Name: Magnetron Assisted snelle diagnose van Plant virusziekten bij Transmissie Elektronen Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer een snelle methode voor de diagnose van plantenvirusziekten met behulp van magnetronondersteunde transmissie-elektronenmicroscopie. Deze techniek verkort de voorbereidingstijd tot ongeveer twee uur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Oostenrijkse Science Fonds (FWF, P20619 en P22988 aan BZ).

Microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding <ol><li> Voor de start van monstervoorbereiding moet men de automatische magnetron weefselprocessor voor elektronenmicroscopie (EM AMW Leica, Leica Microsystems, Wenen, Oostenrijk) met volgende protocollen (tabel 1) microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding voor TEM: <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="Tabel 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> Tabel 1. Protocol voor monstervoorbereiding met behulp van microgolf bestraling. De verschillende kolommen (van links naar rechts): <ol><li> Vial nummer (Vial nr.) Geeft de volgorde waarin de flacon wordt geladen in de carrousel van de processor. </li><li> Stap van het feitelijke proces. </li><li> Reagentia in de vaatjes. </li><li> Duur van de feitelijke stap. </li><li> Maximumtemperatuur die wordt bereikt in het flesje voor het microgolfbestraling uitgeschakeld. </li><li> Microgolfbestraling instelling: Continue = snelle temperatuur behouase, die de ingestelde temperatuur; Slope = zacht temperatuurstijging, eindtemperatuur bereikt aan het einde; Pulsed = snelle temperatuurstijging, stroom uitgeschakeld totdat de temperatuur daalde 5 ° C, macht hervat op temperatuur te bereiken. </li><li> Maximumvermogen van de microgolfbestraling. </li></ol></li><li> Vers de oplossingen te bereiden voor de verschillende stappen in de monstervoorbereiding protocol (voor Agar 100 epoxyhars zie 1.7), te vullen in de daarvoor flesjes met de ingestelde protocol (Tabel 1) de flesjes laden op de carrousel, vervolgens de carrousel in de magnetron weefsel processor, en tenslotte plaatst u de eerste flacon in de mono-modus kamer. </li><li> Knip kleine delen van bladeren (1 mm 2) van Nicotiana tabacum besmet met tabak mozaïek virus (TMV) met een scheermes op een boetseerwas plaat in een daling van 3% glutaaraldehyde (Agar Scientific Ltd, Stansted, Engeland) in 60 mM Sørensen fosfaatbuffer (pH 7,2) bij kamertemperatuurdoor temperatuurschommelingen. </li><li> Breng de gedeelten met fijne pincet onmiddellijk in de aangewezen manden met een maaswijdte van ongeveer 200 urn. Stapel de manden op elkaar en steek ze in de mono-modus kamer. Wees voorzichtig dat de monsters constant bedekt met Fixatief tijdens het laden en stapelen van de pakketten, zodat ze niet uitdrogen. </li><li> Start de eerder geprogrammeerde microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding protocol voor fixatie, dehydratie en infiltratie. </li><li> Terwijl monstervoorbereiding wordt automatisch uitgevoerd door de magnetron weefsel processor verder met negatieve kleuring met het resterende plantmateriaal zoals beschreven in paragraaf 3 (negatieve kleuring). </li><li> Vers bereid Agar 100 epoxyhars door mengen van de volgende componenten beschreven: fill 24g Agar 100, 16g dodecenylbarnsteenzuuranhydride en 10 g methyl Nadic anhydride (over alle geschikte Agar Scientific Ltd, Stansted, Engeland) in een plastic beker, hitte aan40 ° C en meng het. Voeg 1,2 g van benzyl dimethylamine en meng. Vul Agar 100 epoxyhars in de aangewezen polymerisatie vormt net voor de monstervoorbereiding protocol afloopt (bijvoorbeeld tijdens stap 22 in tabel 1). </li><li> Nadat het protocol is voltooid (na stap 22 in tabel 1) laat de gestapelde manden met het geïnfiltreerde monsters van de mono-modus in de laatste kamer flacon van de carrousel. Verwijder de carrousel uit de magnetron apparaat, on-stacken de manden en laad ze met behulp van fijne pincet in de daarvoor bestemde polymerisatie vormen. Wees voorzichtig dat de monsters altijd bedekt met Agar 100 epoxyhars tijdens ontstapelen en laden zodat ze niet uitdrogen. </li><li> Stapel de polymerisatie vormen bovenop elkaar. Wees voorzichtig dat de monsters altijd bedekt met Agar 100 epoxyhars bij het stapelen en laden zodat ze niet uitdrogen. </li><li> Verwijder eerder gebruikte flacons uit de carrousel van de magnetron tissue processor, dit met de gestapelde manden en plaats de carrousel in de magnetron weefsel processor. </li><li> Start de eerder geprogrammeerde polymerisatie-protocol (tabel 1). </li><li> Terwijl polymerisatie wordt uitgevoerd automatisch door de magnetron weefsel processor, onderzoeken negatief gekleurde netten met een transmissie-elektronenmicroscoop [bijv. Philips CM10 TEM, FEI (voorheen Philips), Eindhoven, Nederland] en voer beeldanalyse zoals beschreven in paragraaf 3 en 4 ( negatieve kleuring en beeldanalyse). </li><li> Na het protocol is voltooid verwijdert de polymerisatie vormen van de monovalente kamer stacken de polymerisatie vormen en verwijder het gepolymeriseerde blokken met de monsters. Ze zijn nu klaar om te worden coupes met een microtoom. </li></ol> 2. Trimmen en snijden <ol><li> Plaats een of meer blokken in afzonderlijke sample houders voor ultradunne snijden met het monster op de top steken ongeveer 1 cm uit de houder. </li><li>Trim het blok met een specimen trimmer voor TEM (bijv. Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems), zodat een blok gezicht van Max. 1mm in lengte en 200 urn in breedte die zoveel mogelijk bladmateriaal bereikt (blok gezicht grootte eventueel moet worden aangepast aan de grootte van de diamant mes) bevat. </li><li> Gedeelte blok met een ultramicrotoom (bijv. Reichert Leica Ultracut S; Leica Microsystems) met een diamantmes op een mes hoek van 45 ° (bv. Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Oostenrijk). Snijdikte worden ingesteld op ongeveer 70 tot 90 nm en de snijsnelheid moet ongeveer 1 mm / s. Neem meerdere secties met een formvar (Agar Scientific Ltd) gecoat koper of nikkel 200 vierkante roosters. </li><li> Post-vlekken op de secties op de grid met lood citraat (Agar Scientific Ltd 1.1g loodcitraat opgelost in 42ml dubbel gedestilleerd water en 8 ml 1N NaOH) gedurende 5 minuten in een petrischaal gedeeltelijk gevuld met NaOH tot een CO 2-vrije creëren milieu en voor 15 kmMINUTEN met 1% uranylacetaat (Agar Scientific Ltd) opgelost in gedestilleerd water bij kamertemperatuur. Was de roosters met gedestilleerd water gedurende 1 minuut tussen elke post-kleuring stap. Lucht drogen de roosters in een raster doos. </li><li> Onderzoek secties met een transmissie-elektronenmicroscoop (bijv. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Nederland). </li></ol> 3. Negatieve kleuring <ol><li> Oogst ongeveer 100 mg van TMV geïnfecteerde plantmateriaal en bereiden ruwe sap door homogeniseren het materiaal gedurende 2 minuten met een scheermes op een microscoopglaasje in 100 ui 60 mM Søfrensen fosfaat buffer (pH 7,2). </li><li> Breng 20 pl van de resulterende homogenaat op het eerste putje van een met teflon bekleed microscoopglaasje met 4 of meer holtes (alternatief is het ook mogelijk om het homogenaat brengen op een stuk parafilm). </li><li> Plaats