Name: Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer een in vitro eiwitmembraan-overlaytest om interacties tussen onoplosbare en oplosbare eiwitten te onderzoeken met immunoblotting. Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor eiwitbindingsstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door subsidies van NIH, USDA Nationaal Instituut voor Voedsel-en Landbouworganisatie, NSF, BARD, DOE, en BSF naar VC

1. Expressie en extractie van de eiwitten <ol><li> Differentieel tag de eiwitten te testen op hun detectie. Label het eiwit te worden geïmmobiliseerd op het membraan (ProIM) met een tag van een groter formaat (bijvoorbeeld GST), en de niet-gefuseerde tag kan gebruikt worden als een geïmmobiliseerde negatieve controle (ProIMnc). Label het eiwit te gebruiken als een oplosbaar sonde (ProSol) met ofwel een grote of een kleine tag. Zekering van dezelfde tag om een ​​passende negatieve controle oplosbare proteïne (ProSOLnc) en omvatten in de interactie test om de specificiteit van de gedetecteerde binding te bevestigen. </li><li> Kies de eiwitexpressie systeem gemerkte eiwitten te drukken, dat wil zeggen, E. coli, baculovirus, etc., afhankelijk van de behoefte van potentiële post-translationele modificaties en de opbrengsten van de eiwitten. </li><li> Extract ProIM en ProIM nc uit het organisme van de keuze (stap 1.2) met behulp van SDS-PAGE laadbuffer (20% glycerol, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) met proteïnase inhibitor cocktail. Laat de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, voeg 0,5% van de 2-mercaptoethanol en kook gedurende 5 minuten. </li><li> Extract ProSol en ProSol nc uit het organisme van de keuze (stap 1.2) met behulp van een standaard protocollen 16. Deze eiwitten moet gemakkelijk oplosbaar zijn in de bindende buffer (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% BSA, 0,1% Tween 20) wordt gebruikt in de stap 4.1. </li><li> Bepaal de concentratie van de recombinante eiwitten met behulp van een standaard-methode, zoals Bio-Rad eiwit assay kit. zoals de Bio-Rad eiwit assay kit. Als ruw extract, in plaats van gezuiverd eiwit, wordt gebruikt voor de test, een schatting van de concentratie van het eiwit van belang in dit extract door het scannen densitometrie van de desbetreffende band op een SDS-polyacrylamide gel gekleurd met Coomassie Brilliant Blue R-250 en het gebruik van bekende concentraties van BSA als referentie. </li></ol> 2. Immobilisatie van ProIM en ProIMnc op het membraan <ol><li> Resolve twee sets van extracten, die elk 1 ug van ProIM en ProIM nc op een SDS-polyacrylamide gel volgens het standaard protocol 16. </li><li> Na elektroforese, plaatst u de overdracht van de gel in 100 ml van de overdracht buffer (60 mM glycine, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, 20% MeOH) en incubeer onder zacht schudden gedurende 20 min bij kamertemperatuur. </li><li> Electroforetisch de eiwitten in de gel naar een nitrocellulose membraan volgens het standaard protocol 16. </li></ol> 3. Re-vouwen van membraan-gebonden eiwitten <ol><li> Na Electroforetisch, incubeer het membraan gedurende 15 minuten in 15 ml buffer A (30 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,05% Tween 20) zacht schudden om de resterende SDS te verwijderen. </li><li> Na het aftappen zorgvuldig, overdracht van de membraan tot 25 ml van denaturatie buffer (7 M guanidinehydrochloride, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. (Opmerking: De nitrocellulose membraan ondoorzichtig wordt bij incubatie in de denaturatie buffer). en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Overdracht van het membraan tot 25 ml van de TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) en incubeer onder zacht schudden gedurende 5 min (Opmerking: Tijdens deze stap, het membraan herwint zijn oorspronkelijke witte kleur). </li><li> Overdracht van het membraan tot 25 ml van bindende buffer (zie stap 1.2) en incuberen bij 4 ° C onder zacht schudden voor overnachting. </li></ol> 4. Onderzoek naar de ProIM door ProSol <ol><li> Snijd de membraan in twee stroken, zowel met ProIM en ProIM nc. </li><li> Maak de ProSol en ProSOLnc hybridisatie oplossingen door verdunning van de voorbereiding met 1-10 ug van zowel ProSol of ProSOLnc in 10 ml vers bindingsbuffer. Overdracht elk membraan in de ProSol of ProSOLnc hybridisatie-oplossing en incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Haal de membranen van de hybridisatie-oplossingen en spoel drie keer voor 15 