent, vervang de laad scherm door te schuiven over de bovenkant van het beeldscherm. Verwijder het beeldscherm door het vertragen van te schuiven onder het laadscherm. </li><li> Haal de cryo etappe van de microscoop en met pre-gekoelde pincet, transfer terug het raster om de cryo-net box. Schroef de cryo-grid box houder in cryo-grid box voor afdichting tegen de omgeving en de houder over te dragen aan een LN2 Dewar voor opslag en de toekomst beeldvorming. </li></ol> 4. Cryo-elektronenmicroscopie <ol><li> Volgende standaard en gevestigde technieken, belasting van het monster rooster in een cryo-EM overdracht houder terwijl het monster temperatuur van vloeibare stikstof te allen tijde. </li><li> Steek de cryo-houder met het monster rooster in een Transmission Electron Microscope. </li><li> In een geschikte lage vergroting te bekijken (50-500x nominale vergroting), ligt het centrum van het monster net. </li><li> Gebruik maken van de eerder verzamelde lage vergroting cryo-LM gegevens van stap 3.7 om de relatieve oriëntatie van het centrum van het net van de koper tabs (zoals beschreven in figuur 2) te bepalen en de exacte gebieden die van belang zijn voor correlatie te identificeren. </li><li> Ga verder met microscoop alignment, een lage dosis cryo-EM beeldvorming en het verzamelen van gegevens. </li></ol> 5. Representatieve resultaten De cryogene stadium (figuur 1a) is een effectieve manier om cryo-LM gegevens voor cryo-fluorescentie microscopie en correlatieve cryo-LM/cryo-EM analyse te verzamelen. Figuur 2 laat zien hoe de combinatie van lage en hoge vergroting cryo-LM beelden kun je bouwen referentie kaarten die u naar specifieke gebieden in de cryo-EM. De resulterende cryo-LM referentie-kaart (figuur 2b) werd gebruikt tijdens de cryo-EM data-acquisitie om de exacte regio's weergegeven in figuur 3 te vinden. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Cryogene Stage. A) De lay-out van de cryogene etappe bestaat uit een cryo-grid box overdracht monteren aangegeven wet een witte pijl en een aluminium koellichaam. Grids worden overgedragen in het kader lN 2 van de cryo-grid box en die direct op het bekijken van het koellichaam van de ruimte, zoals aangegeven door de zwarte pijl. B) Image beeltenis van de cryogene podium met het laden van het scherm. Het gat in het laad scherm is direct geplaatst over de cryo-grid box monteren en fungeert als een poort om monsters overdracht en voor het verplaatsen van monsters uit de cryo-grid box om de sample weergavegebied op het koellichaam met een pincet. C) De cryogene fase in positie onder de objectieven met het beeldscherm op zijn plaats. De speciale uitsparing aan het beeldscherm kan de objectief lenzen om gemakkelijk in de juiste positie swing, zonder het verplaatsen van de cryogene podium. Het gat in het beeldscherm uit de buurt van het monster gebied fungeert als een lN 2 vulpoort tot lN twee niveaus te vullen indien nodig. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Navigeren in de cryo-LM voor correlatieve studies. A) lage vergroting cryo-LM uitzicht op gistcellen gehandeld op grond van een steekproef net. B) Dezelfde afbeelding in (a) bedekt met een hoge vergroting fluorescentie beeld van een gebied van belang en met een gevulde oranje markering van de veelhoek midden van het monster net. Het centrum bestaat uit een groep van vier vierkanten, drie met een extra metalen lipje en de vierde open. Voor de drie pleinen met een extra metalen lipje, twee paar delen op het tabblad over de lange en de korte bijlen vormen een asymmetrisch centrum. Deze asymmetrische centrum is te zien in de linker bovenhoek en werd gebruikt om de rotatiehoek en de handigheid van het raster tussen de cryo-LM en cryo-EM te geven. Van een lage vergroting imago vele gebieden van belang kunnen worden gemarkeerd en worden gebruikt als referentie kaart om identieke gebieden vinden in cryo-EM. C) Een vergroot fluorescentie cryo-LM beeld van het gebied van interesse in (b). HTA1-GVB, een c-terminal GVB histon marker, kan gezien worden als een groen gestippelde structuur het labelen van de locatie van de kern. D) Een cryo-EM beeld van het overeenkomstige gebied in (c). Schaal balken geven 50 micron. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Correlatie van cryo-LM en cryo-EM. Twee gezichtsveld afbeeldingen van identieke gistcellen gecorreleerd met de cryo-helderveld (a, d), cryo-fluorescentie (b, e), en de cryo-EM (c, f ). Schaal balken geven 5 micron.