een formvar gecoat rooster bovenop het homogenaat met formvar (Agar Scientific Ltd) beklede zijde naar de druppel en incubate het 5 minuten. </li><li> Was de rooster 2 maal gedurende 2 minuten door het plaatsen van het rooster bovenop twee druppels 200 ui 60 mM Sørensen fosfaat buffer (pH 7,2). </li><li> Incubeer het rooster gedurende 1 minuut met een vers bereide 2% fosfowolfraamzuur (Agar Scientific Ltd) oplossing in 60 mM Sørensen fosfaatbuffer (pH 6,5). </li><li> Verwijder het rooster en laat het aan de lucht drogen in een raster doos. </li><li> Onderzoek de rooster met een transmissie-elektronenmicroscoop (bijv. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Nederland). Neem ten minste 10 beelden van willekeurig gekozen negatief gekleurde virions (ten minste 10 of meer virions zichtbaar moet zijn op elke afbeelding) de transmissie-elektronenmicroscoop op een lagere vergroting van 21000X of hoger. Er moet voor worden gezorgd dat alle afbeeldingen dezelfde vergroting hebben. </li></ol> 4. Beeldanalyse <ol><li> Meet de lengte en breedte van ten minste 100 willekeurig gekozen enkel virus deeltjes op de microfoto genomende negatief gekleurde monsters met behulp van een beeldanalyse computer software [bijv. Cell D (Olympus, Life en Material Science Europe GmbH, Hamburg, Duitsland) met het deeltje analyse-instrument of Optimas 6.5.1-(Media Cybernetica Inc, Bethesda, Maryland, USA)]. </li><li> Bereken gemiddelde en standaardafwijking om een ​​gemiddelde lengte en breedte van de virusdeeltjes gevisualiseerd door negatieve kleuring methoden en TEM bereiken. </li><li> Vergelijk lengte en ultrastructurele kenmerken (verkregen in 2.5) met afmetingen van virussen en ultrastructurele veranderingen veroorzaakt door virusziekten in de literatuur bekend om duidelijk de virusziekten. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Na microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding typische TMV geïnduceerde ultrastructurele veranderingen zoals grote gebieden met virions uitgelijnd in parallelle vorm kon worden waargenomen bij de transmissie-elektronenmicroscoop in de cytosol van geïnfecteerde Nicotianeen tabacum cellen (figuur 1A). Bovendien, in het ruwe sap van TMV geïnfecteerde bladeren TMV deeltjes worden waargenomen als flexuous staafvormige structuren na negatieve kleuring (figuur 1B). Beeldanalyse van 100 virusdeeltjes bleek een gemiddelde grootte voor TMV van 280 nm lang en 17nm in breedte (fig. 2). In de ultrastructuur TMV geïnfecteerde cellen en de grootte van virions in dit onderzoek bleken in overeenstemming met TMV geïnduceerde ultrastructurele eigenschappen in tabak en het groottebereik van TMV deeltjes eerder gerapporteerd in de literatuur 9-15. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Transmissie electronenmicroscopie van TMV geïnfecteerde bladcellen en virions. A) Het beeld toont de ultrastructuur van TMV-geïnfecteerde bladmoes blad cellen van Nicotiana tabacum na microgolf-geassisteerde fabriek monstervoorbereiding. Merk de grote hoeveelheid evenwijdig virions die opgebouwd in de cytosol.C = chloroplast met zetmeel (St), M = mitochondrion, N = kern, V = vacuole, Bar = 2 um. B) Afbeelding toont virionen die door negatieve kleuring waargenomen in het sap van geïnfecteerde bladeren. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Relatieve omvang van virionen. Relatieve verdeling van lengte en breedte van TMV-deeltjes na negatieve kleuring van het sap geïnfecteerde bladeren zoals zij in de elektronenmicroscoop. Gemiddelde waarden (gemiddelde lengte / breedte ± standaardafwijking) werden berekend van 100 virions.

