Name: Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer exosoomisolatie en karakterisatie voor celbiologisch onderzoek met ultracentrifugatie en elektronenmicroscopie. Deze methode helpt onderzoekers RNA-bevattende exosomen te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gefinancierd door de Zweedse Research Council (K2008-57x-20 676-01-3).

1. Exosome isolatie <ol><li> Groeien cellen in medium met exosome-vrij serum. Dus, elke serum toegevoegd aan het celkweekmedium moet worden ontdaan van exosomes door ultracentrifugatie op 120 000 xg gedurende de nacht bij 4 ° C vóór gebruik. </li><li> Breng de celsuspensie te conische buizen. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet de cellen. </li><li> Breng de supernatant te buizen ultracentrifuge, en zo niet helemaal vol toe te voegen PBS. </li><li> Centrifugeer het monster bij 16 500 xg gedurende 20 minuten bij 4 ° C om verder te verwijderen cellen en celresten. </li><li> Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,2 um filter om deeltjes die groter zijn dan 200 nm te verwijderen. </li><li> Overdracht van de gefiltreerde bovenstaande nieuwe ultracentrifuge buizen en verzegelen de buizen voor de ultracentrifuge bij 120 000 xg gedurende 70 minuten bij 4 ° C om de pellet exosomes. </li><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Voor maximale exosome ophalen, resuspendeer de exosome verrijkened pellet herhaaldelijk in een klein volume (~ 3 x 50 ul) van een geschikte buffer. Deze buffer is afhankelijk van de downstream-experimenten gepland na de exosome isolatie. Bijvoorbeeld, lysis buffer wordt gebruikt voor eiwit-en RNA-isolatie, wordt gebruikt voor PBS elektronenmicroscopie en flow cytometrie en voor functionele studies medium de voorkeur hebben. </li></ol> Let op; exosomes kan ook worden geïsoleerd uit verschillende lichaamsvloeistoffen, zoals plasma, volgens dezelfde procedure als voor celcultuur media. Voor viskeuze vloeistoffen kan het nodig zijn om het monster te verdunnen met PBS voorafgaand aan het centrifugeren en filtratie stap. In verband met de centrifugeersnelheid voor punt 5 hierboven, kan het worden verhoogd tot 29 500 xg, en de ultracentrifugatie in punt 7 kan worden uitgebreid tot 90 minuten 18. Als het monster verder moet worden gezuiverd van de exosome pellet kan drijven op een sucrose gradiënt en de exosomes zal voornamelijk te vinden in de fractie representing een dichtheid van 1,13-1,19 g / ml 2. 2. Exosome identificatie door elektronenmicroscopie <ol><li> Om verder te elimineren verontreinigende eiwitten, resuspendeer de exosome verrijkt pellet in PBS en ultracentrifuge bij 120 000 xg gedurende 70 minuten bij 4 ° C opnieuw pellet de exosomes. </li><li> Neem een ​​kleine hoeveelheid van het monster voor eiwit isolatie en totaal eiwit meting. Zorg ervoor dat slechts een klein deel van het monster wordt gelyseerd en gebruikt voor de eiwit-meting en houdt de intacte exosomes, opgelost in PBS, afzonderlijk op ijs of bij -80 ° C voor verdere experimenten. </li><li> Plaats een druppel, ongeveer 10 ug van exosomal eiwit van het intacte exosomes geresuspendeerd in PBS, op een Parafilm. Dan, met een pincet voorzichtig een positie formvar carbon gecoate nikkel rooster op de top van elke druppel gedurende 30-60 minuten. Verzekeren dat het rooster is geplaatst met de coating zijde naar de drop met exosomes. </li><li> Plaats drie druppels, die elk 30 ul van PBS op tHij Parafilm en was het net door achtereenvolgens de plaatsing van de raster op de top van de druppels van de PBS, en gebruik een absorberend papier tussen. Gebruik het absorberend papier voorzichtig gewoon door vast te houden nauw aan de kant van de grid, zonder contact te maken met de gecoate oppervlakte. </li><li> Bevestig het monster door storting een daling van 2% paraformaldehyde op de Parafilm en plaats het rooster op de top van de drop voor 10 minuten. </li><li> Herhaal de wasstap in punt 4, alvorens immunokleuring met een passende antilichaam. Veel gebruikte antilichamen zijn anti-CD63 en anti-MHC klasse II. Elektronenmicroscopie kan ook worden uitgevoerd zonder immunokleuring als exosomes kan worden geïdentificeerd uitsluitend op basis van grootte en morfologie. Toch raden wij u aan de grootte, morfologie en de aanwezigheid van een membraan eiwit voor een meer definitieve validatie te evalueren. </li><li> Overdracht van het raster om een ​​30 ul daling van het primaire antilichaam van keuze en incubeer gedurende 40 minuten. Was door het herhalen van punt 4, maar gebruik 0,1% bovine serum albumine in PBS in plaats van PBS alleen. </li><li> Herhaal punt 7, maar met de 10 nm-goud gelabeld secundair antilichaam en wassen met PBS alleen. </li><li> Post-fix het monster door het toevoegen van een daling van 2,5% glutaaraldehyde aan de Parafilm en incubeer het raster op de top van de drop voor 10 minuten. Herhaal de wassen in punt 4, maar gebruik vijf druppels gedemineraliseerd water in plaats van drie druppels PBS. </li><li> Contrast van het monster door het toevoegen van een daling van 2% uranylacetaat aan de Parafilm en incubeer het raster op de top van de daling gedurende 15 minuten. </li><li> Insluiten het monster door het toevoegen van een daling van 0,13% methylcellulose en 0,4% uranylacetaat aan de Parafilm en incubeer het raster op de top van de drop voor 10 minuten. </li><li> Verwijder het teveel aan vloeistof door zachtjes met een absorberend papier, voor het positioneren van de grid op een papier met de gecoate zijde naar boven en laat het drogen aan de lucht gedurende 5 minuten. </li><li> Onderzoek van de preparaten met een elektronenmicroscoop