Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo
22 mei 2011
We presenteren een lentivirale techniek voor genetische manipulatie en visualisatie van een olfactorische sensorische neuron axon en de terminal arborization In vivo.
Een van de uitdagingen bij het bestuderen van ontwikkeling in de neurowetenschap is het vastleggen van dendritische en axonale morfologieën op eencellig niveau in vivo. In het reuksysteem strekken reukzintuiglijke neuronen hun axonen uit van het reukepitheel in de neus naar de reukbol in de hersenen. Aangezien meerdere reukzintuiglijke neuronen naar de reukbol projecteren, fasciceren ze in bundels.
Dit bemoeilijkt de studie van individuele axontrajecten en hun terminale morfologieën. We hebben een methode ontwikkeld om enkelvoudige reukzintuiglijke neuronen in vivo te visualiseren door micro-injectie van een GFP-construct. Dragend lentivirus.
Succesvolle transductie met lentivirus verlicht de volledige lengte van het reukzintuiglijke axon, inclusief de terminale arbor. Naast het visualiseren van enkelvoudige reukzintuiglijke neuronen, stelt deze methode ons in staat om genexpressie van een bepaald gen van belang te manipuleren om zijn functie in een in vivo-context te bestuderen. Deze lentivirusprocedure is bioveiligheidsniveau twee en moet worden uitgevoerd in een laminaire flowkap.
Om een steriele omgeving te behouden, spuit alles wat in de kap wordt ingebracht met 70% ethanol in de kap, bereid en verwarm een waterbed van 37 graden minimaal 20 minuten voor. Vóór injectie. Sluit een plastic opbergzak half gevuld met water en zet deze op een lege verwarmingsblok incubator.
Dit zal muizen toelaten te herstellen na injectie. Vul een biogevaarlijk afvalcontainer met 10% bleekmiddel om al het virus blootgestelde materiaal te decontamineren. Vanaf deze procedure, bereid een kleine open schaal met 70% ethanol en een tweede schaal met steriel gedistilleerd water.
In een laminaire flowkap zullen we een Hamilton-spuit met een capaciteit van vijf microliters gebruiken met een naald van 33 gauge. Dit specifieke model stelt u in staat om de weerstand van de plunjer aan te passen door een spanningsknop aan de bovenkant van de plunjerkamer te draaien. Deze functie biedt controle over het micro-injectievolume om de naald en de spuitkamer te steriliseren.
Zuig herhaaldelijk ethanol uit de schaal op en spuit het meerdere keren weg. Spoel de spuitcartridge door steriel water meerdere keren op te zuigen en weg te spuiten. Plaats de spuit veilig opzij in de flowkap.
Plaats alcoholdoekjes bij het injectiestation. Bereid een injectiefase voor die een verhoogd oppervlak biedt dat de positionering van de muis vergemakkelijkt. Men kan een omgekeerde 10 centimeter cultuurschaal gebruiken die bedekt is met Kim-doekjes.
Muizenpups kunnen worden verdoofd door hypothermie tot de leeftijd van spenen. Knip een vinger van een rubberen handschoen af en plaats de muizenpup in de vingeruitsnede. Plaats vervolgens vijf minuten op ijs.
De handschoen voorkomt huidbrand die zou optreden bij directe huidcontact met het ijs. Test voor grondige anesthesie door de achter- en voorpoten van de pup te knijpen om er zeker van te zijn dat het dier niet reageert. We zijn nu klaar voor micro-injectie van lentivirus. We zullen demonstreren met een neonatale pup.
Als een oudere muis wordt gebruikt, moet de naald van 33 gauge worden vervangen door een dikkere naald om het oppervlak van de schedel te doorboren. Steriliseer het oppervlak van de muizenneus door het af te vegen met een alcoholpad. Haal lentivirusvoorraden uit de vriezer en ontdooi op ijs.
We hebben het lentivirus zelf in het laboratorium geproduceerd met behulp van gevestigde methoden. Bij het ontwikkelen van deze methode hebben we ontdekt dat een minimale virale titer van 10 tot de negende besmettelijke eenheden per mil vereist is voor een goede transductiesnelheid. Zuig twee microliters lentivirusvoorraadoplossing op in de gesteriliseerde Hamilton-spuit.
Plaats de muizenpup op de injectiefase. Grijp de huid boven het hoofd bij de oren en trek voorzichtig terug. We hebben onze flowkap uitgerust met een dissectiemicroscoop.
Om micro-injecties nauwkeurig te kunnen richten, zoek op de dorsale schedeloppervlakte in de voorhersenen naar een omtrek van de reukbol. Onze micro-injectiedoelen omringen de reukbol nauw, maar mogen de bol zelf niet omvatten. We geven vier injecties in het reukepitheel van elke pup.
Deze posities, weergegeven met blauwe stippen, vereisen dat de naald onder een hoek wordt ingebracht, gericht mediaal. De aanvullende twee injecties, weergegeven met groene stippen, zijn verspreid, meer mediaal en anterior ten opzichte van de reukbol. Deze injecties kunnen schuin worden geplaatst.
