Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro
14 augustus 2011
Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we een In vitro Eiwit-eiwit binding assay aan een membraan-geïmmobiliseerde eiwit probe met een oplosbare proteïne. Deze test geeft een betrouwbare methode om de interactie tussen een onoplosbaar eiwit en een eiwit in oplossing te testen.
Het testen van eiwitten. Eiwitinteractie is onmisbaar voor de dissectie van eiwitfunctionaliteit. Deze video introduceert een in vitro eiwit-eiwitbindingsassay om de interactie te testen tussen een membraan en geïmmobiliseerd eiwit met een oplosbaar eiwit.
Eerst worden fusie-eiwitten gekloond, geëxpresseerd en geëxtraheerd. Het gelabelde onoplosbare eiwit wordt geïmmobiliseerd op een nitrocellulosemembraan en behandeld om gerefold naar zijn native conformatie te worden. Het membraan wordt vervolgens bemonsterd met gelabelde oplosbare eiwitten en immunoblotting wordt uitgevoerd om de eiwitten te detecteren.
Als de gelabelde eiwitten interageren, worden ze gevangen door het eiwit dat op het membraan is geïmmobiliseerd, en het signaal van de immunoblotting zal worden waargenomen. Dus, deze assay biedt een betrouwbare methode om de interactie tussen een onoplosbaar eiwit en een eiwit in oplossing te testen. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande vaten zoals GST pull down, is dat u op betrouwbare wijze de binding tussen onoplosbaar eiwit en oplosbaar eiwit in vitro kunt beoordelen.
De eerste stap van deze procedure is om genetisch gelabelde eiwitten te genereren voor detectie. Begin met het klonen van het eiwit dat geïmmobiliseerd zal worden op het membraan. Verwijs hier naar als pro Im voor geïmmobiliseerd eiwit in een expressievector, die een groot label codeert zoals GST, de lege expressievector, die alleen voor het label codeert, zal worden gebruikt als een negatieve controle van geïmmobiliseerd eiwit, en wordt verwezen als pro IM nc.
Kloon vervolgens het eiwit dat zal worden gebruikt als een oplosbare sonde in een expressievector, die een ander label codeert zoals strep twee. Dit zal worden aangeduid als prosol voor oplosbaar eiwit als een negatieve controle, kloon, een negatieve controle oplosbaar eiwit in dezelfde expressievector. Dit zal worden aangeduid als Prosol NC voor oplosbaar eiwit negatieve controle.
Gebruik vervolgens een eiwitexpressiesysteem zoals een coli of balo virus om de gelabelde eiwitten te exprimeren, het expressiesysteem dat wordt gebruikt, moet zorgvuldig worden gekozen op basis van de vereiste voor post-translationele modificaties. Extraheer de geëxpresseerde eiwitten uit het organisme van keuze. Voor pro IM en pro I mnc Resus.
Suspendeer de cellen in SDS pagina laadbuffer met proteaseremmercocktail. Kook vervolgens de cellen gedurende vijf minuten, centrifugeer ze dan om het precipitaat te verwijderen om Prosol en prosol NC te extraheren. Gebruik standaardprocedures. De pro IMS kunnen worden geëxtraheerd onder denaturerende omstandigheden omdat de eiwitten na immobilisatie in het nitrocellulosemembraan opnieuw worden gevouwen.
Prosol moet echter worden geëxtraheerd om een native bevestiging te geven, omdat ze zullen worden toegevoegd aan het bindingsbuffer zodra de gelabelde eiwitten zijn geëxtraheerd. Bepaal de concentratie van de recombinante eiwitten met behulp van een standaardmethode zoals de BioRad eiwitassaykit. Als een ruw extract in plaats van gezuiverd eiwit wordt gebruikt voor de assay.
Schat de concentratie van het eiwit van belang door densitometrie van de overeenkomstige band op een kumasi gekleurde SDS polyacrylamide gel te scannen. Gebruik bekende concentraties BSA als referentie. Plot vervolgens de standaardcurve op basis van de signaalintensiteiten gemeten door de scannensitometrie van de BSA en bereken de hoeveelheid eiwit die in het ruwe extract aanwezig is.
