Name: Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: Leer een tube formation assay op Matrigel om vasculogene activiteit van tumorcellen te evalueren. Deze methode kwantificeert buisvorming en voorspelt in vivo vasculair gedrag voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NCI R01 CA120659 (RS).

1. Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen <ol><li> Voorbereiding van de tumorcellen en microvasculaire endotheelcellen: hersentumor cellen zoals U87-cellen, melanoomcellen B16F1, borstkanker MDA-MB-435, en dikke darm cellen HCT116 werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS en penicilline / streptomycine (alle van Invitrogen ). Endotheel cellijn menselijke microvasculaire endotheelcellen (HMVECs) werden gekweekt in EBM2 medium (Lonza), aangevuld met 1 ug / ml hydrocortison en 1 ng / ml epidermale groeifactor, 10% FBS en penicilline / streptomycine. De cellen werden gewassen met PBS drie keer en vrijstaande met 0,05% trypsine / EDTA (Invitrogen). Na het centrifugeren met 2000 rpm gedurende 5 minuten werden celpellets opnieuw gewassen met PBS. Vervolgens werden de cellen gepelleteerd geteld met een hemocytometer. </li><li> Matrigel voorbereiding: Een deel van de groei factor-gereduceerd Matrigel (BD Bioscience) werd opgewarmd bij kamertemperatuur. Voor volledig gesmolten is, werd het overgebracht naar ijs en de vloeistof werd bewaard op ijs gedurende ten minste 10 minuten. Dan 50 ul van Matrigel werd uitgeplaat op 96-well platen op een horizontaal niveau die het mogelijk maakt de Matrigel gelijkmatig te verdelen, en geïncubeerd gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Tube formatie: Cells (1-2 x 10 4) werden opnieuw gesuspendeerd met serum-vrij DMEM voor tumor cellen of EBM-2 voor endotheliale cellen, en geladen op de top van de Matrigel. Als deze test werd gebruikt voor het meten van effecten van een aantal agenten op de tubulus ontwikkeling, werden deze middelen (stimulators of remmers) toegevoegd aan de serum-vrij medium. Elke voorwaardelijke groep bevatte 4-6 putten. </li><li> Beeld-en data-analyse: Na incubatie bij 37 ° C gedurende de nacht, elk putje werd direct geanalyseerd onder een microscoop. Als buisjes nodig waren voor de fixatie, werd 100 ul van 10% formaline zout-gebaseerde oplossing voorzichtig toegevoegd en tien minuten later, was hij klaar voor analyse. Onder een microscoop met 10x fasecontrast, werden tubuli in elk veld afgebeeld en een gemiddelde van buisjes 3-5 willekeurige velden in elk putje werd geteld. </li></ol> 2. Representatieve resultaten: HMVECs werden gebruikt als een positieve controle, omdat deze buisjes werden ontwikkeld van heldere langgerekte cellichamen die verbinding maken met polygoon netwerk te vormen. B16F1, U87, en MDA-MB-435 cellen ontwikkelde vasculaire tubuli vergelijkbaar met die gevormd wordt door HMVECs, maar HCT116 cellen niet (figuur 1). Een cel dosis-afhankelijke buis formatie werd getest in U87 cellen. Zoals aangetoond in figuur 2, 10.000 cellen gevormd gestaakt tubuli. Nadat de cellen werden verdubbeld, een solide vasculaire netwerk is vergelijkbaar met die bij HMVECs. In tegenstelling tot cellen die minder dan 5000 niet in geslaagd een vasculaire fenotype vormen. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Tube vorming veroorzaakt door HMVECs, U87, MDA-MB-435, en B16F1 cellen, maar niet HCT116 cellen. Alle cellen (2 x 10 4) werden geladen op Matrigel en geïncubeerd gedurende de nacht. Buisjes werden afgebeeld met behulp van fase-contrast. HMVECs werden gebruikt als een positieve controle. Een vertegenwoordiger van 3-5 velden werd getoond. Bar: 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. U87 cell-geïnduceerde tubuli in een cel nummer-afhankelijke manier. Verschillende nummers van U87-cellen, zoals aangegeven in de hoeken werden gebruikt voor de vorming buis. HMVECs werden gebruikt voor een positieve controle. Bar: 100 mm.

