Name: Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Leer een methode voor driedimensionale reconstructie van helikale structuren met cryo-elektronenmicroscopie. Dit protocol toont iteratieve helicale real-space reconstructie toegepast op HIV-1 capsid assemblies voor structurele biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Gongpu Zhao en Danxia Ke bedanken voor technische ondersteuning. Wij danken Drs. Edward Egelman en Niko Grigorieff voor het delen van hun software voor beeldverwerking. Erkennen wij ook de medewerkers die ondersteuning van de Structurele Biologie cryo-EM faciliteit en Beowulf cluster en rooster aan de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine. Dit werk werd ondersteund door GM082251 en GM085043.

1. Frozen-gehydrateerd EM prepareren Omdat HIV-1 capside-eiwit (CA) samenstellingen 9 stabiel zijn alleen in hoge zout (1 M NaCl) buffer, die een sterke achtergrond geluid in cryo-EM beelden draagt, gebruiken we een snelle verdunning en back-side blotting methode om tijdelijk minder zout concentratie bij de voorbereiding van de bevroren gehydrateerd EM grid. <ol><li> Glimontlading de koolstof kant van de 200-mesh R2 / 1 Quantifoil koperen roosters onder 25mA voor 25 seconden. </li><li> Gebruik een vernevelaar om de vochtigheid in de milieu-kamer, een zelfgemaakte handleiding zwaartekracht zuiger, te brengen tot 80%. </li><li> In de FEI Vitrobot Plunger Dewar, koele vloeistof ethaan met behulp van vloeibare stikstof. Monteer de duik-bevriezing Dewar op de handleiding zwaartekracht zuiger. </li><li> Van toepassing zijn 2,5 ul van voorgemonteerde CA oplossing op de koolstof-kant van het net, die is gemonteerd op een tang, en laad de tang op de zuiger met de koolstof-kant van het net van u af. </li><li> Voeg 3 pi van een laag zout verdunning buffer (100 mM NaCl) aan de achterkant van de grid en onmiddellijk blot de achterkant van de grid met een stuk filtreerpapier. De hele achterkant van de grid moet in nauw contact met de filter papier voor ongeveer 6 seconden, voordat u de filter papier. Onmiddellijk duiken het rooster in vloeibare ethaan na het verwijderen van het filter papier. </li><li> Verwijder de tang uit de zuiger en snel het net te zetten in een raster opbergdoos. </li></ol> 2. Cryo-elektronenmicroscopie van CA buisvormige assemblages <ol><li> Laad de bevroren gehydrateerd rooster in een FEI Polara G2 elektronenmicroscoop werken op 200kv en voorzien van een Gatan 4Kx4K CCD camera. </li><li> Onder een lage dosis-search-modus, bij een vergroting van ~ 200x en met een dosis &lt;0.001e - / A 2, het scherm van de hele grid voor gebieden met geschikte ijs en red de posities van deze gebieden in een fase-bestand. </li><li> Roep de opgeslagen posities en verder het scherm van deze gebieden op een vergroting van 3900 x in lage dosis-search mode. Kies de gebieden met een gelijkmatige, dunne laag van ijs met goed gescheiden, lange buizen meer dan gaten, voor het verzamelen van gegevens. Sla de locaties van deze gebieden in een tweede fase-bestand. </li><li> Schakel over naar belichtingsstand bij een vergroting van 59.000 x, inzet een 100 um objectieve diafragma, en stel het doel stigmatism en bundelintensiteit voor een dosis van ~ 15 e - / A 2 per blootstelling. </li><li> Keer terug naar de lage-dosis-modus voor het zoeken, ga dan naar een opgeslagen positie en identificeren en in het midden een goede buis met de CCD camera. Schakelaar om de scherpstelling modus, om de focus, en stel een defocus waarde, normaal gesproken tussen 0,5 en 2,5 um. Schakel over naar de belichting, stelt een belichtingstijd 0,3-0,5 seconde, voor een dosis van 15 e - / A 2, en het verzamelen van een beeld. De beelden worden verzameld op een bord camera, en de films zou moeten worden toegestaan ​​om zich te vestigen voor het 10 seconden voordat een opname wordt gemaakt. </li><li> Ga naar de volgende opgeslagen positie en herhaal stap 5 om meer afbeeldingen te verzamelen. </li><li> De films zijn ontwikkeld in volle kracht D19 gedurende 12 minuten