De volgende stap van de procedure is om pro Iam en pro IAM NC op het membraan te immobiliseren. Begin met het laden van één microgram, elk van pro Iam en pro IAM NC extracten in duplicaat op een SDS polyacrylamide gel. Na elektroforese, verwijder de gel van de glazen platen en plaats het in 100 milliliter transferbuffer, en incubeer vervolgens met zachte agitatie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Na de incubatie, voer een western blot uit om de eiwitten over te brengen naar een nitrocellulosemembraan na de overdracht om de membraangebonden eiwitten te laten refolden. Plaats het membraan in 15 milliliter buffer A en incubeer het met zachte agitatie. Om resterend SDS te verwijderen, incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
Na de incubatie verwijdert u voorzichtig het membraan van de buffer. Plaats vervolgens het membraan in 25 milliliter denaturatiebuffer. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
Tijdens de incubatie zal het nitrocellulosemembraan ondoorzichtig worden. Breng vervolgens met behulp van een pincet het membraan over naar 25 milliliter TBS en incubeer gedurende vijf minuten met zachte agitatie. Tijdens deze stap keert het membraan terug naar zijn oorspronkelijke witte kleur.
Breng vervolgens het membraan over naar 25 milliliter bindingsbuffer. Incubeer bij vier graden Celsius met zachte agitatie gedurende de nacht. Vervolgens zal het oplosbare eiwit worden gebruikt om het membraan te sonderen voor het geïmmobiliseerde eiwit.
Bereid eerst de hybridisatiebuffers verdund een tot 10 microgram van prosol en prosol NC in afzonderlijke buizen met 10 milliliter verse bindingsbuffer. Breng vervolgens de buffer over naar een hybridisatiezak. Snijd vervolgens het membraan in twee stroken, beide met pro IM en pro IAM nc.
Deze membranen zullen in de hybridisatiebuffer worden geplaatst. Breng elk membraan over in de prosol of prosol NC hybridisatieoplossing en incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Verwijder de membranen uit de hybridisatieoplossingen en spoel drie keer gedurende 15 minuten in TBS.
Om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren, blokkeer het membraan met 2,5% volle melk in TBST gedurende één uur. Na de incubatie, plaats de geblokkeerde membranen in de primaire antilichaamoplossing. Hier wordt anti-strep twee polyklonaal konijnenantilichaam gebruikt.
Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie na de incubatie. Spoel de membranen in 20 milliliter TBST gedurende 15 minuten en twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Plaats vervolgens de membranen in de HRP-geconjugeerde secundaire antilichaamoplossing Hier wordt een anti-konijn IgG-antilichaam geconjugeerd aan HRP gebruikt.</
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel introduceert een in vitro eiwit-eiwit bindingstest die is ontworpen om interacties te onderzoeken tussen een membraangeïmmobiliseerd eiwit en een oplosbaar eiwit. De methode biedt een betrouwbare aanpak voor het testen van interacties met onoplosbare eiwitten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Eiwit-eiwit interacties
- Biochemische tests
- Membraaneiwitten
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitfunctionaliteit vereist het testen van eiwitinteracties.
- Onoplosbare eiwitten stellen vaak uitdagingen in interactiestudies.
- In vitro tests kunnen gecontroleerde omgevingen bieden voor het bestuderen van deze interacties.
- Membraangeïmmobiliseerde eiwitten zijn cruciaal voor bepaalde bindingstests.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het onderzoeken van interacties tussen membraangeïmmobiliseerde en oplosbare eiwitten.
- Om de betrouwbaarheid van eiwitinteractietests te verbeteren.
- Om het onderzoek van onoplosbare eiwitten in een oplossingscontext te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Klonen en expressie van fusie-eiwitten.
- Extractie van getaggede onoplosbare eiwitten.
- Immobilisatie van eiwitten op nitrocellulose membranen.
- Immunoblotting om interacties met oplosbare eiwitten te detecteren.
Belangrijkste resultaten
- De test toonde met succes interacties aan tussen geïmmobiliseerde en oplosbare eiwitten.
- Immunoblotting bevestigde de aanwezigheid van specifieke eiwitinteracties.