of bewaar de roosters in een rooster box voor de toekomstige werkzaamheden. </li></ol> 3.Exosome karakterisering door flowcytometrie Omdat exosomes zijn te klein om worden gedetecteerd door de huidige flowcytometrie apparatuur, is het nodig om eerst de exosomes binden aan antilichamen gecoate kralen (figuur 1). Deze kralen kunnen worden gekocht als een kant en klaar product of worden gedaan in het laboratorium met het antilichaam van keuze. Afhankelijk van de exosomal cellulaire oorsprong, kunnen verschillende antilichamen worden gekoppeld aan kralen dat kan worden van magnetische of latex karakter. We op dit moment gebruik van anti-MHC klasse II of anti-CD63 gecoate parels voor deze analyse. <ol><li> Voor het gebruik van "zelfgemaakte" antilichaam gecoate kralen maken we gebruik van 4 micrometer latex bolletjes gecoat met anti-CD63 antilichaam. Was 25 pi 4 micrometer latex bolletjes (30 x 10 6 beads) twee keer in 100 ul MES buffer, 3 000 xg gedurende 15-20 minuten en Neem het pellet in 100 ui MES buffer. Bereid het antilichaam mengsel met een volume gelijk van 12,5 ug antilichaam met hetzelfde volume van MES buffer. Voeg dekralen aan het antilichaam mengsel en incubeer onder roeren gedurende een nacht bij kamertemperatuur. Was het antilichaam gecoate kralen drie maal met PBS (3 000 xg gedurende 20 minuten) en los de pellet in 100 ui van opslag buffer (met een uiteindelijke concentratie van 300 000 kralen / ul). </li><li> Voor elk monster (elke antilichaam), gaat u verder met een volume gelijk is aan een minimum van 30 ug van exosomal eiwit (van de intacte exosomes opgelost in PBS) per ~ 100 000 antilichaam gecoate kralen. </li><li> Incubeer exosomes en kralen, in een totaal volume van 300 ul PBS, meer dan nacht bij 4 ° C onder zachte beweging. </li><li> Blokkeren door het toevoegen van 300 pi van 200 mM glycine en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Was de exosome-kraal complexen twee keer in wasbuffer (1-3% serum in PBS), 600 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Incubeer de exosome-kraal complexen met 50 ul IgG-antistoffen bij 4 ° C. Twee keer was de exosome-kraal complexen in wasbuffer zoals beschreven in stap 5. </li><li> Voeg 90 ul wasbuffer en 10 piantilichaam van keuze (idealiter anti-CD9, anti-CD63 of anti-CD81) om het exosome-kraal complexen en incubeer gedurende 40 minuten onder zachte beweging. Was de exosome-kraal complexen twee keer in wasbuffer zoals beschreven in stap 5. </li><li> Voeg 300 ul wasbuffer en het verwerven van gegevens met behulp van flowcytometrie. </li></ol> Zoals hierboven besproken, verschillende kralen kunnen worden gebruikt, zoals latex bolletjes, zoals beschreven in het protocol of magnetische korrels. Als magnetische korrels worden gebruikt in plaats, gelieve te noteren, dat het protocol is iets anders. De blokkering stap (punt 4) is niet vereist en de was wordt uitgevoerd door het plaatsen van de buis in een magnetische stand in plaats van een centrifugeren. De opslag buffer gebruikt voor de "zelfgemaakte" antilichaam gecoate kralen, bevat 0,1% glycine en 0,1% natrium azid in PBS, met een pH van 7,2. Belangrijker is, zorg ervoor dat de exosome uitgeputte serum te gebruiken voor de flowcytometrie wasbuffer (1-3% serum in PBS), om het risicoserum exosomes besmetten de analyse. Let op; bij het uitvoeren van exosome karakterisering door gebruik te maken antilichaam gekoppeld kralen is het belangrijk te erkennen dat het slechts een specifieke subpopulatie, specifiek voor de gebruikte antilichaam, dat is geïsoleerd en gekarakteriseerd. 4. Exosome detectie door Western blot Western blot is een gevestigde methode en we zullen niet in detail te gaan over de methode zelf, maar focus op het belang van een geschikte eiwitisolatie voor de Western blot en het gebruik van verschillende antilichamen. <ol><li> Los de exosome pellet in het eiwit lysis buffer van keuze en pipetteren grondig, gevolgd door een vortex-menging. Om verder lyse van de exosomes, ultrasone trillingen het monster in een waterbad 3 x 5 minuten met vortex-menging in tussen. Eindelijk centrifuge van het monster, 13 000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en breng het supernatant naar een nieuw eppendorfbuisje. </li><li> Meetre van de totale hoeveelheid eiwit met een methode voor de keuze en de belasting 20-50 ug eiwit per goed. </li><li> Scheiden en de overdracht van de eiwitten door gel elektroforese en electroblotting. </li><li> Blok en was het membraan voordat u immunokleuring tegen eiwitten verrijkt met exosomes. </li><li> Detecteren de specifieke eiwit door chemiluminescentie, digitale imaging-systeem en analyse software. </li></ol> Aangezien er geen exosome specifieke markers, eiwitten die zijn verrijkt met exosomes, van alle verschillende cellulaire oorsprong, worden vaak gebruikt voor exosome detectie. Dit zijn eiwitten zoals tetraspanins (bijv. CD9, CD63 en CD81), cytoskelet geassocieerd eiwit (bijv. Ezrin) en eiwitten die betrokken zijn bij multivesiculaire biogenese (bijv. Tsg101 en Alix). Andere eiwitten die ook vaak worden gedetecteerd in exosomes zijn Flotillin, Hsc70 en verschillende rab eiwitten etc. Maar er zijn ook cel-specifieke eiwitten in exosomes zoals de A33 (darmepitheelcellen), CD3(T cellen) en MHC klasse II (antigeen presenterende cellen). Zo kunnen variëren, afhankelijk van van wat celtype de exosomes vrijkomen uit de markers voor de detectie. Als andere compartimenten van de cel ook kan produceren blaasjes, is het verder aan te raden om de aanwezigheid van eiwitten uit deze compartimenten, zoals het endoplasmatisch reticulum (bijv. calnexin en Grp78) en het Golgi-apparaat (bijv. GM130) te bepalen. Zo, het ontbreken van deze eiwitten geeft aan geen of weinig besmetting van blaasjes van de andere compartimenten in het monster bestudeerd. 