<ol><li>Shao, R., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvascular+endothelial+cells+immortalized+with+human+telomerase+catalytic+protein%3A+a+model+for+the+study+of+in+vitro+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis.</a> Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).</li>
<li>Ribeiro, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostatic+properties+of+the+SV-40+transfected+human+microvascular+endothelial+cell+line+%28HMEC-1%29.+A+representative+in+vitro+model+for+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium.</a> Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).</li>
<li>Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMEC-1%3A+establishment+of+an+immortalized+human+microvascular+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line.</a> J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).</li>
<li>Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+expression+of+periostin+by+human+breast+cancers+promotes+tumor+angiogenesis+through+up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression.</a> Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).</li>
<li>Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YKL-40%2C+a+secreted+glycoprotein%2C+promotes+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis.</a> Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).</li>
<li>Basu, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+cyclooxygenase-2+in+regulating+vascular+channel+formation+by+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).</li>
<li>Scavelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+by+bone+marrow+macrophages+in+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma.</a> Oncogene. 27, 663-674 (2008).</li>
<li>El Hallani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+alternative+mechanism+in+glioblastoma+vascularization%3A+tubular+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22+Brain%22%5BJournal%5D)">A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry.</a> Brain. 133, 973-982 (2010).</li>
<li>Maniotis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+channel+formation+by+human+melanoma+cells+in+vivo+and+in+vitro%3A+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry.</a> American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).</li>
<li>Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+and+tumour-cell+plasticity%3A+lessons+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma.</a> Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).</li>
<li>Folberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+plasticity+in+uveal+melanoma%3A+microenvironment+directed+dampening+of+the+invasive+and+metastatic+genotype+and+phenotype+accompanies+the+generation+of+vasculogenic+mimicry+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns.</a> American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+membrane+antigen+directed+selective+thrombotic+infarction+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors.</a> Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).</li>
<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+significance+of+tumor+cell-lined+vasculature+in+ovarian+carcinoma%3A+implications+for+anti-vasculogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy.</a> Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+in+vasculogenic+mimicry+and+angiogenesis+of+inflammatory+breast+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft.</a> Cancer Research. 62, 560-566 (2002).</li>
<li>Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+tissue+factor+pathway+inhibitors+1+and+2+in+melanoma+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry.</a> Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).</li>
<li>Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+of+laminin+5+gamma2+chain%2C+matrix+metalloproteinase-2%2C+and+membrane+type-1-matrix%2Fmetalloproteinase+are+required+for+mimicry+of+embryonic+vasculogenesis+by+aggressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma.</a> Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+and+pseudo-comedo+formation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer.</a> International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Om deze test te slagen, moet de kwaliteit van Matrigel eerst worden getest. Een klein monster kan worden verkregen bij BD bio-vooraf-run de test met behulp van HMVECs. Andere partij producten kunnen verschillend kwaliteiten waarin sommige percelen niet voorzien in een optimale conditie voor buis vorming. Ten tweede moet elke luchtbellen worden vermeden wanneer een portie van Matrigel wordt geladen in 96-well platen, omdat de bubbels kan tubuli vorming verstoren. Als kleine belletjes zijn te vinden in een goed, kan de Ma...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Groeifactor-gereduceerde Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 47743-720 </td></tr><tr><td> EBM2 kit </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> Nikon ECLIPSE TS100 microscoop </td><td> Nikon </td><td></td></tr></tbody></table>

een matrigel-based tube formation assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

In de afgelopen decennia, een buis formatie test met behulp van groeifactor-gereduceerde Matrigel is meestal gebruikt om de angiogene activiteit van de vasculaire endotheliale cellen aan te tonen in vitro 1-5. Heeft echter recent steeds meer bewijzen zien dat deze test niet beperkt tot de vasculaire endotheliale cellen gedrag voor te testen. In plaats daarvan, maar ook is gebruikt om het vermogen van een aantal tumorcellen aan een vasculaire fenotype 6-8 ontwikkelen, testen. Deze mogelijkheid is in overeenstemming met hun vasculogene het gedrag die in xenotransplanted dieren, een proces dat bekend staat als vasculogene mimicry (VM) 9. Er is een veelheid aan bewijsmateriaal waaruit blijkt dat de tumor cel-gemedieerde VM speelt een vitale rol in de ontwikkeling van tumoren, onafhankelijk van de endotheelcellen angiogenese 6, 10-13. Zo werden de tumorcellen gevonden om deel te nemen in het bloed geperfuseerde, vasculaire kanaal formatie in weefselmonsters van melanoom en glioblastoma patiënten 8, 10, 11. Hier beschreven we deze buisvormige netwerk assay als een nuttig instrument bij de evaluatie van de vasculogene activiteit van de tumorcellen. We ontdekten dat sommige tumor cellijnen zoals melanoom B16F1 cellen, glioblastoma U87 cellen, en borstkanker MDA-MB-435-cellen zijn in staat om vasculaire tubuli vormen, maar sommige niet zoals de dikke darm kanker HCT116 cellen. Bovendien is dit vasculaire fenotype is afhankelijk van aantal cellen uitgeplaat op de Matrigel. Daarom kan deze test dienen als krachtig hulpmiddel om de vasculaire potentieel van een groot aantal celtypen met inbegrip van vasculaire cellen, tumorcellen en andere cellen scherm.