en gedigitaliseerd met behulp van een Nikon Super Coolscan 9000 ED scanner op een pixelgrootte van 6,35 micrometer. Het formaat van beeldbestanden is TIFF. </li></ol> 3. Helical indexering Een spiraalvormig object kan worden geïndexeerd door twee parameters: de Bessel-order, n, en laag lijnnummer, l. Elke laag lijn in de Fourier-transformatie, zoals gekenmerkt door (n, l), komt overeen met een reeks van lijnen op het oppervlak rooster van het spiraalvormige object aangegeven met (h, k) indices, met behulp van de notatie van een 2D-rooster. Voor elke (h, k), een (n hk, l hk) laag lijn is een lineaire combinatie van twee fundamentele vectoren (n 10, l 10) en (n 01, l 01), die de n en l-waarden van de de twee belangrijkste lagen lijnen (1, 0) en (0, 1). l kan worden verkregen bij de laag regelhoogte gemeten langs Z-as in de Fourier-transformatie. De waarde van n kan worden geschat met behulp van de volgende vergelijking 10 πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 .....................( 1) waar J n de Bessel-functie, die de intensiteit van de n-de laag regel bepaalt, r is de straal van de spiraalvormige object, en R is de straal van de maximale amplitude van de laag lijn. De laag regelnummer, l, is gerelateerd aan n van de selectie regel 11 l = tn + um ....................( 2) waar T en U zijn constanten van de helix. Voor een gegeven helix, kan er precies u units in exact (of zeer nauw) t complete bochten. <ol><li> Box uit een relatief rechte en lange buis met een uniforme diameter van het gebruik van de EMAN programma van 12 helixboxer en sla de afbeelding in MRC-formaat. </li><li> Bepaal de helical herhalen afstand, c, met behulp van een cross-correlatie gebaseerd programma, zoals 'imgccf', in de MRC-pakket 13. </li><li> Het berekenen van de Fourier-transformatie, met een nieuwe doos lengte die is een integraal van de herhaling afstand, c. </li><li> Kies twee belangrijkste lagen lijnen die twee fundamentele oppervlakte rooster vectoren (1,0) te definiëren en (0,1). </li><li> Meet de straal van de buis, r, en de hoogte en de straal van de twee belangrijkste lagen lijnen in een Fourier transform, L 10, R 10, L 01 ​​R 01, respectievelijk (afb. 1). </li><li> Bereken n 10 en n 01 volgens vergelijking (1). </li><li> Omdat n-waarden zijn slechts schattingen, zijn een paar combinaties van n 10 en n 01 getest in latere stappen (zie stap 4.2) in de juiste spiraalvormige symmetrie gebruik van het programma-pakket IHRSR te vinden. </li><li> Bereken de schroef symmetrie beschreven door twee reële getallen: de rotatie tussen de subeenheden (Δφ) en de axiale stijging (Δz) van de een-ster helix (n = 1). Gezien l 10, 01 l, n 10, 01 en n-waarden, kan u en t worden verkregen door het testen van een reeks van m-waarden (bijvoorbeeld, -50 &lt;m &lt;50) op basis van de selectie regel. Tot slot worden Δφ en Δz berekend met behulp van Δφ = 360 t / u en Δz = c / u. </li></ol> 4. Drie-dimensionale reconstructie <ol><li> Particle segmentatie <ol><li> Open een microfoto met spiraalvormige deeltjes, met behulp van het grafische programma Boxer, dat is een programma in de EMAN pakket. </li><li> Snijd de helical deeltje in overlappende segmenten. In het bedieningspaneel van de Boxer, kies Helix-modus en de parameters voor boksen: de grootte van de doos moet groter zijn dan de diameter van de deeltjes en de waarde voor 'OLAP' moet ~ 90% van de doos grootte. </li><li> Na de linkermuisknop te klikken op de beide uiteinden van de spiraalvormige deeltje, zal Boxer automatisch genereren van een reeks deeltje dozen langs de helix lengte. </li><li> Bewaar boxed segmenten en hun coördinaten. </li></ol></li><li> De eerste 3D-reconstructie met behulp van programma's IHRSR <ol><li> Invert het contrast van de cryo-EM beelden en toe te passen low-pass filter 14 (optioneel) voorafgaand aan de verwerking met het iteratieve spiraalvormige werkelijke ruimte reconstructie methode (IHRSR). </li><li> Open de grafische interface van IHRSR programma door te typen "Generator". Zorg voor de grafische