5. Isolatie van exosomal RNA en RNA-analyse <ol><li> Los de exosome pellet in de RNA-lysis buffer van keuze en RNA-extractie uit te voeren. Verschillende RNA isolatie kits kunnen worden gebruikt, afhankelijk op de downstream-experimenten, maar kolom gebaseerde methoden biedt monsters met een breder spectrum van RNA. We zijn momenteel met behulp van miRCURY RNA Isolation Kit van Exiqon, maar andere kits kan geschikt zijn, afhankelijk van de scientific vraag bij de hand. </li><li> Bij het uitvoeren van RNA-isolatie is het belangrijk om te werken in een RNase-vrije omgeving. Gebruik daarom nucleïnezuur en nuclease gratis pipetpunten en veeg zowel de bank en de uitrusting vrij van verontreinigingen en RNases. </li><li> Voor RNA-isolatie, door gebruik te maken miRCURY RNA Isolation Kit, ontbinding van de exosome pellet in 350 ui van lysis-oplossing en het uitvoeren van vortex-mixing gedurende 15 seconden. </li><li> Voeg 200 ul van 95% ethanol en vortex-mixing voor 10 seconden. </li><li> Plaats een kolom in een collectie buis en breng de gelyseerd exosomes op de kolom en centrifugeer 1 minuut bij 14 000 x g. </li><li> Was driemaal uit door de toevoeging van 400 ul van Wash Oplossing voor de kolom met de exosomal RNA en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14 000 x g. </li><li> Centrifugeer de kolom voor 2 minuten bij 14 000 xg om ervoor te zorgen dat de kolom droog is en plaats de droge kolom in een RNase-vrij eppendorfbuisje. </li><li> Voeg 50 ul elutiebuffer de kolom en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 200 xg, gevolgd door 1 minuut bij 14 000 x g. </li><li> Ga verder met de geïsoleerde RNA of opslaan in -80 ° C. </li></ol> Voor de detectie en analyse van het geëxtraheerde totaal exosomal RNA, gebruik maken van een Agilent 2100 Bioanalyzer met de RNA 6000 Nano-of RNA-6000 Pico Kit. Uit de analyse blijkt de exosomal RNA opbrengst en grootteverdeling. 6. Representatieve resultaten Exosomes zijn te klein om worden gedetecteerd door de beschikbare flowcytometrie methoden, en zijn daarom aan antilichaam-gecoate kralen alvorens te worden geanalyseerd (figuur 1). Als exosome-kraal complexen kunnen voegen de flow cytometrie scatterplot kunnen bevatten verschillende populaties van enkele, dubbele en driedubbele kralen (figuur 2A). De pijl geeft de single kralen die verder worden geanalyseerd. Een CD63 positieve enkele bead-exosome bevolking ten opzichte van zijn isotype controle is weergegeven in figuur 2B. e_content "&gt; Vanwege de kleine omvang van exosomes, kunnen ze alleen worden direct gevisualiseerd met elektronenmicroscopie, en niet door lichtmicroscopie. Typische morfologische kenmerken van exosomes zijn ronde vorm en 30-100 nm grote membraanblaasjes. In figuur 3, elektronenmicroscopie foto's tonen exosomes immunostained (A) met goud-gelabeld antilichaam voor CD63 (aangegeven met de pijl) en niet-immunostained exosomes (B). Om vast te stellen dat de geïsoleerde blaasjes inderdaad exosomes en om verder te karakteriseren van de exosomal eiwitten, is Western blot gebruikt. Figuur 4 toont de afwezigheid van calnexin, een endoplasmatisch reticulum marker. Dit duidt op weinig vervuiling van blaasjes van het endoplasmatisch reticulum. Bovendien Figuur 4 toont de aanwezigheid van CD81 in exosomes, dat is een tetraspanine vaak verrijkt met exosomes. Cellulair RNA bevatten voornamelijks ribosomaal RNA (rRNA), gezien als de twee prominente pieken voor de 18S en 28S rRNA subeenheden in een Bioanalyzer analyse (figuur 5A). Echter, exosomal RNA verschillen in hun profiel als exosomes niet de twee pieken rRNA (18S en 28S) en zijn verrijkt met korte RNA, zoals mRNA en miRNA (figuur 5B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vanwege de kleine omvang van exosomes (30-100 nm), kunnen ze niet onderscheiden worden van lawaai en achtergrond bij geanalyseerd met flowcytometrie. Daarom is het noodzakelijk om ze te koppelen aan antilichamen gecoate parels voor de exosomes worden geanalyseerd, die vervolgens kunnen worden gevisualiseerd door de laser. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De exosome-kralen complex kan aggregaat met elkaar en vormen twee-en driepersoons kralen (A). De pijl is het aantonen van de single kraal-exo sommige bevolkingsgroepen die is omheind en gebruikt voor verdere analyse. Deze populatie zal direct worden vergeleken met een isotype controle (gevuld grijs piek) aan de aanwezigheid van membraan moleculen van de exosomes te bepalen. CD63 positieve exosomes (zwart geopend piek) zijn weergegeven in figuur B. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Electronenmicroscoop van exosomes met de typische morfologie en de grootte (40-80 nm) (A en B). De pijl in figuur A geeft de gouden deeltje van het secundaire antilichaam, na te gaan of deze exosome CD63 hebben op het membraanoppervlak. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Western blot resultaten waaruit blijkt dat de afwezigheid van het endoplasmatisch reticulum eiwit calnexin maar de aanwezigheid van het eiwit vaak verrijkt met exosomes, tetraspanine CD81. ve_content "&gt; <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Bioanalyzer resultaten tonen de aanwezigheid RNA in de cellen (A) en exosomes (B). Pijlen geeft de 18S en 28S rRNA subeenheden aanwezig in de cellen. Als exosomal RNA mannelijke bevatten kleine RNA geen of weinig rRNA is geïdentificeerd in exosomes.

