Name: Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Leer lentivirale genetische manipulatie en visualisatie van enkele olfactorische sensorische neuronen in vivo. Deze methode onthult axonale trajecten en terminale vertakkingen in het complexe reukzintuig.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek wordt ondersteund door NIH DC052256 en DC006015, en NSF 0.324.769 tot QG en T32-DC008072 BS.

1. Voorbereiding Deze procedure is bioveiligheidsniveau 2, dus alle de volgende voorbereidingen worden gemaakt in een biohazard kap, waar de micro-injectie procedure wordt uitgevoerd. <ol><li> Voor te bereiden en verwarm een ​​37 ° C waterbed: Vul een plastic zak met water - afdichting en ingesteld op een lege verwarmingsblok incubator. Dit zal toelaten muizen om na de injectie te herstellen. </li><li> Vul een biologisch afval container met 10% bleekwater om een ​​geschikte volume voor immersie van alle afval van deze procedure. </li><li> Bereid een kleine open schotel van 70% ethanol en een tweede gerecht met gesteriliseerd ddH2O en plaats in de biologische veiligheid kabinet. </li><li> Steriliseren een 5μL capaciteit Hamilton spuit met een 33-gauge naald door het sproeien van het lichaam naar beneden en de naald met 70% ethanol met de zuiger haalde alles uit de weg. Herhaaldelijk aspireren ethanol uit de schotel en verwijder het helemaal ten minste 5 keer. </li><li> Spoel de spuit cartridge door opzuigen en uitstoten van steriel water minstens 5 keer. Plaats spuit veilig opzij in de cultuur motorkap en laat ze drogen. </li><li> Verwijder de virale voorraden van -80 ° C vriezer opslag en plaats op het ijs te laten ontdooien. Micro-injectie nodig 2μL van het virus voorraad per muis op een titer van 10 9 infectieuze eenheden / ml. Lentivirussen kan worden verkregen uit commerciële bronnen of geproduceerd in het laboratorium op basis van het vastgestelde protocol (Lois et al.., 2002). </li><li> Bereid een injectie stadium dat een gebied dat hoog boven de motorkap oppervlak biedt - kan een 10cm cultuur schotel bedekt met een vel Kimwipe gebruik. </li><li> Schik alcoholdoekjes de buurt van de injectie station. </li></ol> 2. Micro-injectie van lentivirale deeltjes in het reukepitheel Alle dierlijke ingrepen uitgevoerd in deze methode worden uitgevoerd volgens de IACUC goedgekeurde richtlijnen. De Mus musculus stam C57BL/6J is het diermodel gebruikt in alle experimenten toonden hier. <ol><li> Verdoof muis pups door onderkoeling door het nemen van een muis pup (P0-P3) uit de kooi en zetten de pup op een cut-open handschoen op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> In afwachting van de pup volledig onder narcose, aspiratie 2μL van virale voorraad zijn in de gesteriliseerde Hamilton spuit. </li><li> Plaats de muis pup op de top van de injectie podium. Voorzichtig trek de huid van de bovenkant van het hoofd bij het oor naar de bovenkant van de hals. Dit moet een les huidoppervlak over de neusholte en zullen verlichten injectie. </li><li> Steek de naald door de bovenkant van de neusholte ongeveer 3 mm onder het huidoppervlak aan het reukepitheel te bereiken. Microinject 0.5μL van virus-oplossing per shot, het kiezen van twee locaties per kant, zowel links als rechts (vier injecties totaal per muis = 2μL van de benodigde virus). Injectieplaatsen moeten worden gespreid uit elkaar. Voor het richten van de juiste injectieplaatsen, zoek het dorsale schedel oppervlak voor de omtrek van de bulbus olfactorius. Deze lijn is nauwelijks zichtbaar bij de geboorte door de semi-doorschijnende huid en de schedel. Om twee injecties per kant, tot doel een injectie net rostraal van een bol schetsen op een mediale as. Maak de tweede inbrengen