Name: Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing in katoen om genfunctie te bestuderen via RNA-silencing van GrCLA1. Deze methode toont snel albino-fenotypen voor functionele analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor Drs. SP-Dinesh Kumar en Yule Liu voor TRV-VIGS vectoren, en Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr en Bayer CropScience voor het leveren van katoenzaad. Dit werk werd gefinancierd door NSF te LS en NIH naar PH

1. Grow katoen zaailingen <ol><li> Zaai de zaden van de hoger gelegen katoen (Gossypium hirsutum) variëteit Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR en Deltapine 90 in pot (7 cm in diameter) met Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Bewaar de potten in een bak bedekt met een plastic koepel bij 23 ° C, 120 μE m -2 s -1 licht, met een 12 uur light/12 uur donker fotoperiode in een groei kamer. </li><li> Verwijder de koepel als twee zaadlobben naar voren zijn gekomen. </li><li> Ongeveer twee weken later, gebruik maken van de planten met twee volledig ontwikkelde zaadlobben voor VIGS test. In dit stadium zijn de echte bladeren nog niet naar voren (figuur 1). </li></ol> 2. Construct VIGS vector die GrCLA1 ​​gen <ol><li> Versterken de Cloroplastos alterados 1-gen van katoen (GrCLA1) door middel van PCR met primers GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'en GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' van een cDNA-bibliotheek van G. raimondii blad weefsels. </li><li> Digest de PCR-producten van GrCLA1 ​​met EcoRI en Kpnl en invoegen in pYL156 (pTRV-RNA2) vector door ligatie. </li><li> Het scherm van de klonen op LB agar platen met 50 ug / ml kanamycine. Controleer of de constructies door restrictie-enzym digestie en sequencing. </li><li> Transformeren de plasmide in Agrobacterium tumefaciens GV3101 door elektroporatie en herstellen in LB vloeibaar medium bij 28 ° C. Selecteer de transformanten op de platen met LB + Kanamycine (50 ug / ml) + Gentamycine (25 ug / ml). De bacteriën kunnen worden opgeslagen in 25% glycerol bij -80 ° C voor de lange termijn gebruik. </li></ol> 3. Uit te voeren VIGS inoculatie <ol><li> Drie dagen voor inoculatie, streep bevroren glycerol voorraden van Agrobacterium tumefaciens dragen pYL192 (TRV): RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (vector alleen) en pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​op LB agar platen met 50 ug / ml Kanamycine en 25 ug / ml gentamycine. Incubeer de platen bij 28 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Twee dagen voorafgaand aan de VIGS infiltratie, kies een kolonie voor elk construct van de bovengenoemde platen en inoculeren het in 5 ml LB-medium aangevuld met 50 ug / ml kanamycine en 25 ug / ml van Gentamycine; Grow de bacteriële cultuur bij 28 ° C voor overnachting in een roller trommel met een snelheid van 50 rpm. </li><li> Breng de bovenstaande cultuur een fles met 50 ml LB-medium aangevuld met 50 ug / ml kanamycine en 25 ug / ml gentamycine, plus 10 mM MES (2 - (4 morfolino)-ethaan sulfonzuur) en 20 urn acetosyringone. Groeien de cultuur bij 28 ° C voor de overnachting in een shaker met een snelheid van 50 rpm. </li><li> Op de volgende dagen, spin down van de agro-bacteriële cellen bij 4000 rpm gedurende 5 minuten, de cultuur opnieuw te schorten in de infiltratie buffer met 10 mM MgCl2, 10 mM MES en 200 uM acetosyringone. Pas de OD 600 van de cultuur tot 1,5. </li><li> Laat de cultuur op de bank bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. </li><li> Voorafgaand aan Agrobacterial infiltratie, punch de onderkant van de zaadlobben van katoen planten met een 25 G naald zonder piercing door de zaadlobben. Een of twee gaten (afhankelijk van de zachtheid van weefsel) zijn gestanst op elk onderdeel van de zaadlob (figuur 2). </li><li> Mix Agrobacterial cultuur opschorting van pYL192 (TRV): RNA1 en pYL156 (TRV): RNA2 of pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​in een 1:1 verhouding, de hand van het mengsel infiltreren van de onderkant van zaadlobben door de verwonding sites met een 1 mL naaldloze spuit (figuur 3). </li><li> Dek de planten met een plastic koepel en laat de geïnfiltreerd planten bij kamertemperatuur onder gedimd licht voorwaarde voor overnachting. </li><li> Overdracht planten om een groei kamer met de temperatuur van 23 ° C, 120 μE m -2 s -1 licht met een 12 uur licht / twaalf uur donker cyclus. </li></ol> Let op: VIGS werkt als planten uit hoofde van hetzij 23 ° C of in kassen (25-28 ° C). Wanneer de temperatuur relatief laag (23 tot 25 ° C), is het gemakkelijker voor de inenting en het fenotype is meer uniform in vergelijking met een hogere (28-30 ° C) of schommelde de temperatuur. Afdekken van de planten met een koepel maakt VIGS efficiënter. <ol start="10"><li> Onderzoek het zwijgen op te leggen fenotype op 7 ~ 8 dagen na de infiltratie. De echte bladeren van planten door zwijgen pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​begonnen met het albino fenotype (figuur 4) weer te geven. De planten geïnfiltreerd met agrobacteriën dragen pYL156 (TRV): RNA2 dienen als een controle. </li><li> Controleer of het gen silencing efficiëntie door het onderzoeken van de expressie van endogene genen met behulp van reverse transcriptie polymerase chain reaction (RT-PCR) met RNA geïsoleerd van controle en zwijgen katoen planten. </li></ol> Opmerking: De VIGS-ed planten moeten worden bewaard in een gesloten quarantaine voorwaarden en planten moeten goed worden geautoclaveerd en afgevoerd na de testen als TRV heeft een breed assortiment en gastheer is een pathogeen worden aangemeld. 4.Representatieve resultaten: Ongeveer twee weken na de hand-infiltratie met Agrobacterial mengsel, was de albino fenotype veroorzaakt door GrCLA1 ​​zwijgen duidelijk waargenomen op de echte bladeren. Het zwijgen efficiency bereikt bijna 100% in meerdere experimenten met meer dan 50 planten. Het zwijgen planten vertonen een gelijkmatig verdeelde en zeer sterke albino fenotype op nieuw te ontwikkelen bladeren met een mozaïek op de oudere bladeren (figuur 4). <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een katoenen zaailing op ongeveer twee weken oud podium met twee volledig ontwikkelde zaadlobben gebruikt voor Agrobacterial infiltratie. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Punching kleine gaatjes aan de onderkant van de zaadlobben van katoen planten met behulp van een 25 G naald Agrobacterial infiltratie te vergemakkelijken. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Hand infiltratie van Agrobacterial mengsel in de zaadlobben van katoen door de verwonding sites met een injectiespuit zonder naald <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Albino fenotype verscheen op VIGS zwijgen katoen planten. Vier cultivars worden weergegeven. A) Fibermax 832, B) Phytogen 480WR; C) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