<ol><li>Bozzola, J. J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy%22">Electron Microscopy</a>. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).</li>
<li>Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuo%2C+J+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Electron+Microscopy%2C+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols</a>. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).</li>
<li>Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-assisted+tissue+processing+for+sameday+EM-diagnosis+of+potential+bioterrorism+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples.</a> Micron. 37, 577-590 (2006).</li>
<li>Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Electron+Microscopy%2C+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols</a>. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).</li>
<li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+assisted+rapid+plant+sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 233, 258-268 (2009).</li>
<li>Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+antigenic+preservation+of+plant+samples+by+microwave-enhanced+fixation%2C+using+dedicated+hardware%2C+minimizing+heat-related+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects.</a> Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).</li>
<li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).</li>
<li>Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+polymerisation+with+microwave+irradiation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Morph%22%5BJournal%5D)">Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy.</a> Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).</li>
<li>Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectric+spectroscopy+of+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).</li>
<li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+force+microscopy+study+for+the+assembly+structures+of+tobacco+mosaic+virus+and+their+size+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation.</a> Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).</li>
<li>Milne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+tobacco+mosaic+virus+in+tobacco+leaf+palisade+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells.</a> Virology. 28, 527-532 (1966).</li>
<li>Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tobacco+mosaic+virus+strains+on+the+ultrastructure+of+tobacco+leaf+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells.</a> Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).</li>
<li>Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens%3A+a+fresh+look+at+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus.</a> J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).</li>
<li>Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+tobacco+mosaic+virus+particles+as+scaffolds+for+display+of+protein+antigens+for+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications.</a> Virology. 348, 475-488 (2006).</li>
<li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+TEM+diagnosis+of+plant+virus+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases.</a> J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).</li>
<li>Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+processing+techniques+for+electron+microscopy%3A+a+four-hour+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol.</a> Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Microgolf-geassisteerde fabriek monstervoorbereiding voor TEM is bewezen dat een snelle en betrouwbare ultrastructurele gegevens te verstrekken binnen een paar uur 3,4,16. De fijne structuur behoud van organellen en membranen bereikt met de werkwijze die in deze studie was vergelijkbaar met conventionele en cryofixed samples 5,15 met het voordeel van een drastische reductie in monster fixatie en inbedden tijd van 3 dagen of langer tot ongeveer 2 uur. Dit de snelste monstervoorbereiding protocol voor TEM beschikbaar in de literatuur. De methode van dit onderzoek combimagnetron geassisteerde installatie monstervoorbereiding voor TEM met negatieve kleuring methoden die een duidelijke en snelle identificatie van TMV geïnduceerde ultrastructurele veranderingen en viraal middel zelf toegestaan. TMV geïnduceerde ultrastructurele veranderingen zouden kunnen worden onderzocht na het trimmen, snijden en na kleuring in ongeveer 4 uur na het begin van fixatie in de transmissie electron microscoop. De volledig automatisch prepareren mode bevrijd de onderzoeker negatieve kleuring voeren tussentijds om de grootte en breedte van de virale agens bepalen. Zo kunnen we concluderen dat deze methode een duidelijke en snelle diagnose van ziekten in planten virus halve dag die van groot belang is voor toekomstig gebruik in de landbouw en wetenschappelijke experimenten in plant fytopathologie maakt. Aangezien deze methode ook kan worden gebruikt voor de snelle diagnose van ziekten van mens en dier heeft een groot potentieel voor toekomstige toepassing in medische en veterinaire pathologie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Glutaaraldehyde </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> Osmiumtetroxide </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> Agar 100 hars </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecenylbarnsteenzuuranhydride </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> Methyl Nadic anhydride </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyl dimethylamine </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> Loodcitraat </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetaat </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> Fosfowolfraamzuur </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> Agar Scientific Ltd </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Leica EM AMW </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultratrim </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Nieuwer model is verkrijgbaar </td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultracut S </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Nieuwer model is verkrijgbaar </td></tr><tr><td> Diatome Ultra 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Philips CM10 TEM </td><td> FEI (voorheen Philips) </td><td> &lt;/ Td&gt; <td> Nieuwer model is verkrijgbaar </td></tr><tr><td> Cel D </td><td> Olympus Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optimas 6.5.1 </td><td> Media Cybernetica Inc </td><td></td><td> Nieuwere versie beschikbaar is </td></tr></tbody></table>