lateraal van de lamp schetsen, maar zorg ervoor dat de injectie mediaal hoek, zodat u kunt het reukepitheel, dat ventraal zich bevindt onder de lamp te bereiken. Vermijd het penetreren van de bulbus olfactorius! </li><li> Dep droog eventueel resterende virus oplossing of bloed kan ontsnappen uit de injectieplaats of neusgat openingen met behulp van een Kimwipe. Direct over Kimwipes in de verdunde bleekwater biohazard container. </li><li> Plaats de geïnjecteerde muis op het waterbed incubator. </li><li> Herhaal stap 1-4 voor alle muizen in te spuiten, herinneren u over 2μL van het virus voorraad per muis nodig hebt. </li><li> Laat muizen terug op het waterbed incubator gedurende 30 minuten alvorens terug te keren naar de oorspronkelijke nest kooi. </li><li> Gooi micro-injectie podium, schoonmaken doekjes en eventuele extra schoonmaak papier producten in het bleekwater biohazard beschikking. </li><li> Reinig de Hamilton spuit door herhaalde aspiratie en uitwerpen van ethanol en vervolgens met water zoals in de voorbereiding stappen. Laat de spuit om te drogen. </li><li> Voor maximale transductie-efficiëntie herhalen deze procedure in 4 uur. Geïnfecteerde OSNs kan worden gevisualiseerd door de lengte van de cel in slechts drie dagen. </li></ol> 3. Immunohistochemie van drijvende bulbus olfactorius secties <ol><li> Offer de geïnjecteerde muis op het gewenste tijdstip en perfusie van het weefsel vast met 4% paraformaldehyde. Ontleden de OB. Incubeer in paraformaldehyde &#39;s nachts en dan 30% sucrose in PBS&#39; s nachts. Insluiten in OCT inbedmedium op droog ijs. </li><li> Coronale OB secties zijn verkregen bij een 60μm dikte met behulp van een cryostaat. Veeg de lamp secties in een 10cm cultuur schotel met 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Onderdelen moeten worden gehouden zweven in PBS tot oktober te laten dissolve. Overdracht drijvende secties en PBS in een 50 ml conische flacon. </li><li> Laat secties om zich te vestigen op de bodem van de flacon. Stofzuigen PBS zonder zuigen alle secties. Spoel weefselcoupes met 20 ml PBS. Herhalen bezinken en stofzuigen stappen. Resuspendeer weefsel met 10 ml PBS en overdracht zwevende delen om een ​​15 ml flacon voor conische immunokleuring. Zodra weefselcoupes hebben gevestigd, stofzuigen PBS supernatans zonder storende weefsel. Resuspendeer secties met 0,3% Triton X-100 in 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx), waardoor het reinigen van celmembranen perforeren. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vacuüm af supernatant en herhaal de incubatie met PBS-Tx twee keer. </li><li> Incubeer weefselcoupes in 10 ml van het blokkeren van oplossing (5% paard serum in PBS-Tx) gedurende twee uur bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel het blokkeren oplossing ten minste tweemaal met PBS-Tx gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid 2 ml van een primair antilichaam oplossing in PBS-Tx. Zie Reagentia en apparatuur sectie voor antilichamen gebruikt in dit experiment. </li><li> Vervang seconden PBS-Tx blokkeren wassen met primair antilichaam oplossing. Incubeer op een langzaam rockende platform (~ 30rpm) bij 4 ° C gedurende 24-48 uur een grondige penetratie zorgen in de 60μm drijvende secties. </li><li> Na de incubatie kan het primaire antilichaam oplossing worden opgehaald voorzichtig met een pipet en opgeslagen bij 4 ° C voor hergebruik nog maximaal twee keer binnen twee weken zonder noemenswaardig verlies van kleuringsintensiteit. </li><li> Was secties drie keer in PBS-Tx 20 minuten elk bij kamertemperatuur met zachte rotatie (~ 30rpm). </li><li> Bereid 2 ml van de secundaire antilichaamverdunning in PBS-Tx. Stofzuiger uit