VIGS is bewezen een krachtig instrument in functional genomics analyse worden door tijdelijk kloppen beneden de expressie van endogene genen. In deze studie hebben we een Agrobacterium-gemedieerde VIGS ontwikkeld door gebruik te maken van een TRV-op basis van binaire vector. De katoenen CLA1 (GrCLA1) gen werd ontwikkeld als een visuele marker om het zwijgen efficiëntie te monitoren. We hebben consequent verkregen 100% van gene silencing efficiëntie, blijkt uit het albino fenotype die op de echte bladeren in all...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van de reagentia en apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus / serienummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Roller drum </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bacterie cultuur </td></tr><tr><td> Couveuse </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bacterie cultuur </td></tr><tr><td> UV / Vis spectrofotometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> Model: DU530 </td><td> Het meten van OD </td></tr><tr><td> Gene Puiser </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652076; Serial: 154BR3880 </td><td> Elektroporatie </td></tr><tr><td> Pulser Controller </td><td> BioRad </td><td> Model: 1652098; Serial: 232BR4833 </td><td> Elektroporatie </td></tr><tr><td> Micropulser Elektroporatie kuvet </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Elektroporatie </td></tr><tr><td> 1 ml spuit </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> Enten van agro-bacterie </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Groeiende zaailing </td></tr><tr><td> Terra Cotta pot </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Groeiende zaailing </td></tr><tr><td> MES monohydraat </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Infiltratie buffer </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Infiltratie buffer </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing assay in cotton