interface met alle informatie voor de boxed deeltjes stack, inclusief de naam en het pad van de stapel, het aantal afbeeldingen in de stack, de waarden voor de parameters symmetrie, etc. Klik op de knop "Finish" om de wederopbouw script te maken, b25.spi. </li><li> Gebruik een massieve of holle cilinder als een eerste referentie en kan de procedure om te fietsen totdat er geen wijzigingen in de gedefinieerde schroef symmetrie, die meestal optreedt na een paar cycli. Een recht helical symmetrie moet geven een stabiel geconvergeerd reconstructie. De reconstructie gegenereerd in de laatste cyclus zal worden gebruikt als een eerste referentie voor verdere verfijning. IHRSR voert 3D reconstructie met behulp van SPIDER-programma's. </li></ol></li><li> Reconstructie met iteratieve raffinement 15 De 3D-reconstructie die door IHRSR wordt nu gebruikt als een eerste referentie voor extra verfijning. Tijdens de verfijning, is de spiraalvormige symmetrie vastgesteld op Δφ en Δz, die worden bepaald door de IHRSR procedure. <ol><li> Bepaal de onscherp en astigmatisme aanwezig zijn in de microfoto gebruik van programma's CTFFIND3 en CTFTILT 16. </li><li> Vermenigvuldig deeltje segmenten door de CTF behulp van SPIDER-programma's 17. De operatie genoemd FT in de SPIDER suite wordt gebruikt om de Fourier transformatie (FFT) van de 2D-afbeelding te berekenen. Daarna wordt de FFT vermenigvuldigd met CTF, bepaald in de vorige stappen, met behulp van de operatie genoemd MU binnen de SPIDER suite. De verkregen waarde wordt vervolgens omgekeerd weer getransformeerd tot een nieuw beeld (CTF-gecorrigeerd) in de reële ruimte met behulp van de SPIDER werking vorm, FT weer. </li><li> Voer projectie matching door het vergelijken van projecties van de referentie-volumes met de CTF-gecorrigeerde beelden, het gebruik van multi-referentie-alignment. De variatie in de out-of-plane hoek is beperkt tot + / -10 ° C en bemonsterd in 1 ° stappen. Invoering van beperkingen, zoals een hoge correlatie coëfficiënten, in het vlak hoeken in de buurt van 0 ° of 180 °, en beperkte x-verschuivingen, voor de uitlijning parameters van elk segment. Onder meer bij de wederopbouw alleen die segmenten die de randvoorwaarden te voldoen. </li><li> Na elke iteratieve verfijning cyclus, is een 3D-reconstructie gegenereerd met behulp van back projectie en gedeeld door som over de CTF2. </li><li> Opleggen van de schuine symmetrie om een ​​symmetrized volume te genereren. De iteratieve verfijning wordt beëindigd wanneer geen verdere verbetering van de resolutie van de nieuwe 3D-reconstructie plaatsvindt. </li><li> De beeldverwerking-pakket SPIDER wordt gebruikt voor het grootste deel van de verfijning stappen. Een reeks van activiteiten worden gecontroleerd door SPIDER scripts, die door de gebruiker gemaakte batch control-bestanden met sequenties van operaties en parameterwaarden. De uiteindelijke reconstructie wordt berekend met behulp van programma's in SPIDER suite. </li></ol></li></ol> 5. Representatieve resultaten: Een HIV-1 CA A92E buis (Fig. 1a) was boxed uit en zijn Fourier transform (Fig. 1b) werd berekend voor spiraalvormige indexering. Voor laag-lijnen (1, 0) en (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Gegeven een tube straal van 211.57Å, we benaderd n 10 =- 12, n 01 = 11 (hier de willekeur was vooraf bepaald). Met een herhaling afstand van 5195.48Å, de schroef symmetrie van de buis werd bepaald als Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz en Δφ werden verfijnd om 7.1321Å en 328,86 ° met gebruikmaking van IHRSR (afb. 2a) en de eerste reconstructie is te zien in Fig. 2b. De uiteindelijke reconstructie (afb. 3), na iteratieve verfijning, verbetering van de dichtheid kaart sterk af van het eerste model berekend met IHRSR (afb. 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Indexering van HIV-1 CA spiraalvormige buis. (A) Een enkele HIV-1 CA A92E tube beeld. Schaalbalk, 30 nm. (B) De Fourier-transformatie van de buis die in (A). De spiraalvormige indices (n 10 =- 12, n = 01 11) worden aangeduid. De pijlpunt wijst naar de laag lijn 23A resolutie. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een eerste reconstructie met IHRSR. (A) Schroef symmetrie bepaling voor elke iteratieve cyclus. Δφ en Δz, uitgaande van de oorspronkelijke waarden, convergeren naar de stabiele waarden na 10 iteratieve verfijning cycli. (B) De eerste 3D-dichtheid kaart na 10 iteratieve cycli. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. De 3D-dichtheid map na de iteratieve verfijning. (AC) De dichtheid kaart van CA buizen wordt weergegeven als drie orthogonale plakjes: parallel aan de buis-as en dicht bij het oppervlak (A), loodrecht op de buis-as (B), en parallel aan en door de buis-as (C) . Schaal van bars, 10 nm. (D) Oppervlakte weergave van de 3D-dichtheid kaart contouren op 1.8s bijvoeging van 100% vol.

<ol><li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method%3A+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li>
<li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li>
<li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+model+of+the+microtubule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li>
<li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li>
<li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li>
<li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li>
<li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li>
<li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li>
<li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li>
<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+electron+cryo-microscopy%3A+towards+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li>
<li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens%3A+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li>
<li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We presenteren een reeks protocollen voor een eenvoudige benadering van 3D-structuren van de spiraalvormige objecten te verkrijgen. Met behulp van de beschreven procedures, hebben we in een 3D-structuur van HIV-1 capside montage van een enkele buis beeld (176 segmenten). Een hogere resolutie structuren kunnen worden bereikt door meer beeldgegevens. Er zijn een aantal kritische punten voor een optimale gegevensverzameling en-analyse: Ten eerste, tijdens de voorbereiding van een cryo-EM monster, moet het monster oplossing weg uitgedelgd, waardoor een gelijkmatige, dunne laag van de oplossing die is iets dikker dan de steekproefomvang. Er zijn verschillende manieren om het monster blot. Voor bacteriële cellen en buisvormige exemplaren, zoals HIV-1 CA assemblage, blotting van de ene kant, met name uit de back-side, het meest geschikt is. Ten tweede, de handigheid van de helix moet worden bepaald, omdat deze niet kan worden gedaan door rechte indexeren of wederopbouw. Een veel voorkomende praktijk is het gebruik van vries-etsen, gevolgd door een roterende shadowing 18 tot linkshandigheid te bepalen. Onpartijdigheid kan ook worden bepaald na de reconstructie bij de resolutie van de dichtheid kaart voldoende hoog is, de 3D-atomaire-modellen van de individuele componenten moeten goed passen in de dichtheid kaart wanneer er een correct linkshandigheid is verondersteld. Anders moet het tegenovergestelde willekeur worden aangenomen. Ten derde moet een Wiener-filter gebruikt worden tijdens de beeldverwerking, voor zowel de fase en amplitude correctie, om ruis te verminderen versterking. Omdat de CTF van een enkel beeld heeft altijd nul kruisingen, is deel van de informatie in de reciproke ruimte verloren. Daarom is het noodzakelijk zijn om meerdere projectie gegevens sets opgenomen voor 3D-reconstructie, elk beeld gebracht bij verschillende defocus waarden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Bron </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Glow-ontladingsinrichting 100X </td><td> Glow-ontladingsinrichting 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 microscoop met een Field Emission Gun </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K