<ol><li>Pan, B. -T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro%3A+Selective+externalization+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li>
<li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+immune+properties+and+potential+clinical+implementations%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li>
<li>Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li>
<li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li>
<li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li>
<li>Almqvist, N., Lönnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li>
<li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine%3A+dendritic+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li>
<li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA%2A008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Research%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li>
<li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation%3A+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li>
<li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Derived+Microvesicles+Induce%2C+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+%28Treg%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li>
<li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8%2B+T-cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules%2C+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li>
<li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress%3B+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li>
</ol>

JL is een mede-eigenaar van een patent met betrekking tot het gebruik van exosomes als vectoren voor de overdracht van RNA aan cellen.

Bij het bestuderen van de moleculaire inhoud en / of functie van exosomes, is het cruciaal om een ​​hoge kwaliteit isolatie-methode dat een adequate opbrengst en de laagst mogelijke mate van vervuiling biedt gebruiken. De methodiek zoals beschreven in dit artikel is een gevestigde aanpak voor het isoleren exosomes en om hun RNA-inhoud en biologische functie te bestuderen. Verder wordt het belang van de karakterisering van het geïsoleerde exosomes, door een combinatie van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie, flow cytometrie en Western blot, gemarkeerd. Bij het isoleren exosomes, is de eerste stap centrifugeren (300 xg) gebruikt om de pellet cellen die aanwezig kunnen zijn in de cel schorsing of de onderzochte biologische vloeistof. De tweede centrifugatie bij 16 500 xg moet voldoende sterk zijn om pellet dode cellen, grotere puin, apoptotische lichamen en andere organellen. Na deze centrifugeren, sommige protocollen omvatten een nano-filtratie stap, maar sommige investigators hebben uitgesloten, deze stap. Maar we benadrukken het belang van het uitbannen fragmenten en blaasjes groter dan 200 nm en daarom adviseren inclusief een filtratie stap. Indien een strengere isolatie nodig is, kan 100 nm filters worden gebruikt, maar rekening mee dat als viskeuze vloeistoffen worden gebruikt, deze filters gemakkelijk kunnen worden geblokkeerd en exosomal materiaal verloren gaat. Ook kan een 100 nm filtratie van invloed op de morfologie van de exosomes en voorts indien exosomes bevinden zich op de grotere schaal zij zouden verloren gaan. Zo is de 200 nm filters lijken geschikt voor exosome isolatie. Na de filtratie, is de verplichte ultracentrifugatie bij 120.000 xg gebruikt om de pellet exosomes. De exosomes kan verder worden gewassen met PBS, gebonden aan antilichamen gecoate kralen en gewassen, of op een sucrose gradiënt om vervuiling eiwitten te verwijderen. Dit kan echter een zeer hulpbronnen verbruiken proces dat we beweren niet nodig te zijn, vooral als het uitgangspunt monster volume is klein en / of het RNA-inhoud of de exosomes laag is, als extra stap zal aanzienlijk afnemen van het materiaal verder. Maar, nogmaals, moet de aard van het geïsoleerde blaasjes worden bewezen door de aanwezigheid en afwezigheid van bepaalde eiwitten. Tot op heden is er geen absoluut uniek eiwit marker voor exosomes geïdentificeerd om te controleren of de steekproef exosomes en niets anders bevat. Als gevolg hiervan zijn een combinatie van methoden nodig is om de exosomes, met inbegrip van de bepaling van de grootte en morfologie van de exosomes door elektronenmicroscopie karakteriseren. Ook kan de zuiverheid van het monster bepaald worden met behulp van elektronenmicroscopie, omdat deze methode kan een overzicht van de mate van verontreiniging van het monster, bijvoorbeeld met grotere blaasjes, zoals microdeeltjes, apoptotische lichamen of mobiele puin. Bovendien kan het eiwitgehalte van de exosomes worden bepaald door middel van flowcytometrie en Western blot, en de combinatie van deze twee methoden resulteert in een analyse van zowel het membraan gebonden (bijv. CD63 enCD81) en geïnternaliseerd eiwitten (bv. Tsg101 en Alix) van de exosomes. Detectie van eiwitten verrijkt met exosomes, zoals CD63, Tsg101 en Alix, en de afwezigheid van eiwitten zoals het endoplasmatisch reticulum eiwit calnexin, is een indicatie dat de exosome verrijkte pellet inderdaad exosomes en niet besmetten blaasjes van de andere compartimenten van de cel. Het profiel van de RNA die wordt gedetecteerd in exosomes is fundamenteel anders dan die van de RNA aangetroffen in intacte cellen. Zo exosomal RNA geanalyseerd door Bioanalyzer of in gel op basis van RNA-analyse methoden ontbreken de twee pieken voor de 18S en 28S rRNA subeenheden, die prominent in de analyse van cellulaire RNA. Wij zijn dan ook stellen dat de detectie van significante hoeveelheden rRNA in een monster blijkt dat de geëxtraheerde totaal RNA niet van exosomal oorsprong alleen, en dus dat de isolatie-methode moet worden verbeterd en de kwaliteit verzekerd.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Exosome isolatie </td></tr><tr><td> Optima L-90K Ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Quick-seal ultracentrifuge buizen </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Afhankelijk van de rotor verschillende gebruikte buisjes nodig zijn. Ti70 (342.414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-Seal Cordless Tube Topper kit </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur spuitfilter, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Voor viscose vloeistoffen en / of grote volumes, een vacuüm filtratie-systeem, 0,2 micrometer, van VWR International kan in plaats daarvan worden gebruikt (514-0600). </td></tr><tr><td> Elektronenmicroscopie </td></tr><tr><td> Formvar / carbon coating nikkel grids </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Muis-anti-humaan CD63 </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Final conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Isotype controle; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Final conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Anti-muis IgG Gold Conjugate, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Finale conc: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega Elektronenmicroscoop </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> Of gelijkwaardige apparatuur. </td></tr><tr><td> Flowcytometrie </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / sulfaat latex kralen </td><td> Grensvlakken Dynamics </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Antilichaam voor het coaten van de latex bolletjes </td><td></td><td></td><td> Bijvoorbeeld anti-CD63 van BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> Of gelijkwaardige apparatuur. </td></tr><tr><td> IgG uit humaan serum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Antilichamen voor detectie </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Bijvoorbeeld: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) isotype controle (555749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> Of gelijkwaardige apparatuur. </td></tr><tr><td> Isolatie van exosomal RNA en RNA-analyse </td></tr><tr><td> miRCURY RNA Isolation Kit </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en karakterisatie van rna-bevattende exosomes