minuten elk in TBS. </li></ol> 5. Visualiseren van eiwit-eiwit interacties door immunoblotting <ol><li> Blokkeer de membraan met 2,5% afgeroomde melk in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun het primaire antilichaam (anti-strepII polyklonaal konijn antilichaam) in 0,5% afgeroomde melk in TBST op de concentratie aanbevolen door de fabrikant. </li><li> Plaats de geblokkeerde membranen in het antilichaam oplossing, en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden. </li><li> Spoel de membranen in 20 ml TBST gedurende 15 minuten, en tweemaal gedurende 5 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Verdun de secundaire antilichaam (anti-konijn IgG antilichaam) geconjugeerd met mierikswortel peroxidase (HRP) in 0,5% afgeroomde melk in TBST op de concentratie aanbevolen door de fabrikant. Plaats de membranen in het secundaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Spoel de membranen in 20 ml TBST gedurende 15 minuten, en tweemaal gedurende 5 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Na de laatste spoeling in TBS, visualiseren van de eiwit-eiwit interacties met behulp van een chemiluminescentie HRP substraat (bijvoorbeeld, Millipore Immobilon westerse chemiluminescent HRP-substraat). </li><li> Probe dezelfde membranen met het primaire antilichaam voor de tag gefuseerd met ProIM, gevolgd door de juiste secundaire antilichaam zoals beschreven in stappen 5,1 tot 5,4. Visualiseer ProIM en ProIMnc zoals beschreven in stap 5.5 om de identiteit van de bands die in het eiwit-membraan overlay test (stap 5.5) te valideren. In de meeste gevallen, strippen is niet nodig, omdat het signaal verkregen door deze stap is veel sterker dan de resterende signaal dat wordt verkregen uit stap 5.5. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: De ANK-MP interactie werd waargenomen door BiFC in tabak epidermale cellen (Figuur 1A). Omdat de MP is een zeer slecht oplosbaar eiwit, uitgedrukt in bacteriën of in planten, werd het eiwit membraan overlay test aangenomen om deze interactie in vitro (figuur 1B) te valideren. Eiwitextracten met 1 ug van het GST-MP (ProIM) of niet-gefuseerde GST (ProIM nc) werden opgelost door SDS-polyacrylamide gel elektroforese, gevolgd door Electroforetisch naar een nitrocellulose membraan. Wanneer deze ProIMs waren gemerkt met oplosbare ANK-strepII (ProSol), GST-MP, maar niet ongefuseerde GST, tentoongesteld binding (Figuur 1B, lanen 1, 2, te vergelijken met lanen 5, 6). Bovendien, als dezelfde van ProIMs waren gemerkt met een niet-verwante ProSOLnc, dat wil zeggen, Arabidopsis cytoplasmatische NADH kinase getagd strepII (NADH3-strepII), geen binding werd niet waargenomen, hetgeen opnieuw aantoont de specificiteit van de ANK-MP interactie (figuur 1B, lanen 3, 4). <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Specifieke binding van tabak ANK aan TMV MP in vivo en in vitro. (A) ANK-MP interactie in levende tabak epidermale cellen zoals gedetecteerd door BiFC. Sterk YFP signaal werd gereconstrueerd toen MP en ANK, gefuseerd met C-terminale en N-terminale helft van YFP, werden respectievelijk coexpressed in tabak epidermis na microbombardment van hun coderende genen. Dit BiFC signaal opgebouwd in puncta bij de cel periferie, die diagnose van plasmodesmata 15. (B) ANK-MP interactie in vitro zoals gedetecteerd door proteïne membraan overlay test. Eiwitextracten met 1 ug van het GST-MP (ProIM) of niet-gefuseerde GST (ProIMnc) werden opgelost op een 15% SDS-polyacrylamide gel, gevolgd door Electroforetisch op een nitrocellulose membraan. De GST-MPProIM en GSTProIMnc werden geïncubeerd met 0,5 ug / ml van ANK-strepII (ProSol), en ANK binding werd gedetecteerd door het sonderen van de membraan met anti-strepII konijn polyklonaal antilichaam, gevolgd door anti-konijn IgG + M secundair antilichaam geconjugeerd aan HRP (lanen 1 en 2). Noch GST-MPProIM noch GSTProIMnc interactie met een niet-verwante eiwitten, Arabidopsis cytoplasmatische NADH kinase, gefuseerd aan de strepII tag (ProSOLnc, lanen 3 en 4). De identiteit van de band waargenomen in deze test werd bevestigd door het sonderen van de membraan met anti-GST antilichaam (lanen 5 en 6). Wanneer het membraan werd behandeld met denaturatie buffer zonder gewassen met buffer A, is de binding van het GST-MP naar ANK verloren, terwijl de niet-geïdentificeerde eiwitten in het GST-MP en GST contining eiwitextracten reageerde met ANK-strepII, waaruit het belang van de stap 3.1 voor de denaturatie-proces (lanen 7 en 8).