<ol><li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li>
<li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%3A+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li>
<li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

<p class="jove_content"&gt; Met behulp van onze cryogene podium en monstervoorbereiding technieken, correlatieve studies tussen de cryo-LM en cryo-EM vertonen verschillende voordelen ten opzichte van traditionele kamertemperatuur benaderingen, inclusief maar niet beperkt tot: een snelle fixatie<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Minder fotobleken<sup&gt; 3</sup&gt;, En het scannen van het monster integriteit voorafgaand aan de cryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; Of chemische fixatie / embedding<sup&gt; 6</sup&gt;. Een van de knelpunten voor cryo-EM het verzamelen van gegevens is de tijd die nodig is voor zowel de overdracht van het monster in een TEM en scannen het raster om geschikte gebieden te vinden om beeld. Door de snelle data-acquisitie cryo-LM&#39;s<sup&gt; 5</sup&gt;, Kan de tijd besteed aan het vinden van goede cellen sterk worden verminderd. Zo kunnen we besparen tijd en geld en het inperken van dit knelpunt door de pre-scan en in kaart brengen gebieden van belang in de cryo-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Meer dure of complexe cryogene trappen mogen toestaan ​​dat een hogere resolutie cryo-LM beeldvorming. Echter, het podium hier verzonnen is meer dan voldoende voor vele toepassingen. Als cryo-LM beeldvorming en sample raster transfers worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid, zoals beschreven in de tekst en video, kan volledig gratis imaging verontreiniging worden bereikt. Deze methode maakt het mogelijk directe correlatie van TL-en elektronenmicroscopie gegevens van dezelfde cel, organel of macromoleculaire complex verspreid op de koolstof-support of vervat in een dunne weefselsectie<sup&gt; 7</sup&gt;. Opgemerkt moet worden dat de waarde van deze cryogene stadium gaat verder dan cryo-LM/cryo-EM correlaat studies op het gebied van lichtmicroscopie als geheel. Dit cryogene fase is goed geschikt voor zowel delicate monsters en fluorofoor kleurstoffen / vlekken<sup&gt; 8</sup&gt;, Quantum Dots, of fluorescent gelabelde eiwitten<sup&gt; 9</sup&gt; Die kunnen worden instabiel bij kamertemperatuur chemische fixatie en inbedding met glutaaraldehyde en paraformaldehyde. Als gevolg daarvan, we hopen dat deze cryogene fase zal een grotere toegang tot diegenen die geïnteresseerd zijn in de cryo-LM, die eerder zijn afgeschrikt door de kosten en onvoldoende toegang te bieden.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Problemen met Cryo-Light Microscopie</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Voorbeeld Adsorptie:</em&gt; Verschillende monsters kunnen vertonen variabele adsorptie-eigenschappen van de koolstof te ondersteunen. Misschien vindt u het noodzakelijk om andere vormen van ondersteuning roosters zoals continue koolstof, koolstof-essen of formvar gecoate roosters voor sample steun te gebruiken. Bovendien, als het monster is bindend voor de koperen staven van het rooster en niet op de koolstof-oppervlak, kan het nodig zijn om de koolstof oppervlakte chemie aan te passen door het incuberen van het raster met een uitvloeier of door gloed ontladen alvorens te proeven toevoeging.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Stage stabiliteit:</em&gt; Als u vibratie merkt, is het waarschijnlijk te wijten aan het monster podium overladen met het gewicht in plaats van het borrelen van LN2. De toegevoegde gewicht van de cryogene stadium kan soms leiden tot laagfrequente trillingen te zenden aan de standaard 3-as verplaatsing microscoop podium, en een negatieve invloed hebben op beeldvorming via vervagen. Dit kan gemakkelijk worden gecorrigeerd door het ondersteunen van de microscoop reizen etappe van onderen met ofwel een instelbare mini-lift of een instelbare adapter met dual-schroef armen, zoals in de video. Beide verstelbare steunmechanismen interactie met een niet-beweegbaar deel van de reis-stadium en daarom nog steeds vergunningen X-en Y-as vertaling als nodig is voor de beeldvorming.</p

