Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro

Het testen van eiwitten. Eiwitinteractie is onmisbaar voor de dissectie van eiwitfunctionaliteit. Deze video introduceert een in vitro eiwit-eiwitbindingsassay om de interactie te testen tussen een membraan en geïmmobiliseerd eiwit met een oplosbaar eiwit.

Eerst worden fusie-eiwitten gekloond, geëxpresseerd en geëxtraheerd. Het gelabelde onoplosbare eiwit wordt geïmmobiliseerd op een nitrocellulosemembraan en behandeld om gerefold naar zijn native conformatie te worden. Het membraan wordt vervolgens bemonsterd met gelabelde oplosbare eiwitten en immunoblotting wordt uitgevoerd om de eiwitten te detecteren.

Als de gelabelde eiwitten interageren, worden ze gevangen door het eiwit dat op het membraan is geïmmobiliseerd, en het signaal van de immunoblotting zal worden waargenomen. Dus, deze assay biedt een betrouwbare methode om de interactie tussen een onoplosbaar eiwit en een eiwit in oplossing te testen. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande vaten zoals GST pull down, is dat u op betrouwbare wijze de binding tussen onoplosbaar eiwit en oplosbaar eiwit in vitro kunt beoordelen.

De eerste stap van deze procedure is om genetisch gelabelde eiwitten te genereren voor detectie. Begin met het klonen van het eiwit dat geïmmobiliseerd zal worden op het membraan. Verwijs hier naar als pro Im voor geïmmobiliseerd eiwit in een expressievector, die een groot label codeert zoals GST, de lege expressievector, die alleen voor het label codeert, zal worden gebruikt als een negatieve controle van geïmmobiliseerd eiwit, en wordt verwezen als pro IM nc.

Kloon vervolgens het eiwit dat zal worden gebruikt als een oplosbare sonde in een expressievector, die een ander label codeert zoals strep twee. Dit zal worden aangeduid als prosol voor oplosbaar eiwit als een negatieve controle, kloon, een negatieve controle oplosbaar eiwit in dezelfde expressievector. Dit zal worden aangeduid als Prosol NC voor oplosbaar eiwit negatieve controle.

Gebruik vervolgens een eiwitexpressiesysteem zoals een coli of balo virus om de gelabelde eiwitten te exprimeren, het expressiesysteem dat wordt gebruikt, moet zorgvuldig worden gekozen op basis van de vereiste voor post-translationele modificaties. Extraheer de geëxpresseerde eiwitten uit het organisme van keuze. Voor pro IM en pro I mnc Resus.

Suspendeer de cellen in SDS pagina laadbuffer met proteaseremmercocktail. Kook vervolgens de cellen gedurende vijf minuten, centrifugeer ze dan om het precipitaat te verwijderen om Prosol en prosol NC te extraheren. Gebruik standaardprocedures. De pro IMS kunnen worden geëxtraheerd onder denaturerende omstandigheden omdat de eiwitten na immobilisatie in het nitrocellulosemembraan opnieuw worden gevouwen.

Prosol moet echter worden geëxtraheerd om een native bevestiging te geven, omdat ze zullen worden toegevoegd aan het bindingsbuffer zodra de gelabelde eiwitten zijn geëxtraheerd. Bepaal de concentratie van de recombinante eiwitten met behulp van een standaardmethode zoals de BioRad eiwitassaykit. Als een ruw extract in plaats van gezuiverd eiwit wordt gebruikt voor de assay.

Schat de concentratie van het eiwit van belang door densitometrie van de overeenkomstige band op een kumasi gekleurde SDS polyacrylamide gel te scannen. Gebruik bekende concentraties BSA als referentie. Plot vervolgens de standaardcurve op basis van de signaalintensiteiten gemeten door de scannensitometrie van de BSA en bereken de hoeveelheid eiwit die in het ruwe extract aanwezig is.

De volgende stap van de procedure is om pro Iam en pro IAM NC op het membraan te immobiliseren. Begin met het laden van één microgram, elk van pro Iam en pro IAM NC extracten in duplicaat op een SDS polyacrylamide gel. Na elektroforese, verwijder de gel van de glazen platen en plaats het in 100 milliliter transferbuffer, en incubeer vervolgens met zachte agitatie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Na de incubatie, voer een western blot uit om de eiwitten over te brengen naar een nitrocellulosemembraan na de overdracht om de membraangebonden eiwitten te laten refolden. Plaats het membraan in 15 milliliter buffer A en incubeer het met zachte agitatie. Om resterend SDS te verwijderen, incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.

Na de incubatie verwijdert u voorzichtig het membraan van de buffer. Plaats vervolgens het membraan in 25 milliliter denaturatiebuffer. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie.

Tijdens de incubatie zal het nitrocellulosemembraan ondoorzichtig worden. Breng vervolgens met behulp van een pincet het membraan over naar 25 milliliter TBS en incubeer gedurende vijf minuten met zachte agitatie. Tijdens deze stap keert het membraan terug naar zijn oorspronkelijke witte kleur.

Breng vervolgens het membraan over naar 25 milliliter bindingsbuffer. Incubeer bij vier graden Celsius met zachte agitatie gedurende de nacht. Vervolgens zal het oplosbare eiwit worden gebruikt om het membraan te sonderen voor het geïmmobiliseerde eiwit.

Bereid eerst de hybridisatiebuffers verdund een tot 10 microgram van prosol en prosol NC in afzonderlijke buizen met 10 milliliter verse bindingsbuffer. Breng vervolgens de buffer over naar een hybridisatiezak. Snijd vervolgens het membraan in twee stroken, beide met pro IM en pro IAM nc.

Deze membranen zullen in de hybridisatiebuffer worden geplaatst. Breng elk membraan over in de prosol of prosol NC hybridisatieoplossing en incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Verwijder de membranen uit de hybridisatieoplossingen en spoel drie keer gedurende 15 minuten in TBS.

Om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren, blokkeer het membraan met 2,5% volle melk in TBST gedurende één uur. Na de incubatie, plaats de geblokkeerde membranen in de primaire antilichaamoplossing. Hier wordt anti-strep twee polyklonaal konijnenantilichaam gebruikt.

Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie na de incubatie. Spoel de membranen in 20 milliliter TBST gedurende 15 minuten en twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Plaats vervolgens de membranen in de HRP-geconjugeerde secundaire antilichaamoplossing Hier wordt een anti-konijn IgG-antilichaam geconjugeerd aan HRP gebruikt.</