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Katoen (Gossypium hirsutum) is een van de belangrijkste gewassen ter wereld. Aanzienlijke inspanningen geleverd op moleculaire veredeling van nieuwe rassen. De grootschalige gen functionele analyse in katoen is achtergebleven bij de meeste van de moderne plantensoorten, waarschijnlijk vanwege de grote omvang van het genoom, gen duplicatie en polyploïdie, lange groeicyclus en weerspannigheid aan genetische transformatie 1. Ter bevordering van high-throughput functionele genetische / genomische studie in katoen, proberen we een snelle en efficiënte voorbijgaande assays te ontwikkelen om katoen genfuncties te beoordelen. Virus-Induced gen silencing (VIGS) is een krachtige techniek die werd ontwikkeld op basis van de host Post-transcriptionele gene silencing (PTGS) van virale proliferatie 2,3 onderdrukken. Agrobacterium-gemedieerde VIGS is met succes toegepast in een breed scala van tweezaadlobbigen soorten zoals Solanaceae, Arabidopsis en peulvruchten soorten, en eenzaadlobbigen soorten, waaronder gerst, tarwe en maïs, voor de verschillende functionele genomische studies 3,4. Aangezien dit een snelle en efficiënte aanpak voorkomt plant transformatie en overwint functionele redundantie, is het bijzonder aantrekkelijk en geschikt voor functionele genomische studie bij de teelt van soorten, zoals katoen niet vatbaar voor transformatie. In deze studie hebben we het verslag van de gedetailleerd protocol van Agrobacterium-gemedieerde VIGS systeem in katoen. Onder de verschillende virale vectoren VIGS, de tabak rammelaar virus (TRV) binnenvalt een breed scala van hosts en is in staat om krachtig verspreid over de gehele plant nog te produceren milde symptomen op de hosts5. Om het zwijgen op te leggen efficiëntie, GrCLA1, een homoloog gen van Arabidopsis Cloroplastos alterados een gen (AtCLA1) in katoen, is gekloond en ingevoegd in de VIGS binaire vector pYL156. CLA1 gen is betrokken bij de ontwikkeling chloroplast 6, en eerdere studies hebben aangetoond dat de te controleren verlies-van-functie van de AtCLA1 resulteerde in een albino fenotype op echte bladeren 7, biedt een uitstekende visuele marker voor zwijgen efficiency. Op ongeveer twee weken na Agrobacterium infiltratie, de albino fenotype begonnen te verschijnen op de echte bladeren, met 100% silencing-efficiëntie in alle gerepliceerde experimenten. Het zwijgen van endogene genexpressie werd ook bevestigd door de RT-PCR-analyse. Aanzienlijk, kon zwijgen krachtig optreden in alle cultivars die we hebben getest, waaronder verschillende commercieel geteelde rassen in Texas. Deze snelle en efficiënte Agrobacterium-gemedieerde VIGS test levert een zeer krachtige tool voor het snel op grote schaal analyse van gen-functies op genoom-brede niveau in katoen.