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li>
<li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li>
<li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li>
<li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li>
<li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li>
<li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li>
<li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li>
<li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus%3A+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li>
<li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li>
<li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li>
<li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANK%2C+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein%2C+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li>
<li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP1%2C+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2%2C+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li>
<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze aanpak is geschikt voor het testen van eiwit-eiwit interacties tussen combinaties van de eiwitten, wanneer ten minste een van de eiwitten is goed oplosbaar in de bindende buffer, en met succes werd toegepast op andere combinatie van eiwitten 17,18. De iInteractions tussen de eiwitten die zowel onoplosbare onder deze omstandigheden niet kunnen worden getest door dit protocol. Ook succesvolle hervouwing van ProIM is van cruciaal belang voor de test. Het spoelen van de membraan ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Eiwit testkit </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Proteïnase-inhibitor cocktail </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> Mini-veranderend systeem </td><td> Bio-RAD </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> Semi-droge western blotting SD Electroforetisch systeem </td><td> Bio-RAD </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> Anti-konijn IgG antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> Anti-GST konijn polyklonaal antilichaam </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> Anti-strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace, NT nitrocellulose transfermembraan </td><td> Pall Wetenschappelijke </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon westerse chemiluminescent HRP substraat </td><td> Millipore </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

eiwit membraan overlay test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten test in vitro</em

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Valideren van interacties tussen verschillende eiwitten is van vitaal belang voor het onderzoek van hun biologische functies op het moleculaire niveau. Er zijn verschillende methoden, zowel in vitro als in vivo, de eiwitbinding te evalueren, en ten minste twee methoden die de tekortkomingen van elkaar aan te vullen moeten worden uitgevoerd om betrouwbare inzichten te verkrijgen. Voor een in-vivo assay, de bimoleculaire fluorescentie invulling (BiFC) test de meest populaire en minst ingrijpende aanpak die in staat stelt om eiwit-eiwit interacties te detecteren binnen levende cellen vertegenwoordigt, evenals identificeren van de intracellulaire lokalisatie van de interagerende eiwitten 1,2. In deze test, niet-fluorescerende N-en C-terminale helften van GFP of zijn varianten gefuseerd met getest eiwitten, en wanneer de twee fusie-eiwitten bij elkaar worden gebracht als gevolg van de geteste eiwitten &#39;interacties, is het fluorescerende signaal gereconstitueerde 3-6 . Omdat het signaal is makkelijk te detecteren door epifluorescentie of confocale microscopie, heeft BiFC ontpopt als een krachtig instrument van keuze tussen celbiologen voor het bestuderen van over eiwit-eiwit interacties in levende cellen 3. Deze test kan echter soms leiden tot valse positieve resultaten. Bijvoorbeeld, kan het fluorescerende signaal worden opgelost door twee GFP fragmenten voor zover geregeld 7 nm van elkaar als gevolg van nauwe verpakken in een kleine subcellulaire compartiment, in plaats van dat als gevolg van specifieke interacties 7. Als gevolg van deze beperkingen, moeten de resultaten van live-cell imaging-technologieën worden bevestigd door een onafhankelijke aanpak op basis van een ander principe voor het detecteren van eiwit interacties. Co-immunoprecipitatie (Co-IP) of glutathion transferase (GST) pull-down assays vertegenwoordigen dergelijke alternatieve methoden die vaak worden gebruikt om eiwit-eiwit interacties in vitro te analyseren. Echter IIn deze onderzoeken moet echter de geteste eiwitten worden gemakkelijk oplosbaar zijn in de buffer die supportsused voor de binding reactie. Daarom kan specifieke interacties met betrekking tot een onoplosbaar eiwit niet worden beoordeeld door deze technieken. Hier, illustreren we het protocol voor het eiwit membraan overlay bindingstest, die dit probleem omzeilt. In deze techniek kan de interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten betrouwbaar getest worden omdat een van de eiwitten is geïmmobiliseerd op een membraan matrix. Deze methode, in combinatie met de in vivo experimenten, zoals BiFC, biedt een betrouwbare benadering te onderzoeken en trouw karakteriseren interacties tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten. In dit artikel, binding tussen Tobacco mosaic virus (TMV) beweging eiwit (MP), die meerdere functies uitoefent bij virale cel-cel transport 8-14, en een recent geïdentificeerde plant cellulaire interactor, tabak ankyrin herhaal-bevattende proteïne (ANK ) 15, wordt aangetoond met behulp van deze techniek.