de laatste wasbeurt en voeg secundair antilichaam oplossing voor weefselcoupes. Wikkel de buitenkant van de kleuring flacon in aluminiumfolie om het licht, die fluorofoor fotobleken kan veroorzaken blokkeren. Plaats gewikkeld flacon op een langzaam schommelend platform en incuberen bij 4 ° C gedurende de nacht. </li><li> Gooi secundair antilichaam-oplossing door met een stofzuiger weg. Een keer wassen secties met PBS-Tx voor elk 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel twee extra keer met PBS (pH 7,4) gedurende 20 minuten elke bij kamertemperatuur. Monteer de gekleurde weefselcoupes op glasplaatjes met Fluoromount G. </li><li> Het scherm door middel van gekleurde coupes voor het positief besmet OSN axonen en axon termini met een fluorescentiemicroscoop. </li><li> Voor het construeren van een drie dimensionaal beeld van een label OSN axon en terminal prieel, een reeks van optische secties door het 60μm diepte van de doelgroep OB weefsel slice (langs de z-as) met behulp van confocale microscopie. </li><li> Deze stapel van Z-sectie beelden kunnen vervolgens worden geprojecteerd samen om een ​​360 ° roterende perspectief van een enkel label OSN axon, inclusief terminal prieel detail in zijn geheel te reconstrueren. Ieder een enkel draaihoek kunnen worden vastgelegd en worden uitgevoerd als een image-bestand (dat wil zeggen JPG, TIFF) voor 2D-indeling de presentatie. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Met de hier beschreven methoden, kunnen wij transduceren olfactorische sensorische neuronen door lentivirus in vivo. We hebben tot nu toe gevisualiseerd besmet OSNs met GFP en mCherry fluorescerende verslaggevers, maar ook met een myc-gelabeld fusie-eiwit via immunocytochemie. Deze techniek zorgt voor een overvloed van geïnfecteerde OSNs. Nog steeds, transductie sporadisch voorkomt genoeg om individueel gelabeld OSNs te bieden, waardoor voor de analyse van enkele cel morfologie. Axonen en axon terminals worden afgebeeld binnen OB weefselcoupes temidden van hun eigen omgeving door confocale microscopie (figuur 1). De hele OSN axon terminal prieel kan meestal worden geboeid in een 40-50μm optische gedeelte. Hoge vergroting van geïnfecteerde OSN axon terminals maakt gedetailleerde analyse van axonale prieel morfologie bij de glomerulaire laag. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figuur 1. Traject van enkele olfactorische sensorische neuron axon en haar terminal prieel. A) een coronale deel van de bulbus olfactorius van een P7 muis met de reukzenuw laag (ONL) immunostained voor de OMP (rood) en de glomerulaire laag (GL) immunostained met zowel OMP en Vglut2 (grijs). Een enkele olfactorische sensorische neuron axon uiten van GFP (groen) reist binnen de ONL en doordringt in de glomerulaire structuur. B) De axon terminal prieel morfologie binnen de glomerulus duidelijk gemarkeerd door GFP expressie. Vglut2 co-kleuring in grijs verlicht de totale glomular gebied waarbinnen de GFP-positieve axon werkt een terminal abortus. C) Lentivirale besmet OSNs uiten van GFP (groen) in de OE. De cytostructure van het reukepitheel wordt weergegeven met DAPI kleuring (blauw). GFP expressie maakt visualisatie van OSN cellichamen en hun cellulaire processen in de OE. D) Een OSN axon en de terminal morfologie met Rap1GAP2 expressie naar knock-door shRNA. Lentivirussen het dragen van een dubbele expressiecassette met Rap1GAP2 shRNA onder de muis U6 promotor en GFP onder eenCMV promoter werden toegepast op de OE. Geïnfecteerde olfactorische axon terminals vertoonden een meer vereenvoudigde terminal prieel in vergelijking met dat van de GFP enige controle. Bar = 20μm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