We presenteren de gedetailleerde protocol voor Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) test in katoen. De tabak rammelaar virus (TRV)-afgeleide VIGS vectoren werden ingezet om RNA-silencing van katoen GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gen induceren. De albino fenotype veroorzaakt door zwijgen op te leggen GrCLA1 ​​werd waargenomen bij de zaailing fase binnen 2 weken na inoculatie.

Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton

Katoen (Gossypium hirsutum) is een van de belangrijkste gewassen wereldwijd. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd op het gebied van moleculaire veredeling van nieuwe rassen. De ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een assay voor virus-geïnduceerde gen-silencing via Agrobacterium in katoen om genfuncties te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst katoenkiemplanten te kweken tot een stadium van 10 dagen tot twee weken oud. Vervolgens wordt het rados one-gen uit de chloroplasten van de katoenplant gekloond in een VIGS-vector op basis van het tobacco rattle virus.De derde stap is het voorbereiden van agrobacteriumculturen die P-T-R-V-R-N-A one en P-T-R-V-G-R-C-A one bevatten. De laatste stap is het handmatig inoculeren van de agrobacteriumculturen in katoencotyledonen. Uiteindelijk kunnen de resultaten van gen-silencing worden aangetoond door het albino-fenotype op de echte bladeren van de katoenplanten te observeren, ongeveer twee weken later.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transformatie is dat VIGs een snel en efficiënt platform biedt voor het bestuderen van genfuncties in katoen. Hoewel deze methode een krachtig instrument kan blijken zijn voor snelle grootschalige analyse van genfuncties op genoomniveau in katoen, kan ze ook worden toegepast op andere belangrijke gewassoorten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het handmatig inoculeren van de agrobacteriumculturen en de katoenknop lastig is.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de katoengenetica en -genomics, zoals het onderzoeken van genfuncties. Kweek katoenkiemplanten voor virus-geïnduceerde gen-silencing. Voeg metro mix 700 toe aan verschillende potten van zeven centimeter en plaats de gevulde potten in een tray. Plant vervolgens de zaden van verschillende upland-katoenvariëteiten, zoals fiber max 8 3 2 phyto, gen 4, 2 5, RF phyto, gen four 80 WR en delta pine 90.Dek de tray met de potten in de voorbereide potten af met een plastic koepel en plaats de tray in een groeikamer bij 23 °C, met een lichtintensiteit van 120 micro Einsteins per vierkante meter per seconde en een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker. Verwijder na drie tot vier dagen de plastic koepel, zodra er twee kiemblaadjes zijn verschenen. Laat de katoenplanten ongeveer 10 dagen groeien totdat de planten het stadium hebben bereikt waarin twee volledig uitgeklopte kiemblaadjes zijn ontwikkeld, maar voordat de echte bladeren zijn verschenen; de planten zijn dan klaar om te worden gebruikt voor de virus-geïnduceerde gene silencing assay.Deze kloneringsprocedures moeten worden uitgevoerd gedurende de periode van twee weken waarin de katoenplanten het stadium van volledige expansie bereiken. Amplificeer eerst het cotton chloroplasts one-gen uit een cDNA-bibliotheek van CACI remondi-bladweefsels met behulp van de in het schriftelijke protocol verstrekte primers volgens standaard PCR-procedures. Verteer vervolgens het GCA one PCR-product met Echo R one en K PN one volgens de protocollen van de enzymfabrikant.Visualiseer het PCR-product van 500 baseparen op een ethidiumbromidegel. Snijd de band uit en extraheer het DNA; ligeer het gezuiverde PCR-product vervolgens in de PYL 1 56 vector. Transformeer competente e coli-cellen met de ligatievector met behulp van T4 DNA-ligase en verspreid daarna 10 tot 50 µL van de getransformeerde cellen op LBA-agarplaten die 50 µg/mL kanamycine bevatten.Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 37 °C. Pluk de volgende dag kolonies van de plaat en kweek deze gedurende de nacht in 2 mL LB-bouillon bevattend 50 µg/mL kanamycine. Oogst de bacteriën door centrifugatie en voer DNA-isolaties uit volgens standaardprocedures. Zuiver het plasmiden-DNA en verifieer de constructen middels restrictie-enzymdigestie en sequencing.Zodra de aanwezigheid en oriëntatie van het insert in de PYL 1 56 vector zijn bevestigd, wordt het plasmide via elektroporatie in Agrobacterium tumefaciens GV 3 1 0 1 gebracht en hersteld in vloeibaar LB-medium bij 28 °C. Selecteer de transformanten op LBI-agarplaten die 50 µg/mL kanamycin en 25 µg/mL gentamicine bevatten. Indien gewenst kunnen de bacteriën worden bewaard in 25% glycerol bij -80 °C.Strijk drie dagen voor de inoculatie T-bevroren glycerolvoorraden van Agrobacterium tumefaciens die PYL 1 9 2 RNA één PY, 1 56 RNA twee en PY 1 56 RNA twee GLA één dragen uit op LB-antibiotica-agarplaten en incubeer de platen gedurende 24 uur bij 28 °C. Pluk de volgende dag voor elk construct een enkele kolonie en inoculeer elke kolonie in 5 mL LB-medium, aangevuld met 50 µg/mL kanamycine en 25 µg/mL gentamycine.Kweek de bacteriële cultuur overnacht bij 28 °C in een schudmachine ingesteld op een snelheid van 50 omwentelingen per minuut. Breng de PYL 1 56 RNA two GLA one cultuur en de controleculturen over naar afzonderlijke kolven met 50 milliliters LB-medium aangevuld met 50 micrograms per milliliter kanamycin en 25 micrograms per milliliter Gentamycin plus 10 millimolar MES en 20 micromolar acetosyringone. Kweek de cultuur overnacht bij 28 °C in een schudmachine ingesteld op een snelheid van 50 omwentelingen per minuut.Breng de volgende dag de culturen over naar centrifugebuizen en centrifugeer de Agrobacterium-cellen gedurende vijf minuten bij 4.000 toeren per minuut. Resuspendeer de cultuur in de infiltratiebuffer die 10 millimol magnesiumchloride, 10 millimol MES en 200 micromol acetosyringon bevat. Meet de OD 600 van de cultuur en stel deze bij naar 1,5 met de infiltratiebuffer. Incubeer de cultuur drie uur op het aanrecht bij kamertemperatuur voorafgaand aan de Agrobacterium-bladinfiltratie.Prik gaatjes in de onderkant van de cotton leadin van de katoenplanten met een naald van 25 gauge, zonder volledig door de cotton leadin heen te prikken. Per sectie van de Cotton Leadin worden één of twee gaatjes geprikt. Meng vervolgens de PYL 1 92 RNA one agrobacteriële cultuur in een verhouding van één-op-één met ofwel PYL 1 56 RNA two of PY 1 56 RNA two GRCA one.Introduceer vervolgens met een naald of spuit van 1 mL het mengsel via de geponste gaten aan de onderzijde van de cotyledon-stelen. Bedek de planten met een plastic koepel en laat de geïnfiltreerde planten gedurende de nacht bij kamertemperatuur onder zwakke lichtomstandigheden staan.Verplaats de planten naar een groeikamer met een temperatuur van 23 °C, een lichtintensiteit van 120 µmol m⁻² s⁻¹ en een licht-/donkercyclus van 12 uur. Onderzoek het silencing-fenotype zeven tot acht dagen na infiltratie. Op dit punt beginnen de echte bladeren van planten die zijn gesilenced door PY 1 56 RNA twee GLA one het albino-fenotype te vertonen.De planten die zijn geïnfiltreerd met agrobacteriën die PYL 1 56 RNA twee dragen, dienen als controle. Verifieer de efficiëntie van de gen-silencing door het expressieniveau van endogene genen te onderzoeken met behulp van reverse transcription PCR met RNA, geïsoleerd uit controle- en gesilenced katoenplanten volgens standaardprocedures.Deze afbeelding toont een fiber max 8 3 2 cultivar na virus-geïnduceerde gen-silencing van het GLA one-gen. Let op de witgekleurde bladeren waar hier gen-silencing is opgetreden. Een PHYTO four 80 WR cultivar vertoont eveneens het albino-fenotype na virus-geïnduceerde gen-silencing.Op dezelfde manier vertoont deze phyto 4 2 5 RF cultivar witte bladeren op de plaatsen waar virus-geïnduceerde gen-silencing is opgetreden. Ten slotte toont deze afbeelding een ander succesvol virus-geïnduceerd gen-silencing experiment, ditmaal in Delta PINE 90 cultivars. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er aceton aan de agrobacterium-culturen moet worden toegevoegd voordat deze gedurende de drie uur na deze procedure op de werkbank blijven staan.Andere methoden, zoals vig, CD NA-bibliotheekklonering, kunnen vervolgens worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het verkennen van nieuwe genfuncties na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van plantengenetica om de genfunctie en de afweerrespons op antibiotische en biotische stress in economisch belangrijke gewassen te onderzoeken. Zodra de mask-data beschikbaar zijn, kan deze techniek in twee tot drie dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe virus-geïnduceerde gen-silencing in katoen wordt uitgevoerd.

