Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy
28 augustus 2011
De stijfheid van de extracellulaire matrix van grote invloed op meerdere gedragingen van hechtende cellen. Matrix stijfheid varieert ruimtelijk overal een weefsel, en ondergaat wijzigingen in de verschillende aandoeningen. Hier hebben we methoden ontwikkelen om de ruimtelijke variatie in stijfheid in normale en fibrotische muis longweefsel met behulp van atomic force microscopie microindentation karakteriseren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om het lokale mechanische milieu van longparenchym op een ruimtelijke schaal die relevant is voor residente cellen te karakteriseren door direct de lokale elastische eigenschappen van vers spiegelend longweefsel te meten met behulp van atoomkrachtmicroscopie micro-indentatie. Dit wordt bereikt door het agarro geïnflateerd muislongweefsel met een scheermes of scalpelmes te snijden om longparenchymstroken van vijf bij vijf millimeter in lengte en breedte te bereiden, en 400 micrometer dik. Vervolgens worden niet-gefixeerde, niet-permeabele longweefselstroken geïmmunokleuring, die gebieden van belang identificeren voor een FM micro-indentatie.
Vervolgens wordt een FM micro-indentatie uitgevoerd op weefselstroken in PBS bij kamertemperatuur. Om de lokale elastische eigenschappen van het verse longweefsel direct te meten, worden resultaten verkregen. Die tonen opvallende verschillen in het bereik en de verdeling van weefselstijfheid in normaal en fibrotisch longparenchym en grote ruimtelijke variaties in stijfheid, met name binnen het fibrotische longmonster.
Op basis van stijfheidskaarten die zijn geëxtraheerd uit geforceerde verplaatsingscurven verkregen met behulp van een FM micro-indentatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande metingen zoals het strekken van weefselstroken is dat het een ongekende ruimtelijke resolutie biedt en een unieke kijk biedt op microschaalvariatie in weefselstijfheid. Deze maatregel kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen zoals hoe stijfheid ruimtelijk varieert binnen het weefsel en wat de omvang en de ruimtelijke schaal van de stijfheidsveranderingen in de ziekte zijn.
Processen die resulteren in weefselhermodellering Om stroken longweefsel voor te bereiden, begint met het stabiliseren van de longstructuur voor snijden door geïsoleerde muislongen te laten opzwellen. Intratracheeel met 50 milliliter per kilogram lichaamsgewicht warm, 2% laag gelpunt aros bereid in PBS, bind de luchtpijp af en koel de opgezette longen af in een bad van PBS bij vier graden Celsius gedurende 60 minuten. De aros zal gelen en verstijven in de luchtholten om de longstructuur zachtjes te stabiliseren. Gedurende deze periode snijdt u het door aros gestabiliseerde muislongweefsel met een scheermes of scalpel in stroken van ongeveer vijf bij vijf millimeter in lengte en breedte, en 400 micrometer dik.
Was vervolgens de stroken in PBS bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten om resterend aros te verwijderen om grote luchtwegen en bloedvaten uit te sluiten. Snijd stroken uit subpleurale gebieden ver van de hoofdstambronchi verwijderd als luchtwegen en grote bloedvaten moeten worden afgebeeld, snijd stroken uit longweefsel dichter bij de hoofdstambronchi om gebieden van belang te isoleren voor een FM micro-indentatie. Beeld het weefsel af met behulp van contrastmicroscopie of immunokleuring en visualiseer met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Zie het schriftelijke deel van dit protocol voor de procedure. Direct voorafgaand aan een FM karakterisering, bevestig de weefselstroken aan poly L lysine gecoate 15 millimeter dekglasjes door het dekglas van onder het zwevende weefsel omhoog te brengen, ervoor zorgen dat de weefselstrook gelijkmatig op het oppervlak van het dekglas verspreidt. Indien nodig, plak de strook met een tweede schone, ongecoate dekglas en breng lichte druk uit om het weefsel aan het poly L lysine gecoate dekglas te hechten.
Calibreer het AFM systeem volgens de instructies van de fabrikant direct voorafgaand aan elke ronde van micro-indentatie experimenten. Hiervoor bepaalt u twee kritieke parameters. De veerconstante van de cantilever met behulp van de thermische fluctuatiemethode in de lucht en de gevoeligheid van de cantileververvorming, een parameter die wordt gebruikt om het uitgangssignaal van de fotodiode te schalen naar de werkelijke afwijkingsafstand van de cantilever.
Calibreer de gevoeligheid van de vervorming door een standaard geforceerde verplaatsingscurve in PBS op een schone glazen plaat te verkrijgen. Bereken vervolgens de helling van de geforceerde verplaatsingscurve in de meting van de geforceerde verplaatsingscurve. De AFM tip wordt in één locatie naar en van het monsteroppervlak uitgestrekt met de afwijking van de cantilever delta D gemonitord als functie van tipverplaatsing delta Z. Het wordt aanbevolen om een siliciumnitride driehoekige cantilever met een vijf micrometer diameter bo silicaat bolvormige tip te gebruiken met behulp van FM sondes met een veerconstante van 0,06 newton's per meter.
We hebben mechanische materialen gekarakteriseerd met zuivere moduls die variëren van 100 tot 50.000 pascal. Veeg het onderste oppervlak van de monsterdekglas met tissuepapier, bevestig het vervolgens aan een standaard glazen plaat met vacuümvet. Monteer de glazen plaat op het AFM monsterplatform en bedek het weefsel met 500 microliter PBS op kamertemperatuur.
Plaats vervolgens de AFM scankop boven het monster. Pas de monsterplatform van de microscoop aan om de microscoop in te stellen voor oogglasbeelding om de AFM tip in het centrum van het gezichtsveld uit te lijnen. Verplaats de AFM monsterplatform om een gebied van belang op het weefsel te kiezen.