Dit protocol is bio-veiligheid niveau 2 voldoen. Alle nodige werkruimte, persoonlijke bescherming, en virale afval inperkingsmaatregelen zijn dienovereenkomstig vastgesteld. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens IACUC richtlijnen.

Micro-injectie van lentivirus resulteert in een permanente overdracht van gen-constructen in OSN genomisch DNA. Deze aanpak stelt ons in staat om te presteren op korte termijn of lange termijn manipulaties van kandidaat-genen via overexpressie of shRNA gemedieerde knock-down. Daarnaast kunnen we fluorescent label single OSNs in een bestaande transgene muis lijn naar co-lokalisatie van geurende receptor populaties te observeren. Micro-injectie is nodig voor lentiviraal transductie van OSNs. We hebben geprobeerd spoelen l...

Micro-injectie: Pasgeboren muizen werden gemicroinjecteerd met behulp van een injectiespuit 5μL Hamilton (Hamilton # 7647-01), uitgerust met een 33 gauge naald (Hamilton # 7762-06). Immunocytochemie Reagentia: Primaire antilichamen: konijn polyklonaal antilichaam GFP (Molecular Probes # A-6455), kip polyklonaal antilichaam tegen OMP (aangepaste) (Chen et al., 2005.) Cavia polyklonaal antilichaam tegen VGlut2 (Millipore # AB2251). Secundaire antilichamen: Cy2-geconjugeerd ezel anti-konijn (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-geconjugeerd ezel-anti-kip (Jackson Immunolab # 703-165-155) en Cy5-geconjugeerd geit anti-cavia (Jackson Immunolab # 106-175-008). Secties werden gemonteerd op objectglaasjes met Fluoromount G (Zuid-Biotech # 0010-01) met 50ng/mL DAPI chromatine vlek oplossing. Confocale Imaging: Z-stack beelden werden gemaakt met behulp van een Olympus Flouview FV1000 confocale microscoop en de beelden verzameld en verwerkt tot 3D-projecties met behulp van Olympus FV10-ASW 2,01 confocale acquisitie en analyse software.

lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen in vivo</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

De ontwikkeling van een nauwkeurige olfactorische circuit is gebaseerd op nauwkeurige projectie van olfactorische sensorische neuron (OSN) axonen naar hun synaptische doelen in de bulbus olfactorius (OB). De moleculaire mechanismen van OSN axongroei en targeting worden niet goed begrepen. Het manipuleren van genexpressie en de daaropvolgende visualiseren van enkele OSN axonen en hun terminal prieel morfologie zijn tot nu toe uitdagend. Om te studeren gen functie op de enkele cel niveau binnen een bepaalde termijn, ontwikkelden we een lentivirale gebaseerde techniek om genexpressie te manipuleren in OSNs in vivo. Lentivirale deeltjes worden geleverd aan OSNs door micro-injectie in het reukepitheel (OE). Expressiecassettes worden dan permanent geïntegreerd in het genoom van getransduceerde OSNs. Groen fluorescerend eiwit expressie herkent besmette OSNs en schetst hun hele morfologie, inclusief de axon terminal prieel. Vanwege de korte doorlooptijd tussen de micro-injectie en verslaggever detectie, kunnen genen functie studies worden geconcentreerd binnen een zeer nauwe periode van ontwikkeling. Met deze methode hebben we ontdekt GFP expressie binnen slechts drie dagen en zo lang als drie maanden na de injectie. We hebben bereikt zowel over-expressie en shRNA gemedieerde knock-down door lentiviraal micro-injectie. Deze methode biedt gedetailleerde morfologie van de OSN cellichamen en axonen op de single cell niveau in vivo, en dus maakt karakterisering van kandidaat-gen olfactorische functie tijdens ontwikkeling.

We presenteren een lentivirale techniek voor genetische manipulatie en visualisatie van een olfactorische sensorische neuron axon en de terminal arborization<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo</em

De ontwikkeling van een nauwkeurig reukcircuit is afhankelijk van de precieze projectie van axonen van reuksensoryneuronen (OSN) naar hun synaptische doelen in de ...