Een buis formatie test wordt gebruikt om de vasculaire activiteit van tumorcellen te evalueren.

Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

Gedurende de afgelopen decennia is een buisvormingsassay met gebruik van groeifactor-gereduceerde Matrigel doorgaans toegepast om de angiogene ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de buikvorming van verschillende typen tumorcellen in vitro te meten, als een manier om de vasculaire activiteit in vivo te beoordelen. Dit wordt bereikt door tumorcellen op matrigel toe te voegen om buikvorming te induceren. Als tweede stap.Cellen op matrigel worden overnight geïncubeerd bij 37 °C, waardoor buisvorming kan plaatsvinden. Vervolgens worden de door elk celtype geproduceerde buisjes afgebeeld. Om het gemiddelde aantal gevormde buisjes per celtype te kwantificeren, worden resultaten verkregen die het potentiële vermogen van deze cellen tonen om in vivo vasculatuur te vormen op basis van xenograft-tumormodellen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het kankeronderzoek, zoals het meten van vasculaire activiteit in vitro. Begin ter voorbereiding van de tumorcellen met het kweken van UAD seven melanoma, B 16 F1 MDA, MB 4 35- of colon HCT one 16-cellen in DMEM aangevuld met 10% FPS en penicilline. Kweek humane microvasculaire endotheelcellen of H ECS in EBM two-medium aangevuld met 1 µg/mL hydrocortison, 1 ng/mL epidermale groeifactor, 10% FBS en penicilline.Was de cellen met PBS, detach ze ver

a-matrigel-based-tube-formation-assay-to-assess-vasculogenic-activity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De buisvorming assay is een snelle, meetbare werkwijze voor het meten in vitro angiogenese. Endotheelcellen worden gecombineerd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan extract. Tube vorming gebeurt binnen enkele uren en nieuw gevormde buisjes gemakkelijk gekwantificeerd.

Endothelial Cell Tube Formation Assay voor de<em&gt; In Vitro</em&gt; Studie Angiogenese

We beschrijven een matrigel-plugtest om het angiogeen potentieel van een pool van factoren te illustreren die worden afgescheiden door kankercellen, met behulp van twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten, echografie en endomicroscopie. De matrigel, een buitencelmatrix (ECM)-nabootsende gel, wordt gebruikt om de gastheer (muis) te introduceren met angiogeen factoren die worden afgescheiden naar het geconditioneerde medium...

Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen

Dit manuscript beschrijft een buisvormingstest om de effecten van een bepaalde verbinding of omstandigheid op angiogenesis te kwantificeren door gebruik te maken van de vorming van endotheelcellen in een gecontroleerde omgeving.

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Dit artikel presenteert een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in hemangioblastomas (HBs) en haar rol in de HBs bestaat. De resultaten wijzen op de complexiteit van de HB-neovascularization en suggereren dat deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in de HB-neovascularization is.

Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde

Hier evalueren we de effecten van het water extract van Ruta graveolens op de vorming van een vat netwerk door gebruik te maken van een buis vormings test op een opgestijfde kelder matrix.

HUVEC-buis-formatie test om de impact van natuurlijke producten op angiogenese te evalueren

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.

Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies

Het huidige protocol maakt het herstel mogelijk van buisachtige structuren die zijn gevormd in de klassieke in vitro angiogenese-buisvormingstest waarbij cellen, zoals trofoblastcellen, zich organiseren in capillaire structuren over een laag extracellulaire basaalmembraanmatrix. De teruggevonden structuren worden gebruikt voor RNA- en eiwitisolatie voor verschillende biochemische analyses.

Trofoblastcelherstel van angiogenese-buisvormingstest voor analyse van differentiatiemarkerexpressie

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Leer een tube formation assay op Matrigel om vasculogene activiteit van tumorcellen te evalueren. Deze methode kwantificeert buisvorming en voorspelt in vivo vasculair gedrag voor kankeronderzoek.

Een Matrigel-Based Tube Formation Assay aan de vasculogene activiteit van tumorcellen beoordelen

Meer video's verkennen