Tabel van specifieke reagentia en apparatuur: <table border="1"><tbody><tr><th> Naam </th><th> Vennootschap </th><th> Catalog # </th><th> Reacties </th><th> Kosten </th></tr><tr><td> 1 tot 22,86 cm (9 &quot;) pie pan met schuine rand </td><td> Good Cook </td><td></td><td> De plaatselijke supermarkt </td><td> 4,39 dollar </td></tr><tr><td> 1 tot 22,86 cm (9 &quot;) cake pan </td><td> Good Cook </td><td></td><td> De plaatselijke supermarkt </td><td> 4,93 dollar </td></tr><tr><td> 4 paar eetstokjes </td><td></td><td></td><td> De plaatselijke supermarkt </td><td> 0,50 dollar </td></tr><tr><td> 1 - Great Stuff sproeischuim </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> Lokale hardware store </td><td> 5,98 dollar </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm x1cm blok aluminium </td><td></td><td></td><td> Lokale hardware winkel of metalen schroothoop </td><td> 10,00 dollar </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1,91 cm (3 / 4 &quot;) platte kop gleuf bouten w / moeren </td><td></td><td></td><td> Lokale hardware store </td><td> 0,98 dollar </td></tr><tr><td> 3 - # 4 0,95 cm (3 / 8 &quot;) ronde sleuven bouten w / moeren </td><td></td><td></td><td> Lokale hardware store </td><td> 0,98 dollar </td></tr><tr><td> 15 - # 10 ringen </td><td></td><td></td><td> Lokale hardware store </td><td> 0,98 dollar </td></tr><tr><td> 2 - doorzichtige plastic klemborden </td><td></td><td></td><td> Lokale kantoor op te slaan </td><td> 6,84 dollar </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM raster box houder </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM raster box handling staaf </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 essen carbon film, 400-mesh koper cryo-EM ovenrooster </td><td> SPI Supplies </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Experimentele materialen <ol><li> Giststam: Hta1-GVB:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-GVB:: KanMX6 uit de Kaplan lab aan de UC Davis). </li><li> Cryo-Light Microscopie: Cryo-lichtmicroscopie beelden werden genomen op een Leica DM4000M weerspiegelt microscoop met een Leica DFC310 FX-CCD-camera. Bright Field, Dark Field en fluorescentie beelden werden verkregen met behulp van een HCX PL Fluotar 5x 0,15 NA lucht doelstelling, een HCX PL Fluotar 10x 0,30 NA lucht doelstelling, een PL Fluotar 50x 0,55 NA lucht doel of een NPLAN 100x 0,75 NA lucht doelstelling. Bright Field en Dark Field afbeeldingen gebruikt een 12V 100W lamp wolfraam als lichtbron. Voor fluorescentie, was een EL6000 UV-lamp bron gebruikt in combinatie met een Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 &amp; LP 580) Filter Cube. </li><li> Cryo-Transmissie Elektronen Microscopie: Cryo-EM beelden werden verkregen op een JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) werkend op 200 KeV gebruik te maken van een Gatan 626 cryo-transfer houder (Gatan, USA). Micrografen werden opgenomen tegen de nominale vergrotingen van 50, 200, 1.200 en 4.000 X op een 4096 x 4096 pixel Tietz CCD camera (TVIPS, Gauting, Duitsland). </li></ol>

low-cost cryo-light microscopie stage fabrication voor gecorreleerde light / electron microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