magnetron assisted snelle diagnose van plant virusziekten bij transmissie elektronen microscopie

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Onderzoek van ultrastructurele veranderingen geïnduceerd door virussen zijn vaak nodig om duidelijk virale ziekten bij planten. Bij conventionele monstervoorbereiding voor transmissie elektronenmicroscopie (TEM) onderzoeken kan bijvoorbeeld enkele dagen 1,2 en zijn daarom niet geschikt voor een snelle diagnose van plantaardige virusziekten. Magnetron fixatie kan worden gebruikt om drastische vermindering monstervoorbereiding tijd voor TEM onderzoek met gelijke ultrastructurele resultaten waargenomen na conventioneel monstervoorbereiding 3-5. Verschillende maat magnetrons beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor de succesvolle bevestiging en verankering van biologische monsters voor TEM onderzoek 5-8. In deze studie demonstreren op Tobacco Mosaic Virus (TMV) geïnfecteerd Nicotiana tabacum planten die het mogelijk is ultrastructurele veranderingen in bladeren diagnose in een halve dag met microgolf-geassisteerde monstervoorbereiding voor TEM. Wij hebben besloten om deze studie met een in de handel verkrijgbare magnetron-toestel als hij presteert monstervoorbereiding bijna volledig automatisch 5 in tegenstelling tot de andere beschikbare apparaten waar vele stappen nog handmatig 6-8 worden uitgevoerd en dus meer tijd en arbeidsintensief. Zoals monstervoorbereiding is uitgevoerd volautomatisch negatieve kleuring van virale deeltjes in het sap van de resterende TMV-geïnfecteerde bladeren en de volgende onderzoek van de ultrastructuur en grootte kunnen worden uitgevoerd tijdens fixatie en inbedding.

Deze studie beschrijft een methode die de snelle en duidelijke diagnose van plantaardige virusziekten in ongeveer een halve dag maakt door gebruik te maken van een combinatie van microgolf-geassisteerde fabriek monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie en negatieve kleuring methoden.

Magnetron Assisted snelle diagnose van Plant virusziekten bij Transmissie Elektronen Microscopie

Onderzoeken naar ultrastructurele veranderingen geïnduceerd door virussen zijn vaak noodzakelijk om virale ziekten bij planten eenduidig te identificeren. Met conventionele monster...