agrobacterium-mediated-virus-induced-gene-silencing-assay-in-cotton

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie...

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

Source: Shi, J., et al. Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a co-infiltration assay for identifying pathogen effector proteins that suppress RNA silencing in Nicotiana benthamiana 16c. A fluorescent reporter and a candidate effector gene are delivered into plant leaves via Agrobacterium. Normally, RNA silencing degrades reporter transcripts, reducing fluorescence. Suppressor effectors...

Co-Infiltration Assay for Screening Pathogen Effectors that Suppress Plant RNA Silencing

Source: Shi, J., et al., Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the procedure for preparing an Agrobacterium tumefaciens culture by inducing virulence gene expression with acetosyringone, followed by antibiotic removal through washing and resuspension, to generate a transformation-ready suspension for gene delivery into plant tissues.

Preparation of Agrobacterium Culture for Gene Delivery into Plant Cells

Source: Beernink, B. M. et al. Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the Agrobacterium-mediated delivery of recombinant viral clones into maize seedlings for gene silencing. It outlines the process of Agrobacterium infection, systemic viral spread, and RNA interference-driven phenotypic changes.

Agrobacterium-Mediated Delivery of Recombinant Viral Clones into Maize Seedlings for Gene Silencing

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

Een agrobacterium-based injection (agroinjectie) protocol wordt gepresenteerd voor de inenting van vossenstaart mozaïek virus en suikerriet mozaïek virusclones in maïs zaailingen. Inenting op deze manier leidt tot virale infectie, virus-geïnduceerde gen-uitschakeling van markergenen en virale overexpressie van GFP.

Directe agroinoculatie van maïszaailingen door injectie met recombinant vossenstaartmozaïekvirus en suikerrietmozaïekvirus Infectieuze klonen

Hier presenteren we een protocol voor de zeer efficiënte productie van transgene sojabonenharige wortels.

Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

Hier presenteren we het eerste protocol voor gelokaliseerde vacuüminfiltratie voor in vivo studies van de genetische transformatie van grote planten. Met behulp van deze methodologie bereikten we voor het eerst de Agrobacterium-gemedieerde in planta voorbijgaande transformatie van cacao.

Vacuümgeforceerde agro-infiltratie voor in planta transformatie van recalcitrante planten: cacao als casestudy

Leer Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing in katoen om genfunctie te bestuderen via RNA-silencing van GrCLA1. Deze methode toont snel albino-fenotypen voor functionele analyse.

Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton

Meer video's verkennen