De koppeling van de cryo-lichtmicroscopie (cryo-LM) en cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) stelt een aantal voordelen voor het begrijpen van cellulaire dynamiek en ultrastructuur. Ten eerste kan cellen worden afgebeeld in een near-native omgeving voor beide technieken. Ten tweede, als gevolg van de verglazing proces worden monsters die door de snelle fysieke immobilisatie in plaats van langzame chemische fixatie. Ten derde, imaging van hetzelfde monster met beide cryo-LM en cryo-EM biedt correlatie van gegevens uit een enkele cel, in plaats van een vergelijking van de &#39;representatieve steekproeven &quot;. Hoewel deze voordelen zijn bekend uit eerdere studies, de wijdverbreide gebruik van correlatieve cryo-LM en cryo-EM blijft beperkt als gevolg van de kosten en complexiteit van het kopen of bouwen van een geschikte cryogene lichtmicroscopie podium. Hier laten we zien de montage en het gebruik van een goedkope cryogene stadium dat kan in ieder laboratorium worden vervaardigd voor minder dan $ 40 met onderdelen vinden op de lokale hardware en supermarkten. Deze cryo-LM podium is ontworpen voor gebruik met gereflecteerd licht microscopen die zijn uitgerust met lange werkafstand lucht doelstellingen. Voor de correlatieve cryo-LM en cryo-EM studies, passen we het gebruik van carbon gecoat standaard 3 mm cryo-EM grids als specimen ondersteunt. Na het adsorberen van het monster aan het net, zijn eerder vastgestelde protocollen voor vitrifying het monster en de overdracht / het hanteren van de rooster gevolgd om multi-techniek beeldvorming mogelijk te maken. Als gevolg daarvan, deze setup kan elke laboratorium met een gereflecteerd licht microscoop om toegang te hebben tot de directe correlatieve beeldvorming van bevroren gehydrateerd monsters.

Tonen we de fabricage van een low-cost cryogene trap is ontworpen om de meeste gereflecteerde licht microscopen te passen. Dit lab-built cryogene stage maakt een efficiënte en betrouwbare correlatieve beeldvorming tussen de cryo-licht-en cryo-elektronenmicroscopie.

Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

De koppeling van cryo-lichtmicroscopie (cryo-LM) en cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) biedt een aantal voordelen voor het begrijpen van cellulaire dynamiek ...