Het algemene doel van deze procedure is om plantenvirusziekten binnen enkele uren te diagnosticeren middels transmissie-elektronenmicroscopie. Deze procedure begint met microwave-ondersteunde fixatie en inbedding van het geïnfecteerde plantmateriaal. De volgende stap is het extraheren en kleuren van viruspartikels uit de plantmonsters via negatieve kleuring, gevolgd door het maken van coupes van de ingebedde plantmonsters.De monsters worden vervolgens onderzocht in de transmissie-elektronenmicroscoop en de grootte van de virusdeeltjes wordt gemeten via beeldanalyse. Uiteindelijk tonen de resultaten typische virus-geïnduceerde ultrastructurele veranderingen en de grootte van de virusdeeltjes middels transmissie-elektronenmicroscopische methoden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele fixatie en inbedding bij kamertemperatuur, wat meerdere dagen in beslag kan nemen, is dat de monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie kan worden teruggebracht tot ongeveer twee uur, waardoor een duidelijke diagnose van de virale ziekte in ongeveer een halve dag mogelijk is.Gerhard Kaba, een laborant, en professor Zelnik, een collega uit ons laboratorium, zullen deze procedure samen met mij demonstreren. Voor aanvang van het monsterpreparatieprogramma wordt de automatische magnetron weefselprocessor voor elektronenmicroscopie LA A-E-M-A-M-W met de juiste protocollen klaargezet. Bereid de oplossingen voor de verschillende stappen die in het geprogrammeerde protocol voor fixatie, dehydratie en infiltratie worden beschreven, vul deze in de daarvoor bestemde vials volgens het protocol en plaats de vials op het carrousel. Plaats het carrousel in de magnetron weefselprocessor en schuif vervolgens het eerste vial in de mono-mode kamer.Snijd vervolgens met een scheermesje kleine secties bladeren uit Nicotiana-tabak die is geïnfecteerd met het tabaksmosaïekvirus, of TMV, op een plaat met boetseerwas in een druppel glutaaraldehyde in Sorensen-fosfaatbuffer bij kamertemperatuur. Tijdens het oogsten van de monsters en het laden van de monsters in de mandjes is het belangrijk om ervoor te zorgen dat ze altijd bedekt blijven met fixatievloeistof, zodat ze niet uitdrogen. Verplaats de secties onmiddellijk met een fijne pincet naar de daarvoor bestemde mandjes met een maaswijdte van ongeveer 200 µm.Stapel de mandjes op elkaar en plaats ze in de kamer in mono-modus. Start het eerder geprogrammeerde microwave-ondersteunde monstervoorbereidingsprotocol voor fixatie, dehydratie en infiltratie. Vul, vlak voordat het monstervoorbereidingsprotocol is voltooid, de daarvoor bestemde polymerisatievormen met vers bereide agar 100 epoxyhars.Nadat het protocol is voltooid, laat u de gestapelde mandjes met de geïnfiltreerde monsters vanuit de kamer in mono-modus in het laatste flacon van het carrousel vallen. Verwijder het carrousel uit het magnetronapparaat en neem de flacon met de monsters uit het carrousel. Verwijder vervolgens de mandjes uit de flacon en stapel ze uit met een fijne pincet.Laad de monsters in de daarvoor bestemde polymerisatievormen. Stapel vervolgens de polymerisatievormen op elkaar en verwijder de eerder gebruikte flacons uit het carrousel van de magnetron-weefselprocessor. Laad het carrousel met de gestapelde mandjes en plaats het carrousel in het magnetronapparaat.Start nu het eerder geprogrammeerde polymerisatieprotocol. Nadat het protocol is voltooid, verwijdert u de polymerisatievormen uit de mono-mode kamer en stapelt u deze uit elkaar. Verwijder de gepolymeriseerde blokken met de monsters; deze zijn nu klaar om met een microtoom te worden gesneden om de procedure voor het snijden van de blokken met de monsters te starten.Plaats één of meer blokken in afzonderlijke monsterhouders voor ultrafijn snijden. Plaats het monster bovenop, zodanig dat het ongeveer één centimeter uit de houder steekt. Trim het blok met een specimen-trimmer voor TEM, zodat een blokvlak van maximaal één millimeter lengte en 200 micrometers breedte wordt bereikt, waarin zoveel mogelijk bladmateriaal is opgenomen.Stel de ultramicrotoom in om coupes van ongeveer 70 tot 90 nanometer dikte te snijden met een snelsnelheid