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Het gebied van exosome onderzoek in volle ontwikkeling, met een dramatische toename in publicaties in de afgelopen jaren. Deze kleine blaasjes (30-100 nm) van endocytische oorsprong werden voor het eerst voorgesteld om te functioneren als een manier voor reticulocyten aan het transferrine-receptor uit te roeien, terwijl rijpen in de erytrocyten een, en werden later de naam exosomes. Exosomes worden gevormd door innerlijke knopvorming van een te late endosomen, het produceren van multivesiculaire organen (MVBs), en zijn vrij in het milieu door fusie van de MVBs met de plasmamembraan 2. Sinds de eerste ontdekking van exosomes, hebben een breed bereik van cellen is aangetoond dat deze blaasjes vrij te geven. Exosomes zijn ook aangetroffen in diverse biologische vloeistoffen, waaronder plasma, nasale lavage vocht, speeksel en moedermelk 3-6. Bovendien is aangetoond dat de inhoud en functie van exosomes hangt af van de oorspronkelijke cel en de omstandigheden waaronder zij worden geproduceerd. Een verscheidenheid van functies zijn demonengeconcentreerd voor exosomes, zoals inductie van tolerantie tegen allergeen 7,8, de uitroeiing van de gevestigde tumoren in muizen 9, inhibitie en activatie van natural killer cellen 10-12, bevordering van differentiatie in T-regulerende cellen 13, stimulatie van T-cel proliferatie 14 en inductie van T cel apoptose 15. Jaar 2007 hebben wij aangetoond dat exosomes vrijkomen uit mestcellen messenger RNA (mRNA) en microRNA (miRNA) bevatten, en dat de RNA kan worden geschuif van de ene cel naar de andere via exosomes. In de ontvangende cellen, werd het mRNA geschuif door exosomes aangetoond worden vertaald in eiwit, wat wijst op een regulerende functie van de overgedragen RNA 16. Verder hebben we ook aangetoond dat exosomes afgeleid van cellen gekweekt onder oxidatieve stress kan tolerantie te induceren tegen verdere stress in ontvangende cellen en dus wijzen op een biologische functie van de exosomal shuttle RNA 17. Celcultuur media en biologische vloeistoffen contain een mengsel van blaasjes en schuur fragmenten. Een hoge kwaliteit isolatie methode voor exosomes, gevolgd door karakterisering en identificatie van de exosomes en hun inhoud, is daarom van cruciaal belang om exosomes onderscheiden van andere blaasjes en deeltjes. Hier presenteren we een methode voor de isolatie van exosomes van beide celcultuurmedium en lichaamsvloeistoffen. Deze isolatie methode is gebaseerd op herhaalde centrifugeren en filtreren stappen, gevolgd door een laatste ultracentrifugatie stap waarin de exosomes zijn pellets. Belangrijke methoden om de exosomes identificeren en karakteriseren van de exosomal morfologie en het eiwitgehalte worden gemarkeerd, met inbegrip van elektron microscopie, flow cytometrie en Western blot. De zuivering van het totaal exosomal RNA is gebaseerd op de spin-kolom chromatografie en de exosomal RNA opbrengst en de grootteverdeling is geanalyseerd met behulp van een Bioanalyzer.

Deze paper toont voor de isolering, zuivering en detectie van exosomes, evenals technieken voor de analyse van hun moleculaire inhoud. Deze methoden zijn aanpasbaar voor exosome isolatie van zowel de media voor celkweek en biologische vloeistoffen, en kan daarna analyse van moleculaire content ook nuttig zijn in functionele studies.