CCD-camera </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Duik-invriezen apparaat </td><td></td><td> Zelfgemaakte handleiding zwaartekracht zuiger </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-carbon koperen roosters </td><td> Quantifoil Micro Tools, Jena, Duitsland </td><td></td></tr><tr><td> EM software EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM software IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programma&#39;s beschikbaar van Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM software Spider </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC op basis van helical processing software </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programma&#39;s die beschikbaar zijn vanaf Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT en de reële ruimte helical verfijning software </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structuur van hiv-1 capside assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief helical real-ruimte wederopbouw

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), gecombineerd met beeldverwerking, is een steeds krachtige tool voor de structuur bepaling van de macromoleculaire eiwitcomplexen en samenstellingen. In feite hebben enkel deeltje elektronen microscopie een en twee-dimensionale (2D) elektronen kristallografie twee zijn geworden relatief routine methodieken en een groot aantal structuren opgelost met behulp van deze methoden. Tegelijkertijd heeft beeldverwerking en drie-dimensionale (3D) reconstructie van spiraalvormige objecten snel ontwikkeld, met name, de spiraalvormige real-ruimte reconstructie (IHRSR) methode 3, die enkel deeltje analyse-instrumenten gebruikt in combinatie met spiraalvormige symmetrie iteratief. Veel biologische entiteiten functie in draadvormige of schuine vormen, met inbegrip van actine filamenten 4, 5 microtubuli, amyloïde vezels 6, tabak mozaïek virus 7, 8 en bacteriën flagella, en omdat een 3D-dichtheid kaart van een spiraalvormige entiteit kan worden bereikt vanaf een projectie beeld, in vergelijking met de vele beelden die nodig zijn voor 3D-reconstructie van een niet-helix object, met de IHRSR methode, structurele analyse van dergelijke flexibele en verstoorde spiraalvormige vergaderingen is nu bereikbaar. In deze video artikel, bieden we gedetailleerde protocollen voor het verkrijgen van een 3D-dichtheid kaart van een spiraalvormige eiwit vergadering (HIV-1 capside 9 is ons voorbeeld), inclusief protocollen voor cryo-EM prepareren, lage dosis de gegevensverzameling door de cryo-EM, indexeren van rechte diffractie patronen, en beeldverwerking-en 3D-reconstructie met behulp van IHRSR. In vergelijking met andere technieken, cryo-EM biedt optimale bescherming monster onder near native omstandigheden. Monsters zijn ingebed in een dunne laag van glasvocht ijs, door snel invriezen, en afgebeeld in elektronenmicroscopen temperatuur van vloeibare stikstof, onder lage dosis voorwaarden aan de straling schade te minimaliseren. Sample beelden worden verkregen onder near native omstandigheden ten koste van de lage signaal-en laag contrast in het opgenomen microfoto. Gelukkig is het proces van het spiraalvormige reconstructie grotendeels geautomatiseerd, met uitzondering van de indexering van de spiraalvormige diffractiepatroon. Hier beschrijven we een benadering van de index spiraalvormige structuur en bepaal spiraalvormige symmetrieën (helical parameters) van gedigitaliseerde microfoto, een essentiële stap voor 3D-helix wederopbouw. Kortom, we krijgen een eerste 3D-dichtheid kaart door het toepassen van de IHRSR methode. Deze eerste kaart wordt vervolgens iteratief verfijnd door de invoering van beperkingen voor de uitlijning parameters van elk segment, waardoor de controle op hun vrijheidsgraden. Verdere verbetering wordt bereikt door te corrigeren voor het contrast overdracht functie (CTF) van de elektronenmicroscoop (amplitude en fase correctie) en door het optimaliseren van de spiraalvormige symmetrie van de montage.