van circa één millimeter per seconde. Snijd het blok met een diamantmes onder een meshoek van 45 graden. Neem meerdere coupes op met een Formvar-gecoat koperen of nikkelen 200-mesh grid. Kleur de coupes op het grid vervolgens gedurende vijf minuten met loodcitraat in een Petrischaal die gedeeltelijk is gevuld met NaOH om een CO2-vrije omgeving te creëren.Was de roosters gedurende één minuut met gedestilleerd water. Voer tot slot, na het opnieuw wassen van de roosters met gedestilleerd water gedurende één minuut, een contrastkleuring uit van 15 minuten met 1% uranylacetaat opgelost in gedestilleerd water bij kamertemperatuur en laat de roosters aan de lucht drogen in een roosterdoos. De negatieve kleuring van het resterende plantmateriaal wordt uitgevoerd terwijl de monstervoorbereiding automatisch wordt uitgevoerd door de microwave tissue processor.Oogst eerst ongeveer 100 milligram TMV-geïnfecteerd bladmateriaal en bereid ruw SAP voor door het materiaal gedurende twee minuten te homogeniseren met een scheermesje op een microscoopglas in sorens en fosfaatbuffer. Breng 20 microliters van het resulterende homogenaat over naar de eerste put van een met Teflon gecoate microscoop.OBJECTGLAS met vier of meer putjes. Plaats vervolgens een met form VAR gecoat grid bovenop het homogenaat, met de form VAR-gecoate zijde naar de druppel gericht, en laat dit vijf minuten incuberen. Was het grid gedurende twee minuten door het grid op een druppel Sørensen-fosfaatbuffer te plaatsen.Herhaal de wasbeurt gedurende nog eens twee minuten. Incubeer vervolgens het raster één minuut met een vers bereide phospho tongue stick zuuroplossing. Verwijder na één minuut het raster en laat het aan de lucht drogen.Plaats het negatief gekleurde raster in de monsterhouder van een rasterdoos en onderzoek dit met een transmissie-elektronenmicroscoop. Terwijl de polymerisatie automatisch wordt uitgevoerd door de magnetron-weefselprocessor, worden er ten minste 10 beelden gemaakt van willekeurig gekozen negatief gekleurde ionen. Op elk beeld moeten ten minste 10 of meer ionen zichtbaar zijn.Bij gebruik van de transmissie-elektronenmicroscoop bij een primaire vergroting van 21.000 x of hoger moet er zorgvuldig worden toegezien op een gelijke vergroting voor alle beelden. De coupes met de weefselmonsters die automatisch zijn verwerkt met de microgolf-weefselprocessor worden eveneens onderzocht met een transmissie-elektronenmicroscoop. De analyse van de met TEM verkregen beelden kan worden uitgevoerd met behulp van elke willekeurige beeldanalyse-software.Computersoftware met een instrument voor partikkelanalyse. Meet de lengte en grootte van ten minste 100 willekeurig gekozen individuele viruspartikels op de micrografieën van de negatief gekleurde monsters. Bereken de gemiddelden en standaarddeviaties om een gemiddelde lengte en breedte te bepalen van de viruspartikels die zijn gevisualiseerd met negatief kleuringsmethoden en TEM na monsterpreparatie met magnetronondersteuning.Typische ultrastructurele veranderingen veroorzaakt door TMV, zoals grote gebieden met parallel uitgelijnde ionen, konden met de transmissie-elektronenmicroscoop worden waargenomen in het cytosol van geïnfecteerde cellen van Nicotiana tabacum. In deze transmissie-elektronenmicrograf staat C voor chloroplast met zetmeel, St.M voor mitochondrion, is voor kern en V voor vacuole.Daarnaast konden in het ruwe SAP van met TMV geïnfecteerde bladeren TMV-partikels worden waargenomen als duidelijke staafvormige structuren na negatieve kleuring. Figuur één B. Deze grafiek toont de relatieve verdeling van de lengte en breedte van 100 TMV-partikels zoals deze verschenen in de elektronenmicroscoop. Na negatieve kleuring onthulde de beeldanalyse van de viruspartikels in het sap van geïnfecteerde bladeren een gemiddelde grootte voor TMV van 280 nanometers in lengte en 17 nanometers in breedte, na de ontwikkeling hiervan om virusziekten in de hersenen snel te diagnosticeren.Deze techniek kan de weg vrijmaken voor onderzoekers in de velden van dierlijke en menselijke pathologie om dierlijke en menselijke ziekten snel te diagnosticeren middels transmissie-elektronenmicroscopie.B.