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

Het vakgebied van het exosoomonderzoek breidt zich snel uit, met een dramatische toename van het aantal publicaties in recente jaren. Deze kleine blaasjes (30-100 nm) van ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om vast te stellen of de cellen en het biologische vloeistof van belang exosomen bevatten of afgeven die RNA bevatten. De eerste stap bij het isoleren van exosomen is het verwijderen van cellen en celresten. Vervolgens wordt het supernatant gefiltreerd om grotere deeltjes te verwijderen.De exosomen worden vervolgens in een tweede stap gepellet door middel van ultracentrifugatie. De exosomen worden gekarakteriseerd met elektronenmicroscopie, flowcytometrie en western blot-analyse om aan te tonen dat de geïsoleerde blaasjes de morfologie, grootte en eiwitsamenstelling van exosomen hebben. Vervolgens wordt RNA geïsoleerd uit de gezuiverde exosomen.Om vast te stellen welk RNA de exosomen bevatten, kunnen de resultaten die worden verkregen via deze gevestigde methoden voor zuivering, detectie en karakterisering van exosomen verdere studies naar exosomen, zoals hun biologische functies, faciliteren. Deze presentatie zal u daarom laten zien hoe exosomen via verschillende middelen kunnen worden geïsoleerd, en de twee personen die dit zullen presenteren zijn mijn twee PhD-studenten, Maria en Cecelia. Veel succes.De humane mastcellijn HC1 wordt in deze demonstratie van exosoomisolatie gebruikt om de procedure voor het isoleren van exosomen te starten. Kweek eerst de cellen in medium met exosoomvrij serum. Draag vervolgens de celsuspensie over naar conische buizen en centrifugeer deze 10 minuten bij 300 ×g bij vier graden Celsius.Om de cellen te pelletteren, wordt het supernatant overgebracht naar ultracentrifugebuizen en wordt het monster 20 minuten gecentrifugeerd bij 16.500 ×g bij 4 °C om cellen en celresten verder te verwijderen. Vervolgens wordt het supernatant gefiltreerd door een 0,2 µm filter om deeltjes groter dan 200 nm verder te verwijderen. Ten slotte worden de ultracentrifugebuizen met het gefiltreerde supernatant in een ultracentrifuge gecentrifugeerd bij 120.000 ×g gedurende 70 minuten bij 4 °C om de exosomen te pelletteren.De exosomen worden teruggewonnen door de ultracentrifugebuis open te snijden, het supernatant weg te gooien en het exosomenverrijkte pellet opnieuw te suspenderen. Voor een maximale terugwinning van exosomen wordt het exosomenverrijkte pellet herhaaldelijk geresuspendeerd in een klein volume van een geschikte buffer in een Eppendorf-buis.Spoel twee keer na met extra buffer van hetzelfde volume als voorheen. De buffer is afhankelijk van het type experimenten dat volgt op de exosoomisolatie. Gebruik voor elektronenmicroscopie ongeveer 10 micrograms exosomaal eiwit van de intacte exosomen.Resuspensie in PBS is uitgevoerd. Elektronenmicroscopie met koolstofgecoate nikkelroosters kan worden uitgevoerd zonder immunokleuring, aangezien exosomen uitsluitend op basis van grootte en morfologie kunnen worden geïdentificeerd. Het wordt echter aanbevolen om een primair antilichaam te gebruiken, zoals anti-CD63 of anti-MHC klasse II, gevolgd door secundaire antilichamen gelabeld met 10 nanometer goud.Omdat exosomen te klein zijn om te worden gedetecteerd met de huidige flowcytometrie-apparatuur, is het noodzakelijk om de exosomen eerst te binden aan met antilichamen gecoate beads. Afhankelijk van de cellulaire oorsprong van de exosomen worden verschillende antilichamen gekoppeld aan magnetische latex-beads. In deze demonstratie worden anti CD 63 gecoate latex-beads gebruikt voor elk monster.Gebruik een volume dat gelijkstaat aan 30 tot 40 microgram exosomaal eiwit van het intacte exosoom. Incubeer de in PBS gesuspendeerde exosomen gedurende een nacht bij vier graden Celsius onder zachte beweging in beads. Blokkeer de volgende dag door 300 microliter 200 millimolair glycine toe te voegen en incubeer dit gedurende 30 minuten.Was het exosoom-beadcomplex twee keer met wasbuffer en incubeer de exosoom-beadcomplexen met 50 µL IgG-antilichaam bij 4 °C. Was de exosoom-beadcomplexen twee keer, voeg 90 µL wasbuffer en 10 µL van het gekozen antilichaam toe aan de exosoom-beadcomplexen en incubeer gedurende 40 minuten in het donker. Was de exosoom-beadcomplexen twee keer onder milde beweging, voeg 300 µL wasbuffer toe, breng de monsters over naar flowcytometrie-buisjes en verzamel de gegevens via flowcytometrie.Deze demonstratie van de western blot richt zich op het belang van een geschikte proteïne-isolatie voorafgaand aan de Western blot