Een van de uitdagingen bij het bestuderen van ontwikkeling in de neurowetenschappen is het in vivo vastleggen van dendritische en axonale morfologieën op het niveau van een enkele cel. In het reukstelsel strekken reuksensoneuronen hun axonen uit van het reukeptheel in de neus naar de bulbus olfactorius in de hersenen. Aangezien meerdere reuksensoneuronen richting de bulbus olfactorius projecteren, vormen zij bundels via fasciculatie.Dit bemoeilijkt de studie van individuele axontrajecten en hun terminale morfologieën. We hebben een methode ontwikkeld om individuele olfactorische sensorische neuronen in vivo te visualiseren door micro-injectie van een GFP-construct dragen lentivirus.Succesvolle transductie met lentivirus verlicht de gehele lengte van het olfactorische sensorische axon, inclusief de terminale arbor. Naast het visualiseren van individuele olfactorische sensorische neuronen, stelt deze methode ons in staat om de genexpressie van een specifiek gen van belang te manipuleren om de functie ervan in een in vivo context te bestuderen. Deze lentivirusprocedure valt onder biosafety level twee en moet in een laminaire flowkast worden uitgevoerd.Om een steriele omgeving te behouden, dient alles wat in de laminaire flowkast wordt geplaatst, in de kast te worden besproeid met 70% ethanol. Bereid een waterbad van 37 °C voor en warm dit minimaal 20 minuten voor voordat u gaat injecteren. Vul een plastic opbergzak voor de helft met water, sluit deze af en plaats deze op een lege warmteblokincubator.Dit geeft de muizen de tijd om te herstellen na de injectie. Vul een container voor biologisch gevaarlijk afval met 10% bleekmiddel om al het materiaal dat aan het virus is blootgesteld te ontsmetten. Bereid voor deze procedure een klein open schaaltje met 70% ethanol en een tweede schaaltje met steriel gedestilleerd water voor.In een laminaire flowkast gebruiken we een Hamilton-spuit met een capaciteit van 5 µL en een naald van gauge 33. Dit specifieke model maakt het mogelijk om de weerstand van de zuiger aan te passen door aan een spanningsknop bovenop de zuigerkamer te draaien. Deze functie biedt controle over het microinjectievolume om de naald en de spuitkamer te steriliseren.Aspirer en spuit ethanol herhaaldelijk meerdere keren in en uit de schaal. Spoel de spuitpatroon door meerdere keren steriel water te aspireren en uit te stuiten. Plaats de spuit veilig opzij in de laminaire flowkast.Plaats alcoholdoekjes in de buurt van het injectiestation. Bereid een injectieplatform voor dat een verhoogd oppervlak biedt om de positionering van de muis te vergemakkelijken. Hiervoor kan een omgekeerde kweekschaal van 10 centimeter worden gebruikt, bedekt met Kim wipes.Muispups kunnen door middel van hypothermie worden geanestheseerd tot aan de sponingsleeftijd. Knip een vinger uit een rubberen handschoen en plaats de muispup in de uitgesneden vinger. Plaats deze vervolgens vijf minuten op ijs.De handschoen voorkomt huidverbrandingen die zouden ontstaan door direct huidcontact met het ijs. Test op volledige anesthesie door in de achterpoten en de vier voetjes van de pup te knijpen om er zeker van te zijn dat het dier niet reageert. We zijn nu klaar voor de micro-injectie van het lentivirus. We zullen dit demonstreren bij een neonatale pup.Indien er gebruik wordt gemaakt van muizen op oudere leeftijd, dient de naald van 33 gauge te worden vervangen door een dikkere naald om het oppervlak van de schedel te kunnen penetreren. Steriliseer het oppervlak van de neus van de muis door deze af te vegen met een alcoholdoekje. Haal de lentivirus-stocks uit de vriezer en laat deze ontdooien op ijs.We hebben in het laboratorium zelf lentivirus geproduceerd met behulp van gevestigde methoden. Bij de ontwikkeling van deze methode hebben we vastgesteld dat een minimale virale titer van 10⁹ infectieuze eenheden per ml vereist is voor een goede transductiesnelheid. Aspireer 2 µL van de lentivirus-stockoplossing in de gesteriliseerde Hamilton-spuit.Plaats de muizenpup op de injectietafel. Pak de huid boven op de kop bij de oren vast en trek deze voorzichtig naar achteren. Wij hebben onze flowhood uitgerust met een dissectiescoop.Om micro-injecties nauwkeurig te kunnen richten, zoekt u op het dorsale schedeloppervlak bij de voorhersenen naar de omtrek van de bulbus olfactorius. Onze doelen voor micro-injecties liggen vlak rond de bulbus olfactorius, maar mogen de bulbus zelf niet omvatten. We geven vier injecties in het reukepitheel van elke pup.Deze posities, weergegeven met blauwe stippen, vereisen dat de naald in een hoek mediaal gericht wordt ingebracht. De twee extra injecties, weergegeven met groene stippen, zijn versprongen geplaatst, meer mediaal en anterieur ten opzichte van de olfactory bulb. Deze injecties kunnen in een caudale hoek worden uitgevoerd.De suggesties voor de hoeken van de naald zijn gedaan met het oog op de ventrale positie van het olfactorische epitheel, dat grotendeels onder de bulbus olfactorius ligt. De loodrechte toegang is daarom beperkt. Voer de naald in via de bovenzijde van de neusholte, ongeveer drie millimeter onder het huidoppervlak.Om het reukepitheel te bereiken. Een ervaren hand zou de afname in weerstand moeten voelen wanneer de luminale ruimte van de neusholte wordt bereikt. Dit gebied moet worden vermeden.Injecteer via micro-injectie 0,5 µL van de virus-voorraadoplossing per positie. Kies opnieuw twee locaties per zijde, zowel links als rechts, voor in totaal vier