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we een<em&gt; In vitro</em&gt; Eiwit-eiwit binding assay aan een membraan-geïmmobiliseerde eiwit probe met een oplosbare proteïne. Deze test geeft een betrouwbare methode om de interactie tussen een onoplosbaar eiwit en een eiwit in oplossing te testen.

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Het valideren van interacties tussen verschillende eiwitten is essentieel voor het onderzoek naar hun biologische functies op moleculair niveau. Er zijn verschillende ...

Eiwittesten. Protein-interactie is onmisbaar voor de dissectie van de eiwitfunctionaliteit. Deze video introduceert een in vitro eiwit-eiwitbindingsassay om de interactie tussen een membraangebonden en geïmmobiliseerd eiwit met een oplosbaar eiwit te testen.Eerst worden fusie-eiwitten gekloond, tot expressie gebracht en geëxtraheerd. Het gelabelde onoplosbare eiwit wordt geïmmobiliseerd op een nitrocellulosemembraan en behandeld om het terug te vouwen naar zijn natuurlijke conformatie. Vervolgens wordt het membraan gesondeerd met gelabelde oplosbare eiwitten en wordt er immunoblotting uitgevoerd om de eiwitten te detecteren.Indien de getagde eiwitten interageren, worden ze gevangen door het eiwit dat op het membraan is geïmmobiliseerd, en zal het signaal van de immunoblotting worden waargenomen. Deze assay biedt dus een betrouwbare methode om de interactie tussen een onoplosbaar eiwit en een eiwit in oplossing te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de GST pull-down, is dat u de binding tussen onoplosbare eiwitten en oplosbare eiwitten in vitro betrouwbaar kunt beoordelen.De eerste stap van deze procedure is het genereren van genetisch gelabelde eiwitten voor detectie. Begin met het kloneren van het eiwit dat op het membraan geïmmobiliseerd zal worden. Dit wordt aangeduid als pro Im voor geïmmobiliseerd eiwit in een expressievector die codeert voor een grote tag zoals GST; de lege expressievector, die alleen voor de tag codeert, wordt gebruikt als negatieve controle voor het geïmmobiliseerde eiwit en wordt aangeduid als pro IM nc.Kloon vervolgens het eiwit dat als oplosbare probe zal worden gebruikt in een expressievector, coderend voor een andere tag, zoals strep two. Dit zal worden aangeduid als prosol voor oplosbaar eiwit; kloon een negatieve controle van een oplosbaar eiwit in dezelfde expressievector. Dit zal worden aangeduid als Prosol NC voor oplosbaar eiwit negatieve controle.Gebruik vervolgens een eiwitexpressiesysteem, zoals een coli- of balo-virus, om de getagde eiwitten tot expressie te brengen. Het gebruikte expressiesysteem moet zorgvuldig worden gekozen op basis van de vereisten voor posttranslationele modificaties. Extraheer de tot expressie gebrachte eiwitten uit het gekozen organisme. Voor pro IM en pro I mnc Resus.Resuspendeer de cellen in SDS-page-laadbuffer met een protease-remmingscocktail. Kook de cellen vervolgens vijf minuten en centrifugeer ze daarna om het precipitaat te verwijderen voor de extractie van Prosol en prosol NC. Gebruik hiervoor standaardprocedures. De pro IMS kan onder denaturerende omstandigheden worden geëxtraheerd, aangezien de eiwitten opnieuw zullen vouwen nadat ze zijn geïmmobiliseerd in het nitrocellulosemembraan.Prosol moet echter worden geëxtraheerd om een native bevestiging te verkrijgen, omdat deze aan de bindingsbuffer worden toegevoegd zodra de getagde eiwitten zijn geëxtraheerd. Bepaal de concentratie van de recombinante eiwitten met een standaardmethode, zoals de BioRad protein assay kit. Indien er ruw extract in plaats van gezuiverd eiwit voor de assay zal worden gebruikt.Schat de concentratie van het eiwit van belang via scannende densitometrie van de corresponderende band op een met kumasi gekleurde SDS-polyacrylamidegel, gebruikmakend van bekende concentraties BSA als referentie. Zet vervolgens de standaardcurve uit op basis van de signaalintensiteiten die zijn gemeten met de scannende densitometrie van de BSA en bereken de hoeveelheid eiwit in het ruwe extract.De volgende stap van de procedure is het immobiliseren van pro Iam en pro IAM NC op het membraan. Begin met het laden van telkens één microgram pro Iam- en pro IAM NC-extracten in dubbeltoets op een SDS-polyacrylamidegel. Verwijder na elektroforese de gel uit de glasplaten en plaats deze in 100 milliliters transferbuffer, waarna deze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur wordt geïncubeerd onder zachte agitatie.Voer na de incubatie een western blot uit om de eiwitten over te brengen op een nitrocellulosemembraan; laat na de transfer de aan het membraan gebonden eiwitten hervouwen. Plaats het membraan in 15 milliliters buffer A en incubeer dit onder zachte agitatie. Om residu SDS te verwijderen, wordt er gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd onder zachte agitatie.Verwijder na de incubatie voorzichtig het membraan uit de buffer. Plaats het membraan vervolgens in 25 milliliters denaturatiebuffer. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.Tijdens de incubatie wordt het nitrocellulosemembraan opaak. Breng het membraan vervolgens met een pincet over naar 25 milliliters TBS en incubeer dit gedurende vijf minuten onder zachte agitatie. Tijdens deze stap keert het membraan terug naar zijn oorspronkelijke witte kleur.Breng vervolgens het membraan over naar 25 milliliters bindingsbuffer. Incubeer gedurende de nacht bij vier graden Celsius onder zachte agitatie. Vervolgens wordt het oplosbare eiwit gebruikt om het membraan te sonderen op het geïmmobiliseerde eiwit.Bereid eerst de hybridisatiebuffers voor door 1 tot 10 µg prosol en prosol NC te verdunnen in afzonderlijke buisjes met 10 mL verse bindingsbuffer. Breng de buffer vervolgens over naar een hybridisatiezak. Knip daarna het membraan in twee stroken, die beide pro IM en pro IAM nc bevatten.Deze membranen worden in de hybridisatiebuffer geplaatst. Breng elk membraan over naar de prosol- of prosol NC-hybridisatieoplossing en incubeer deze gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur onder lichte agitatie. Verwijder de membranen uit de hybridisatieoplossingen en spoel deze drie keer gedurende 15 minuten met TBS.Om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren, wordt het membraan gedurende één uur geblokkeerd met 2,5% magere melk in TBST. Na de incubatie worden de geblokkeerde membranen geplaatst in de primaire antilichaamoplossing. Hierbij wordt antis strep two polyklonaal konijnenantilichaam gebruikt.Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie na de incubatie. Spoel de membranen gedurende 15 minuten in 20 milliliter TBST en tweemaal gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Plaats de membranen vervolgens in de HRP-geconjugeerde secundaire antilichaamoplossing. Hierbij wordt een anti-konijn IgG-antilichaam gebruikt dat geconjugeerd is aan HRP.Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie. Spoel de membranen 15 minuten lang in 20 milliliters TBST en daarna twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur onder zachte agitatie zoals voorheen; na de laatste spoeling in TBS wordt de proteïne-proteïne interactie gevisualiseerd met behulp van een HRP-chemiluminescent substraat van Millipore (Molan Western Chemiluminescent).HRP-substraat wordt gebruikt na immunoblottings van het prosol. Spoel het membraan met TBST gedurende 15 minuten en tweemaal gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Probeer de membranen vervolgens opnieuw met het primaire antilichaam tegen de tag van pro.Vervolgens wordt het geschikte secundaire antilichaam toegevoegd. Visualiseer PRO I en pro Im NNC door chemiluminescentie te detecteren om de identiteit van de banden verkregen in de proteïne-membraan overlay-assay te valideren. De interactie tussen de proteïnen A en K en YFP en MP CYFP werd beoordeeld in epidermale cellen van tabak met behulp van de methode zoals beschreven in deze video, zoals hier getoond.Toen biomoleculaire fluorescentiecomplementatie werd beoordeeld, werd een sterk YFP-signaal gereconstrueerd. Dit BFC-signaal hoopte zich op in Punta aan de celperiferie, wat diagnostisch is voor het plasmamembraan omdat MP een zeer onoplosbaar eiwit is. Bij expressie in bacteriën of planten werd de protein membrane overlay assay toegepast om deze interactie te valideren.In vitro proteïne-extracten die één µg GST MP of niet-gefuseerde GST bevatten, werden gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese, gevolgd door elektrotransfer naar een nitrocellulosemembraan. Wanneer deze membranen werden gesondeerd met oplosbare a nnk strep two, vertoonde GST mp binding, maar niet de niet-gefuseerde GST. Bovendien werd er geen binding waargenomen wanneer dezelfde set membranen werd gesondeerd met een niet-gerelateerd pro saw nc IE Arabidopsis cytoplasmatische NADH-kinase getagd met strep two, wat de specificiteit van de A NK MP-interactie verder aantoont. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de geïmmobiliseerde proteïnen correct aan te vullen volgens het gepresenteerde protocol.