en de verschillende gebruikte antilichamen. Los het exosomenpellet op in de gewenste proteïnelysebuffer en pipetteer dit grondig, gevolgd door mengen met een vortex om de exosomen verder te lyseren; sonicize het monster in een waterbad, centrifugeer het monster bij 13 000 ×g gedurende vijf minuten en breng de supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Meet de totale eiwitconcentratie met een methode naar keuze en breng het eiwit aan op de gel.Scheid en overdraag vervolgens de eiwitten via gelelektroforese en electroblotting, en blokkeer en was het membraan voordat de immunokleuring tegen eiwitten die verrijkt zijn in exosomen wordt uitgevoerd, aangezien er geen exosoomspecifieke markers zijn. Eiwitten die verrijkt zijn in exosomen van verschillende cellulaire herkomst worden gewoonlijk gebruikt voor de detectie van exosomen. Dit zijn eiwitten zoals tetraspanines, bijvoorbeeld CD9, CD63 en CD81.Cytoskelet-geassocieerde eiwitten zoals ezrin en eiwitten betrokken bij multivesiculaire biogenese zoals TSG 1 0 1 en LY worden gebruikt, terwijl kexin en GRP 78 uit het endoplasmatisch reticulum dienen als negatieve controle om te controleren op contaminerende eiwitten die veel voorkomen in blaasjes uit andere compartimenten. Afhankelijk van de geplande experimenten kunnen verschillende RNA-isolatiekits worden gebruikt. In deze demonstratie wordt een kolomgebaseerde methode toegepast bij het uitvoeren van de RNA-isolatie.Het is belangrijk om pipetpuntjes te gebruiken die vrij zijn van nucleïnezuren en nucleasen, en om zowel de werkbank als de apparatuur te reinigen om contaminanten en RNA's te verwijderen. Los het exosoompellet op in 350 µL lysisoplossing en vortex het monster. Voeg 200 µL 95% ethanol toe en meng dit met behulp van een vortex.Plaats een kolom in een opvangbuisje, breng de gelyseerde exosomen over naar de kolom en centrifugeer. Was drie keer met 400 µL wasbuffer om er zeker van te zijn dat de kolom droog is. Centrifugeer na de laatste wasbeurt twee minuten bij 14.000 ×g en plaats de droge kolom in een RNAse-vrij RNase-buisje. Elueer het RNA in 50 µL elutiebuffer voor detectie en analyse van het geëxtraheerde totale exosomale RNA.Een Agilent 2100 bioanalyzer kan worden gebruikt met de RNA 6, 000 nano of RNA 6, 000 pico kit, aangezien exosomen te klein zijn om te worden gedetecteerd met de beschikbare flowcytometrie-methoden. Ze worden gekoppeld aan met antilichamen gecoate beads voordat ze worden geanalyseerd. Omdat deze exosoom-beadcomplexen kunnen aggregeren, kan een scatterplot van de flowcytometrie verschillende populaties van enkelvoudige, dubbele en drievoudige exosoom-beadcomplexen bevatten.Zoals hier getoond, geeft de pijl de populatie van enkelvoudige exosoom-bead-complexen aan, wat de populatie is die verder wordt geanalyseerd. Een flowcytometrie-histogram laat een enkelvoudige exosoom-bead-populatie zien die positief is voor het CD 63-eiwit. Hoe verder naar rechts de open curve zich bevindt, hoe positiever het monster is voor CD 63.Vanwege de geringe omvang van exosomen kunnen deze alleen met elektronenmicroscopie worden gevisualiseerd. Typische morfologische kenmerken van exosomen zijn ronde blaasjes met een grootte van 30 tot 100 nanometer. Een immunokleuring van een exosoom met een goudgeconjugeerd antilichaam tegen CD 63 wordt aangegeven door de pijl in de Western blot.De resultaten tonen de afwezigheid van het endoplasmatisch reticulum-eiwit calnexin in het exosomale monster, maar tonen wel de aanwezigheid van het tetraspanine CD81, een eiwit dat gewoonlijk is verrijkt in exosomen. Cellulair RNA bevat voornamelijk ribosomaal RNA, wat in deze bioanalyzer-analyse zichtbaar is als de twee pieken voor de 18 s ribosomaal RNA-subeenheid links en de 28 s subeenheid rechts. Exosomale RNA's verschillen echter in hun profielen, aangezien ze weinig of geen ribosomaal RNA bevatten en verrijkt zijn met kort RNA, zoals messenger-RNA en micro-RNA.De isolatie kan in ongeveer drie uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Bij het gebruik van deze methode is het belangrijk om alle stappen uit te voeren, inclusief de niet-filtratiestappen, om contaminatie van grotere blaasjes te voorkomen. Na de ontwikkeling van deze techniek is het karakteriseren van exosomen, zowel biochemisch als biologisch, veel eenvoudiger geworden.Bovendien hebben we veel meer geleerd over de door exosomen gemedieerde cel-celcommunicatie in verschillende systemen. Daarnaast heeft de techniek het mogelijk gemaakt om exosomen te ontwikkelen als biomarkers voor verschillende ziekten. Hartelijk dank voor uw aandacht.