Schakel vervolgens over naar CCD-camerabeelding om fasecontrastafbeeldingen en/of fluorescentieafbeeldingen van het weefsel te registreren zoals gewenst. Beweeg de AFM tip langzaam naar beneden tot het nauwkeurig in contact is met het monster. AFM micro-indentatie karakterisering van zachte monsters vereist kleine indrukdiepten om grote lokale spanningen te voorkomen, die het hertz-model gebruikt voor berekening van elastische modulus ongeldig maken om grote spanningen te voorkomen, voer de indruk uit in de triggermodus door de maximale cantileverafwijking in te stellen op 500 nanometer.
Deze afwijkingslimiet zal de maximale indrukkracht beperken tot minder dan 30 nanonewton. De indruksnelheid moet zodanig worden gekozen dat deze langzaam genoeg is om elastische eerder dan visco-elastische eigenschappen van het zachte monster te onderzoeken. Selecteer een snelheidsbereik van twee tot 20 micrometer per seconde voor longweefsel voor een enkele meting van een gebied van belang.
Verplaats de AFM sonde naar de locatie van belang en voer een enkele indruk uit om een standaard krachtverplaatsings
Overzicht
Deze studie onderzoekt de ruimtelijke variaties in stijfheid van longweefsel, met name in normale en fibrotische omstandigheden, met behulp van atomaire krachtmicroscopie-micro-indentatie. De bevindingen onthullen significante verschillen in weefselstijfheid, wat implicaties kan hebben voor het begrijpen van ziekteprocessen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Weefselmechanica
Achtergrond
- De stijfheid van de extracellulaire matrix (ECM) beïnvloedt celgedrag.
- Matrixstijfheid varieert in verschillende weefsels en ziektetoestanden.
- Het begrijpen van stijfheidsvariaties kan inzicht geven in ziektemechanismen.
- Atomaire krachtmicroscopie biedt hoge resolutie metingen van weefseleigenschappen.
Doel van het onderzoek
- Om de lokale mechanische omgeving van longparenchym te karakteriseren.
- Om de elastische eigenschappen van vers longweefsel te meten.
- Om verschillen in stijfheid tussen normaal en fibrotisch longweefsel te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van longweefselstrips uit opgeblazen muizenlongen.
- Immunostaining om gebieden van belang te identificeren.
- Atomaire krachtmicroscopie-micro-indentatie om stijfheid te meten.
- Analyse van krachtverplaatsingscurven om stijfheidskaarten te maken.
Belangrijkste resultaten
- Er werden significante verschillen in stijfheid waargenomen tussen normaal en fibrotisch longweefsel.
- Er werden grote ruimtelijke variaties in stijfheid opgemerkt, vooral in fibrotische monsters.
- De micro-indentatietechniek bood ongekende ruimtelijke resolutie.
- Resultaten kunnen helpen bij het beantwoorden van vragen over weefselremodellering bij ziekte.
Conclusies
- De studie benadrukt het belang van ECM-stijfheid in longweefsel.
- Micro-indentatie is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van weefselmechanica.
- Het begrijpen van stijfheidsvariaties kan helpen bij het verduidelijken van ziektemechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding spatial heterogeneity in tissue stiffness is critical for de-risking target validation in pulmonary fibrosis and related lung diseases. Atomic force microscopy microindentation provides quantitative, high-resolution mechanical mapping that links extracellular matrix remodeling to cellular phenotypes. This enables mechanistic insight into disease progression and supports predictive modeling of therapeutic response in preclinical discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mechanotransduction pathways by correlating local stiffness with cellular phenotypes in disease-relevant lung tissue.
- Operational Value: Provides spatially resolved shear modulus data to distinguish fibrotic from normal parenchyma at cellular length scales.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by revealing how matrix deposition alters mechanical microenvironment in disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated stiffness maps that can serve as phenotypic readouts for compound screening in fibrosis models.
- Quantitative Output: Delivers shear modulus measurements in Pascals, enabling dose-response analysis of mechanomodulating agents.
- Reproducibility: Standardized microindentation protocols ensure consistent mechanical profiling across tissue sections and experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly measures stiffness variations in fibrotic lung, aligning with clinical hallmarks of extracellular matrix dysregulation.
- Mechanistic De-risking: Links biomechanical changes to pathological features, reducing uncertainty in target engagement and pathway modulation.
- Translational Continuity: Stiffness maps provide a quantifiable biomarker bridge between in vitro findings and in vivo disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical efficacy testing, where mechanical phenotyping informs lead selection and mechanism-of-action studies in lung fibrosis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how stromal stiffness influences epithelial and fibroblast activation in remodeling.
- Screening: Enables assay development for compounds targeting mechanosensitive pathways using stiffness as a functional endpoint.
- Analytics: Force displacement curves yield elastic modulus data that can be converted to shear modulus for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Spatial stiffness maps correlate with histopathological features, supporting biomarker qualification efforts.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other soft tissues, enabling cross-platform mechanical phenotyping in multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, spatially resolved measurements of tissue mechanical properties.
- Operational Value: Standardized AFM microindentation workflow ensures reproducibility and scalability for multi-user core facilities.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target-related biomechanical changes early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanomodulating therapies based on preclinical stiffness response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, cantilever calibration, and force curve analysis.
- Dependent on access to AFM systems with appropriate tips and vibration isolation for soft tissue measurements.
- Necessitates standardized tissue preparation protocols to ensure comparability across normal and disease models.
- Involves considerations for indentation depth and velocity to avoid viscoelastic confounds in soft samples.
- Limited by tissue viability window, requiring timely execution post-excision for accurate elastic property measurement.