Hallo, ik ben David Carlson, promovendus in het laboratorium van James Evans in de Biochemie en Moleculaire Biologie aan de University of California Davis. In deze video laat ik u zien hoe u een eenvoudige en effectieve cryo-lichttafel bouwt voor correlatieve cryo-licht-elektronenmicroscopie. Een cryo-tafel bestaat uit een transparante kijkhouder, een uitsparing voor de objectieflenzen, een vloeibare stikstofdeksel, een warmteafvoer voor het bekijken van uw monster en een monsteroverdrachtshouder.De meeste gebruikte materialen zijn gekocht bij een lokale bouwmarkt en supermarkt. Deze bestaan uit een bakvorm van negen inch, een cakevorm van negen inch, vier paren eetstokjes, hard uitgehard spuitfoam, een aluminium blok van vier centimeter bij acht centimeter bij één centimeter voorzien van montagegaten voor nummer 10 bouten, vijf platkop sleutelbouten en moeren van nummer 10 en drie kwart inch, drie ronde sleutelbouten en moeren van nummer 4 en 3/8 inch, 15 ringen van nummer 10, twee transparante plastic klembordjes, water, en een cryo-EM grid-boxhouder en hanteerstab, die gekocht kunnen worden bij Ted Pella.Plaats de ovenschaal op de microscooptafel onder de objectieven. Plaats het aluminiumblok nabij de rand van de schaal en stel scherp op het oppervlak van het aluminium. Controleer of de objectieven vrij heen en weer kunnen bewegen over de rand van de ovenschaal.Indien dit niet het geval is, repositioneer dan het aluminiumblok en controleer opnieuw. Zodra de positie van het aluminiumblok is bepaald, markeer dan de positie van de bevestigingsbouten met een marker. Plaats de cryogriddoos naast het aluminiumblok en noteer met een marker de positie van de inkeping en elke zijde van de cryogriddoos, waarbij de indeling van de bouten op het oppervlak van de petrischaal wordt vastgelegd.Gebruik een scherpe schroef en een hamer om startgaatjes te slaan op elk van de gemarkeerde punten met boorbeitjes van maat 17. Boor de gaten uit voor de montage van het aluminiumblok. Rond elk gat af om de randen glad te maken.Boor vervolgens met een boor van maat 35 gaten en maak deze rond voor de montage van de cryogriddoos, het schoteltje. Voorbereid en geboord. Plaats nummer tien drie kwart inch platte kop sleufbouten in de gaten in het aluminium blok en plaats twee nummer 10 SAE ringen over elk van de aluminium blokken.Bevestigingsgaten op de petri-schaal. Monteer vervolgens het blok door elke bout eerst met de vingers aan te draaien en span ze daarna vast met een boormachine. Draai de petri-schaal om, plaats een ring van maat 10 op elke bout en zet deze vast met een moer.Gebruik een steeksleutel om er zeker van te zijn dat alle moeren stevig zijn vastgedraaid. Plaats vervolgens vanaf de achterkant van het ovenschaaltje bout nummer vier met ronde kop en sleufkop door de montagegaten van de cryogriddoos en zet deze vast met een moer aan de bovenkant van het ovenschaaltje.Nu de bovenkant van de cryo-stage voltooid is, demonstreren we hoe de cryo-gridbox overgebracht kan worden zonder gebruik van zowel het plastic klembord als vloeibare stikstof. Vervolgens starten we met de voorbereiding van de isolerende schuimalgiet. Begin met het vasttapen van de eetstokjes in bundels van twee.Plak vervolgens elk bundeltje eetstokkjes tegenover elkaar aan de rand van de cakevorm. Het doel van de eetstokkjes is om een uniforme dikte van de schuimisolatie te verkrijgen. Maak daarna de cakevorm en de bodem van de taartschaal nat met water.Begin met het aanbrengen van een enkele laag Great Stuff. Spuit het schuim over de gehele bodem van de bakvorm en besproei dit met water. Voeg een tweede laag Great Stuff-spuitschuim toe en besproei dit opnieuw met water.Druk het taartschaaltje gelijkmatig en stevig in de bakvorm. Keer de gecombineerde schalen om en plaats een zwaar gewicht bovenop de schalen. Laat het schuim gedurende de nacht uitharden.Zodra het schuim is uitgehard, gebruikt u een gekarteld mes om de schaal los te snijden en verwijdert u het overtollige schuim van de zijkanten van de schaal. Verwijder de eetstokjes die als afstandhouder dienden en scheid de taartschaal van de bakvorm. Het schuim moet aan de taartschaal blijven kleven.Plaats vervolgens de cryotabel onder de objectieflens en leg er een plastic klembord bovenop. Teken met een stift het pad na dat de objectieflenzen volgen wanneer ze heen en weer bewegen. Markeer met een X een punt buiten de halve cirkel, dicht bij de rand van de petrischaal.Markeer met het tweede klembord de locatie voor de bevestiging van de crowd grid box. Zaag het gat voor de crowd grid box uit met een gatenzaag van drie kwart inch en een boormachine, en druk dit af op het andere klembord. Zaag de X uit met een gatenzaag van drie kwart inch.Verwijder het halvronde gebied