protein-membrane-overlay-assay-protocol-to-test-interaction-between

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

This video demonstrates co-immunoprecipitated protein complexes on a PVDF membrane for protein-protein interaction analysis. The reduced proteins from complexes were treated with trypsin to cleave the individual proteins at the smaller peptides, then, the remaining peptides were extracted from the PVDF membrane. The pulled peptide derived from both proteins in the complex was then dried and resuspended in a low concentration of formic acid for further analysis.

On-Membrane Protein Digestion to Prepare Co-Immunoprecipitated Proteins for Interaction Studies

In this video, we have demonstrated bimolecular complementation affinity purification, BiCAP, to detect and isolate specific protein dimers using conformation-specific single-domain antibodies.

Bimolecular Complementation Affinity Purification to Isolate Two Interacting Proteins

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Oligomerisatie van de ryanodine receptor, een homo-tetramer ionkanaal dat Ca2+ vrijmaakt uit intracellulaire opslag, is cruciaal voor skeletspier- en hartspiercontractie. Hier presenteren we complementaire in vivo en in vitro methoden om eiwit-zelfassociatie te detecteren en homo-oligomeer stoichiometrie te bepalen.

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Hier presenteren we een protocol voor co-immunoprecipitation en een op-kraal enzymatische activiteit assay gelijktijdig het bestuderen van de bijdrage van specifieke proteïne domeinen van plasmamembraan receptoren aan zowel de enzym werving en de enzymactiviteit.

Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Hier zijn de protocollen voor in vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten die algemeen toepasbaar voor het bestuderen van eiwit-nucleïnezuur interacties.

In vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten om eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Leer een in vitro eiwitmembraan-overlaytest om interacties tussen onoplosbare en oplosbare eiwitten te onderzoeken met immunoblotting. Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor eiwitbindingsstudies.

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro

Meer video's verkennen