- De methode bleek betrouwbaar voor het bestuderen van onoplosbare eiwitinteracties.
- De resultaten ondersteunen de haalbaarheid van in vitro tests voor eiwitinteractiestudies.
Conclusies
- De ontwikkelde test is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van eiwitinteracties.
- Het lost uitdagingen op die gepaard gaan met het bestuderen van onoplosbare eiwitten.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot verschillende eiwitinteractiestudies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Validating protein-protein interactions is essential for target de-risking in early discovery, particularly when studying insoluble or membrane-associated targets. The protein membrane overlay assay enables reliable in vitro assessment of interactions between soluble and insoluble proteins, addressing a key limitation of solubility-dependent methods like GST pull-down or Co-IP. When combined with orthogonal approaches such as BiFC, it supports mechanistic confidence and reduces false-positive risk in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving insoluble or membrane-embedded targets that are inaccessible to standard pull-down assays.
- Operational Value: Provides a complementary, principle-independent method to confirm interactions observed in live-cell systems like BiFC, reducing false-positive risk.
- Predictive Value: Supports target triage by confirming direct binding between soluble effectors and insoluble receptors or scaffolds under controlled conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates immobilized protein strips on nitrocellulose membrane that can be stored and reused for multiple rounds of soluble protein probing.
- Quantitative Output: Enables immunoblot-based detection with chemiluminescent signal proportional to bound soluble protein, supporting semi-quantitative comparison across conditions.
- Platform Adaptability: Compatible with various affinity tags (e.g., GST, Strep-II) allowing flexible detection strategies for diverse target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validates interactions identified in vivo (e.g., BiFC in plant epidermal cells) using a biochemical method, strengthening target-disease relevance.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed co-localization or complementation reflects direct binding versus indirect association in complex environments.
- Preclinical Alignment: Supports target validation in disease-relevant systems by confirming direct interaction between a viral movement protein and a host interactor, informing host-pathogen intervention strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization, particularly for targets where solubility complicates biochemical validation. It enables progression from phenotypic hits or genetic interactors to mechanistically de-risked targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming direct interaction between a soluble probe (e.g., Strep-II tagged ANK) and an immobilized insoluble protein (e.g., GST-TMV MP).
- Screening: Enables preparation of standardized, refolded immobilized protein membranes for consistent probing across multiple soluble protein candidates.
- Analytics: Generates immunoblot signals that allow comparison of binding intensity between test and control conditions (e.g., specific vs. nonspecific interactors).
- Translational Research: Connects in vivo interaction data (e.g., BiFC signal accumulation at plasma membrane) to in vitro biochemical validation, reinforcing target validity.
- Enterprise Reuse: Immobilized membranes can be blocked, probed, stripped, and reprobed, supporting iterative testing and cross-project reuse of validated targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target engagement data by validating interactions independent of cellular context or overexpression artifacts.
- Operational Value: Uses standard molecular biology and immunoblotting infrastructure, requiring no specialized equipment beyond gel electrophoresis and blotting systems.
- Strategic Value: Reduces risk of advancing false-positive interactions by providing an orthogonal, biochemical confirmation step.
- Portfolio Impact: Enables more accurate go/no-go decisions in target prioritization by confirming direct binding between drug-target candidates and effector proteins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein expression, and immunoblotting techniques.
- Dependent on access to SDS-PAGE, electrotransfer systems, and chemiluminescent detection platforms.
- Necessitates optimization of refolding conditions post-immobilization to maintain native conformation of the immobilized protein.
- Requires careful design of tag controls (e.g., GST-only, Strep-II NC) to distinguish specific binding from tag-mediated artifacts.
- Limited to interactions detectable under non-denaturing binding buffer conditions; may not capture interactions requiring specific post-translational modifications or co-factors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Expression and Extraction of the Proteins
3:22
Immobilization of ProIM and ProIMnc on the Membrane
3:54
Re-folding of Membrane-bound Proteins
4:49
Probing the ProIM by ProSOL
5:33
Visualizing Protein-protein Interaction by Immunoblotting
7:06
Representative Results
8:20
Conclusion