door meerdere keren te snijden met een gatenzaag van drie inch en een boormachine. De fabricage is nu voltooid. De materialen die nodig zijn voor de monstervoorbereiding omvatten een cryo-griddoos en handstokpincetten, een overdrachtblok voor de cryo-griddoos, een chemische wipe, een koepbeker, een vloeibare ethaanbeker, 400 mesh R 2.1 holy carbon EM-grids, een piepschuimdoos en een pneumatische plunge-freezer. Plaats de piepschuimdoos, de cryo-griddoos, het overdrachtblok, de koepbeker en de vloeibare ethaanbeker verticaal in vloeibare stikstof.Plaats vervolgens de cryogridsdoos in het overdrachtblok voor de cryogridsdoos. Houd met de pincet de EM-grid met de koolstofzijde naar boven. Breng twee µL celstuspensie van 2 × 10⁶ cellen per mL aan op de bovenkant van de grid.Plaats de pincet op de pneumatische plunjer en trek de vloeistof van het grid-oppervlak door een stukje gescheurd chem wipe tegen de achterzijde van het EM-grid te houden en dit in vloeibare ethaan-slurry te dompelen. Verplaats het grid snel van het vloeibare ethaan naar de vloeibare stikstof en plaats het in een cryo-gridbox. Om de cryo-stage te gebruiken, begin met het vullen van de schaal met vloeibare stikstof en dek deze af met een klembord.Nadat de cryogridbox door de opening in het plastic klembord is overgebracht, wordt er één grid uit de box gehaald en op het kijkoppervlak van het aluminiumblok geplaatst. Nadat de cryoplaats is in positie is gebracht op de microscoop, wordt het tweede klembord voorzichtig bovenop het eerste geplaatst. Schuif vervolgens het eerste klembord eruit.Plaats de objectieven en gebruik de microscoop zoals gebruikelijk. Begin met scannen bij een lage vergroting om het centrum van het rooster te vinden, dat wordt aangegeven door drie metalen lipjes. Stel hier scherp bij 50 x.U kunt een dunne laag vitreus ijs zien die het grid bedekt en overgaat in fluorescentie. U kunt de CFP-histonmarker zien, gelokaliseerd in de celkern. Vervolgens schakel ik over naar het 100x objectief en focus ik op individuele gistcellen.Om de cryopodium uit de microscoop te verwijderen, plaatst u het eerste klembord bovenop het tweede en schuift u het onderste klembord voorzichtig naar buiten. Verwijder de cryopodium uit de microscoop en plaats het raster terug in de cryorasterdoos met behulp van de uitsparing in het klembord. Schroef tot slot de hanteerstang van de cryorasterdoos in de cryorasterdoos en breng deze over naar vloeibare stikstof voor latere observatie.Bij elektronenmicroscopie is de stabiliteit van de objecttafel zeer belangrijk. In de microscopie stelden we vast dat het grootste deel van de beeldinstabiliteit in ons systeem wordt veroorzaakt door het extra gewicht van de cryotafel op de microscooptafel. In afwezigheid van vloeibare stikstof is er een aanzienlijke mate van instabiliteit waarneembaar wanneer er op het aluminiumblok wordt gefocust.Door ondersteuning aan de voorzijde van de microscopietafel toe te voegen, wordt de instabiliteit sterk verminderd. Hier toon ik een ondersteuningsstructuur bestaande uit een verstelbaar schroefmechanisme dat ik tussen de microscopietafel en de basis plaats. Het voordeel van extra ondersteuning is ook zichtbaar bij cryo-lichtmicroscopie, waaruit blijkt dat de instabiliteit wordt veroorzaakt door het toegevoegde gewicht en niet door de vloeibare stikstofbellen.Zoals u kunt zien, is deze cryo-lichttafel een goedkope en nuttige manier om fluorescentie-informatie van bevroren gehydrateerde cellen te verzamelen. Scannen in brightfield en darkfield stelt u in staat om gebieden met uniform ijs in kaart te brengen. Zodra we deze interessante gebieden hebben gelokaliseerd, kunnen we het fluorescentiekanaal gebruiken om onze fluorofoor te zien voor het markeren van eiwitten van belang, in dit geval een CFP-histonmarker.Nadat de beelden in cryo-fluorescentie zijn vastgelegd, kunnen de beelden met lage vergroting worden gebruikt om hetzelfde raster en vierkant in kaart te brengen en dezelfde cellen in cryo-elektronenmicroscopie af te beelden. Zoals u kunt zien, is dit cryo-lichtstation een nuttige en goedkope manier om fluorescentiebeelden van bevroren hydraatmonsters te verzamelen. Dezelfde regio kan ook worden waargenomen in cryo-EM door standaard cryo-EM-transfer- en beeldvormingstechnieken te volgen.In dit geval dienen de gegevens van de cryo-lichtmicroscopie als referentiekaart om de exacte regio voor de correlatieve studie te identificeren. Deze fase kan worden toegepast op de correlatieve beeldvorming van vele soorten monsters, waaronder hele cellen, in vitro reacties van macromoleculaire complexen, geïsoleerde organellen en dunne cryosneden van weefsel. Bedankt voor het kijken en ik hoop dat u deze cryo-lichtmicroscopiefase net zo nuttig vindt als wij.