microwave-assisted-rapid-diagnosis-plant-virus-diseases-transmission

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Macromoleculaire de handel tussen de plantencellen kan worden beoordeeld door kortstondig te drukken een fluorescent-gelabeld eiwit van belang en de analyse van de intra-en intercellulaire distributie door confocale microscopie.

Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement

Beter inzicht in en ons vermogen om veel van de insecten overgedragen plantenvirussen beheerder vereist het gebruik van de vector. Insect overdracht van plantenvirussen is een tritrofe interactie, en als zodanig vereist het manipuleren van insecten, virussen, en plant. Vectoren worden gekweekt in grote aantallen en gemanipuleerd op zodanige wijze dat een hoge mate van overdracht op testplanten verzekeren. De basisprincipes van het houden van en het manipuleren van de witte...

Zenden Plant Virussen gebruiken Wittevlieg

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Bron: Bou Khalil, J. Y., et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).Deze video demonstreert de beeldvorming van faustovirusdeeltjes uit een geïnfecteerde amöbenkweek met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Er wordt ingegaan op de preparatie van het raster, negatieve kleuring met ammoniummolybdaat om het contrast te verhogen en de visualisatie van het virus onder de microscoop. Het protocol...

Visualisatie en groottebepaling van Faustovirus met behulp van elektronenmicroscopie

We beschrijven hier een eenvoudige fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werkwijze voor de lokalisatie van virussen en bacteriën in insecten en plantenweefsels. Dit protocol kan worden verlengd voor de visualisatie van mRNA in ganse berg en preparaten.

Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisaties (FISH) voor de lokalisatie van Virussen en Endosymbiotic Bacteriën in Plant en Insect Tissues

Het verkrijgen van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscoopbeelden is een uitdaging, vooral in het geval van plantencellen, die overvloedige grote watergevulde vacuolen en beluchte ruimtes hebben. Tandem hogedrukvriestechniek en snelle vriessubstitutie verminderen de bereidingstijd van plantenmonsters voor TEM aanzienlijk, terwijl ze monsters produceren met uitstekende ultrastructurele behoud.

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

We beschrijven hier de laatste ontwikkelingen in virale isolatie voor de karakterisering van nieuwe genotypen van Faustovirus, een nieuw asfarvirus-gerelateerd lijn van gigantische virussen. Dit protocol kan worden toegepast op de isolatie van virussen met hoge doorvoer, met name gigantische virussen die amoeben infecteren.

Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

Snelle en nauwkeurige detectie van plant ziekteverwekkers on-site, met name bodem overgedragen ziekteverwekkers, is van cruciaal belang om te voorkomen dat verdere entmateriaal productie en verspreiding van plantenziekten in het veld. De methode ontwikkeld die hier met behulp van een draagbaar real-time PCR detectiesysteem kunt on-site diagnose onder veldomstandigheden.

On-Site moleculaire detectie van bodem-gedragen planteziekteverwekkers met behulp van een draagbare Real-Time PCR-systeem

Dit protocol voor immunofluorescente etikettering van zowel plantaardige viruseiwitten als vectorinsecteneiwitten in weggesneden insectendarmen kan worden gebruikt om interacties tussen virus- en vectorinsecten, insecteneiwitfuncties en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan virusoverdracht te bestuderen.

Immunofluorescente etikettering van plantenvirussen en insectenvectoreiwitten in hemipterandarmen

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de snelheid van geprogrammeerde celdoodinitiatie door continu geïnoculeerde bladeren in beeld te brengen na celdoodinductie.

Het bestuderen van celdoodinitiatie met behulp van een digitale microscoop

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Leer een snelle methode voor de diagnose van plantenvirusziekten met behulp van magnetronondersteunde transmissie-elektronenmicroscopie. Deze techniek verkort de voorbereidingstijd tot ongeveer twee uur.

Magnetron Assisted snelle diagnose van Plant virusziekten bij Transmissie Elektronen Microscopie

Meer video's verkennen