De suggesties voor de naaldafstand worden gemaakt met inachtneming van de ventrale positionering van het reukepitheel, dat zich meestal onder de reukbol bevindt. Perpendiculaire toegang is dus beperkt. Steek de naald door de bovenkant van de neusholte ongeveer drie millimeter onder het huidoppervlak.
Om het reukepitheel te bereiken. Een getrainde hand zou de daling in weerstand moeten voelen wanneer de luminale ruimte van de neusholte is bereikt. Dit gebied moet worden vermeden.
Micro-injecteer 0,5 microliter virusvoorraadoplossing per positie. Kies opnieuw twee sites per zijde, zowel links als rechts, vier injecties van elk 0,5 microliter. Elke per muis betekent twee microliter virus nodig per muis in een enkele injectiesessie.
Wees opnieuw voorzichtig om het reukbolblok niet droog te injecteren, veeg eventuele resterende virusoplossing of bloed dat uit de injectieplaats of neusopeningen kan ontsnappen. Gebruik een ethanoldoekje, gooi doekjes weg in de verdunde vloeibare bleekmiddelcontainer, plaats de geïnjecteerde muis onmiddellijk op de waterbedincubator voor herstel. Decontaminatie naald-spuit door herhaling van de sterilisatieprocedure uitgevoerd tijdens de voorbereiding. Geïnjecteerde muizen kunnen 30 minuten na herstel op de waterbedincubator in hun kooi worden teruggeplaatst.
Deze volledige micro-injectie kan over vier uur worden herhaald. Als u het aantal reukzintuiglijke neuronen dat geïnfecteerd zal worden, wilt verhogen, kunnen geïnfecteerde reukzintuig
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe lentivirale techniek voor de genetische manipulatie en visualisatie van enkelvoudige olfactorische sensorische neuron-axonen en hun terminale arborisaties in vivo. Deze methode gaat in op de uitdagingen van het bestuderen van individuele axon-trajecten binnen het complexe olfactorische systeem.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genetische manipulatie
- Olfactorisch systeem
Achtergrond
- Het bestuderen van dendritische en axonale morfologieën op enkelcellig niveau is uitdagend.
- Olfactorische sensorische neuronen projecteren hun axonen naar de olfactorische bulb en vormen bundels.
- Deze bundeling bemoeilijkt de visualisatie van individuele axon-trajecten.
- Bestaande methoden kunnen enkelvoudige neuronen mogelijk niet effectief isoleren en visualiseren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het visualiseren van enkelvoudige olfactorische sensorische neuronen in vivo.
- Om het begrip van axon-trajecten en terminale morfologieën te verbeteren.
- Om een hulpmiddel te bieden voor het bestuderen van het olfactorische systeem op cellulair niveau.
Gebruikte methoden
- Micro-injectie van een GFP-construct.
- Gebruik van lentivirus voor genetische manipulatie.
- In vivo visualisatietechnieken.
- Analyse van axon- en terminale arborisatiepatronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van enkelvoudige olfactorische sensorische neuron-axonen.
- Gedetailleerde observatie van axon-terminale arborisaties.
- Demonstratie van de effectiviteit van de lentivirale techniek.
- Inzichten in de complexiteit van olfactorische neuron-projecties.
Conclusies
- De lentivirale techniek is een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methode maakt het mogelijk om individuele neuron-morfologieën in vivo te bestuderen.
- Verdere toepassingen kunnen het begrip van het olfactorische systeem verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Precise genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neurons in vivo enables direct interrogation of gene function during neural circuit development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neurodevelopmental pathways, informing early-stage portfolio decisions. The method's temporal control and single-cell resolution provide predictive confidence for translational neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of candidate genes in neural circuit formation at single-cell resolution.
- Supports mechanistic de-risking by linking gene perturbation to axonal morphology and targeting outcomes.
- Facilitates hypothesis-driven studies of molecular pathways underlying sensory neuron development.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for quantitative assessment of gene overexpression or knockdown effects in vivo.
- Delivers reproducible visualization of neuronal morphology for assay standardization.
- Enables rapid screening of genetic constructs with observable phenotypic outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling manipulation and tracking of neuronal development in vivo.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by allowing longitudinal studies of gene function.
- Offers predictive value for translational biomarker identification based on morphological phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This lentiviral microinjection method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging genetic target validation and phenotypic screening in neural systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct gene manipulation and morphological readout in olfactory neurons.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for evaluating genetic perturbations in vivo.
- Analytics: Delivers high-resolution morphological data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models by enabling in vivo studies of neuronal development and targeting.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic manipulation and visualization across diverse neural targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neural development studies.
- Operational Value: Standardizes in vivo genetic manipulation and visualization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking gene function to observable phenotypes in relevant biological systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on functional and morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in vivo microinjection and biosafety level two procedures.
- Demands access to fluorescence microscopy and confocal imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection, staining, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different neuronal populations or developmental stages.
- Limited to systems where direct microinjection and single-cell visualization are feasible.