isolation-and-characterization-of-rna-containing-exosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De aanwezigheid van stabiele microRNA (miRNA) in exosomes heeft immense belangstelling gegenereerd als een nieuwe wijze van intercellulaire communicatie, voor hun potentiële nut als biomarkers en als een route voor therapeutische interventie. Hier laten we zien exosome zuivering van het bloed en de cultuur media, gevolgd door kwantitatieve PCR om miRNA's worden vervoerd identificeren.

Zuivering en microRNA Profilering van Exosomes Afgeleid van Blood en cultuur Media

Technieken die een gradiëntprocedure beschrijven om exosomen te scheiden van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) deeltjes worden beschreven. Deze procedure werd gebruikt om exosomen te isoleren van HIV-deeltjes in menselijk plasma van met HIV geïnfecteerde personen. De geïsoleerde exosomen werden geanalyseerd op cytokine/chemokine-gehalte.

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Hier beschrijven we twee extracellulaire vesikel isolatie protocollen, ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren, te isoleren van extracellulaire blaasjes van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeibare steekproeven. De extracellulaire blaasjes lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof door beide methoden afgeleid zijn gekwantificeerd en gekenmerkt.

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Een exosome is een nieuwe generatie van drug delivery vervoerders. Wij opgericht een protocol exosome isolatie met een hoge opbrengst en zuiverheid voor siRNA levering. Wij ook ingekapseld fluorescently geëtiketteerde aspecifieke siRNA in exosomes en onderzocht de cellulaire opname van siRNA-geladen exosomes in kankercellen.

Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

Hier presenteren we een protocol om van milt afgeleide exosomen van muizen te isoleren met behulp van een combinatie van vertering met collagenase type I en ultracentrifugatie.

Isolatie en karakterisering van exosomen afgeleid van miltweefsels van muizen

Dit werk laat zien hoe een RNA / DNA hybride vorm op de chromosomale niveau en onthullen de overdracht van genetische informatie van RNA naar DNA genoom in gistcellen.

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Leer exosoomisolatie en karakterisatie voor celbiologisch onderzoek met ultracentrifugatie en elektronenmicroscopie. Deze methode helpt onderzoekers RNA-bevattende exosomen te analyseren.

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

Meer video's verkennen