injecties van 0,5 µL. Dit betekent dat er per muis twee µL virus nodig zijn tijdens één injectiesessie.Wees opnieuw voorzichtig om te voorkomen dat de olfactory bulb blot droogt; dep eventuele resterende virusoplossing of bloed weg dat uit de injectieplaats of de neusgaten kan ontsnappen. Gebruik een ethanoldoekje, gooi de doekjes weg in de container met verdunde bleekoplossing en plaats de geïnjecteerde muis onmiddellijk op de waterbed-incubator voor herstel. Decontamineer de naald en spuit door de sterilisatieprocedure te herhalen die tijdens de voorbereiding is uitgevoerd. Geïnjecteerde muizen kunnen 30 minuten na het herstel op de waterbed-incubator terugkeren naar hun kooi.Deze volledige micro-injectie kan na vier uur opnieuw worden herhaald. Als u het aantal te infecteren olfactorische sensorische neuronen wilt verhogen, kunnen de geïnfecteerde olfactorische sensorische neuronen al na drie dagen over de gehele lengte van de cel worden gevisualiseerd. De dieren worden op het gewenste tijdstip geofferd en geperfuseerd voor observatie.Om de trajecten en axonterminalen van getransduceerde enkelvoudige olfactorische sensorische neuronen te visualiseren, dissecteren we de bulbus olfactorius en maken we coronale coupes met een dikte van 60 micron met behulp van standaardmethoden. De coupe bevat zo alle cellagen van de bulbus olfactorius, inclusief de axonbundels en axonterminalen van de olfactorische sensorische neuronen, die synapteren in glomerulaire structuren aan het oppervlak van de bulbus, ter voorbereiding op floating immunohistochemie. Er worden seriële coupes van de bulbus olfactorius gemaakt, die gezamenlijk met vijf milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing in een kweekschaal van 10 centimeter worden verzameld.Breng de drijvende coupes over naar een conisch buisje van 50 milliliter. Zodra de coupes naar de bodem van het buisje zijn gezakt, wordt de fosfaatgebufferde zoutoplossing afgezogen. Let erop dat de coupes niet worden meegezuigd.Vul uw secties aan met 10 milliliter verse buffer om alle resterende fixeerstof of inbeddingsmateriaal weg te wassen. Pipetteer deze resuspensie onmiddellijk in een conische buis van 15 milliliter, zorg dat alle drijvende secties worden meegenomen, zuig de spoeloplossing af en perforeer de secties met een oplossing van 0,3% Triton X 100 in phosphate buffer saline; plaats dit vervolgens 10 minuten op een schudplatform. Bij kamertemperatuur kunt u vervolgens doorgaan met een standaard immunokleuringsprotocol in dezelfde conische buis; herhaal de vacuüm- en schudstappen naar behoefte voor een vat van deze grootte en behoud een volume van 10 milliliter voor de kleurings- en spoelstappen.Hier is een lijst van antilichamen die we gebruiken om positief getransduceerde olfactorische sensorische neuronen en de algemene populatie olfactorische sensorische neuronen samen te kleuren. Voor een grondige penetratie van de antilichamen in de 60 micron dikke doorsneden van de bulbus wordt aanbevolen om overnacht te incuberen bij vier graden Celsius. De wasstappen mogen elk niet korter zijn dan 20 minuten.Spreid elke sectie voorzichtig uit op een objectglas met een penseel en monteer elk glaasje met flora Mount G aangevuld met een chromatiniekleuringsoplossing. Zorg ervoor dat alle luchtbellen uit het montage medium worden verwijderd. Monteer de secties in rijen om de daaropvolgende screeningsstap te vereenvoudigen.Scan deze lagen van uw immunogekleurde bolsecties op GFP-positieve axonvezels en termini. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop kunnen positief geïnfecteerde zenuwterminals vervolgens worden afgebeeld via confocale microscopie. Het is nuttig om het brandvlak in uw interessegebied te kalibreren met behulp van de DPI- en olfactory marker protein-kanalen.Deze resultaten tonen een enkele axonvezel en axonterminaal van een olfactorisch sensorisch neuron binnen de glomerulus, waarbij CO met olfactorisch marker-eiwit in rood en vlu twee in grijs zijn weergegeven; geïnfecteerde cellichamen van olfactorische sensorische neuronen en hun dendritische knop kunnen ook worden gevisualiseerd binnen het olfactorische epitheel, indien dit weefsel was opgenomen in de dissectie- en immunokleuringsstappen. Deze confocale projectie biedt ons een zeer gedetailleerde morfologie van het axonale extensiepad en de terminale arborisatie van een enkel olfactorisch sensorisch neuron. Men kan de terugbuiging van de axonvezel richting het glomerulaire doel zien, evenals de details van het vertakkingspatroon binnen het glomerulaire neuropiel.De lentivirale microinjectiemethode maakt de visualisatie van individuele axonale morfologieën van olfactorische sensorische neuronen mogelijk en faciliteert studies naar de manipulatie van genexpressie; lentivirale transductie resulteert in een stabiele genomische integratie van constructen. Lentivirus infecteert naburige cellen niet transsynaptisch. Visualisatie kan al na drie dagen worden bereikt; het is bevestigd dat dit ten minste drie maanden aanhoudt en het blijft waarschijnlijk gedurende langere perioden behouden.Olfactorische sensorische neuronen raken niet gemakkelijk geïnfecteerd door nasale infusie van een lentivirusoplossing. Daarom is micro-injectie via het oppervlak vereist in deze procedure. Dat is onze procedure voor lentivirus micro-injectie.Ik hoop dat u al deze informatie nuttig heeft gevonden bij het verkrijgen van uw eigen enkelcelmorfologieën. Veel succes met uw onderzoek.