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Lensfree optische tomografie een driedimensionale microscopie techniek die een ruimtelijke resolutie van &lt;1 um heeft x &lt;1 um x &lt;3 urn x, y en z afmetingen respectievelijk over een groot volume beeldvorming van 15-100...

Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Hier fabriceren we 3D polymere micro/nanostructuren waarbij zowel de vorm als de moleculaire uitlijning met nanometernauwkeurigheid kunnen worden ontworpen door gebruik te maken van direct laserschrijven. Lichtgeïnduceerde vervorming van verschillende typen vloeibare kristallijne elastomeer microstructuren kan op microscopische schaal worden bestuurd.

Free-form Light Actuators - Fabricage en Controle van de Aandrijving in microscopische schaal

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Chip-based superresolutie optische microscopie is een nieuwe benadering van fluorescentiemicroscopie en biedt voordelen in kosteneffectiviteit en doorvoer. Hier worden de protocollen voor chip voorbereiding en beeldvorming getoond voor TIRF microscopie en lokalisatie gebaseerde super-resolution microscopie.

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Dit protocol demonstreert hoe biologische cryo-geconserveerde monsters kunnen worden afgebeeld met behulp van cryo-gestructureerde verlichtingsmicroscopie. We demonstreren de methodologie door het cytoskelet van U2OS-cellen in beeld te brengen.

Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Het protocol beschrijft high-throughput sferoïde generatie voor bioprinting met behulp van de multi-parametrische analyse van hun oxygenatie en celdood op een standaard fluorescentiemicroscoop. Deze aanpak kan worden toegepast om de levensvatbaarheid van de sferoïden te controleren en standaardisatie uit te voeren, wat belangrijk is bij het modelleren van 3D-weefsel, tumormicro-omgeving en succesvolle (micro)weefselbiofabricage.

Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden

Er werd een multimodaal, snel hyperspectraal beeldvormingsraamwerk ontwikkeld om breedband vibrationele somfrequentiegeneratie (VSFG)-beelden te verkrijgen, samen met helderveld-, tweede harmonische generatie (SHG)-beeldvormingsmodaliteiten. Omdat de infraroodfrequentie resoneert met moleculaire trillingen, wordt microscopische structurele en mesoscopische morfologische kennis onthuld van symmetrie-toegestane monsters.

Multimodale niet-lineaire hyperspectrale chemische beeldvorming met behulp van lijnscanning Vibrationele somfrequentiegeneratiemicroscopie

Dit protocol beschrijft in detail hoe een fluorescentiemicroscoop met één objectief en lichtvel kan worden gebouwd en hoe deze kan worden gebruikt voor het visualiseren van cytoskeletnetwerken.

Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken

Deze workflow maakt lamellenproductie mogelijk die gericht is op fluorescerend gelabelde biologische structuren die klein (&lt;1 μm in axiale omvang) en zeldzaam (1 kopie per cel) zijn met behulp van een cryogeen tri-samenvallend beeldvormingsplatform. Dit platform integreert fluorescentiemicroscopie, gefocusseerd ionenbundelfrezen en scanning-elektronenmicroscopie op een enkele brandpuntspositie en maakt gelijktijdige fluorescentiemicroscopie tijdens het malen mogelijk.

Workflow met behulp van een cryogene samenvallende fluorescentie-, elektronen- en ionenbundelmicroscoop voor het gericht frezen van cellen

Leer hoe u een kosteneffectieve cryogene microscoopstage bouwt voor correlative licht- en elektronenmicroscopie. Deze methode maakt betrouwbare beeldvorming van bevroren biologische monsters toegankelijk voor onderzoekslaboratoria.

Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

Meer video's verkennen