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De temporele en ruimtelijke resolutie van de genetische manipulaties bepaalt het spectrum van biologische fenomenen die ze kunnen verstoren. Hier gebruiken we tijdelijk en ruimtelijk...

Targeting bulbus olfactorius Neuronen gebruik van Gecombineerd In Vivo Elektroporatie en Gal4-Based Enhancer Trap zebravis Lines

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Source: Kozin, E. D., et.al. Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates virus-mediated gene transfer into the mouse dorsal cochlear nucleus (DCN) to enable light-induced auditory stimulation. A viral vector encoding opsin, a light-sensitive ion channel, is injected into the DCN following a craniotomy and cerebellar aspiration for direct access. The expressed opsins allow neurons to be...

Virus-Mediated Gene Transfer Into the Mouse Dorsal Cochlear Nucleus for Light-Induced Auditory Stimulation

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

We beschrijven een protocol voor in vivo markering van olfactorische sensorische neuronen door middel van elektroporatie en vervolgens confocale laser-scanning of multifotonmicroscopie om de neuronale morfologie en de ontwikkeling ervan in de loop van de tijd te visualiseren.

Het olfactorisch systeem als model om axonale groeipatronen en morfologie Bestudeer In Vivo

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Het huidige protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het traceren van ventrale tegmentale gebied (VTA) glutamaatprojecties naar de hippocampus. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen werd gecombineerd met CA1-opname om aan te tonen hoe VTA-glutamaatterminals ca1-putatieve piramidale vuursnelheid in vivo moduleren.

Gecombineerde In Vivo anatomische en functionele tracing van Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in de Hippocampus

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

We beschrijven hier methoden voor het induceren en analyseren van olfactorische ervaring-afhankelijke remodellering van synaptische glomeruli van de antennekwab in de juveniele hersenen van Drosophila .

Ervaringsafhankelijke hermodellering van juveniele reukbare sensorische neuronen Synaptische connectiviteit van de hersenen in een kritieke periode in het vroege leven

Leer lentivirale genetische manipulatie en visualisatie van enkele olfactorische sensorische neuronen in vivo. Deze methode onthult axonale trajecten en terminale vertakkingen in het complexe reukzintuig.

Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo

Meer video's verkennen