Dit artikel beschrijft een methode om een ​​drie-dimensionale (3D) structuur van spiraalvormig geassembleerd moleculen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie te verkrijgen. In dit protocol maken we gebruik van HIV-1 capside vergaderingen om de gedetailleerde 3D-reconstructie procedure te illustreren voor het bereiken van een dichtheid kaart door de iteratieve rechte real-ruimte reconstructie methode.

Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), gecombineerd met beeldbewerking, is een steeds krachtiger instrument voor de structuurbepaling van macromoleculaire eiwitten ...

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een methode om een driedimensionale structuur van geassembleerde heli-moleculen te verkrijgen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie. Het protocol begint met de preparatie van cryo-EM-monsters middels een snelle verdunnings- en backside-blottingmethode om de zoutconcentratie tijdelijk te verlagen bij het bereiden van het bevroren gehydrateerde EM-rooster. Dit proces waarborgt de eiwitstabiliteit terwijl de achtergrondruis wordt verminderd en de signaal-ruisverhouding wordt verbeterd tijdens de daaropvolgende cryo-EM low-dose data-acquisitie.De helix-indexering van de diffractiepatronen is voltooid. Vervolgens wordt de beeldbewerking uitgevoerd, gevolgd door een 3D-reconstructie in de reële ruimte, wat resulteert in de uiteindelijke dichtheidskaart van het HIV-1-capside of de ca-buis. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, aangezien er verschillende kritieke punten zijn voor een optimale gegevensverzameling en -analyse.Bijvoorbeeld, in het geval van HIV vormen capsid-tubulaire assemblages die alleen ontstaan in een molaire bronoplossing door de zoutconcentratie snel te verlagen zonder de structuur te beïnvloeden. Het is cruciaal om cryo-EM-beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen. Gegeven een afbeelding van een tube is het zeer moeilijk om te bepalen hoe een kritieke tube geïndexeerd moet worden en welke software gebruikt kan worden voor 3D-reconstructie.Deze video biedt een gedetailleerde en eenvoudige aanpak voor het verkrijgen van een 3D-reconstructie van fysieke objecten en kan als referentie voor uw experiment dienen. Ik zal de procedure demonstreren samen met Dr. Puja. We zijn beiden postdocs van Dr. Laboratory. Om de HIV-1 capsiden-eiwitassemblages voor cryo-EM voor te bereiden, begint u met het glow-dischargen van de koolstofzijde van koperen grids van 200 mesh bij 25 milliamps gedurende 25 seconden.Gebruik een vernevelaar om de luchtvochtigheid in de klimaatkamer, die bestaat uit een zelfgemaakte handmatige zwaartekrachtplunjer, op 80% te brengen. Koel ondertussen vloeibaar ethaan in een vitro-fles plunjerdoer met vloeibare stikstof en monteer de plunge-vriesdoer op de handmatige zwaartekrachtplunjer. Gebruik vervolgens een pincet om de klemmen op de rand van het rooster te sluiten.Breng 2,5 µL van een vooraf samengestelde eiwitoplossing aan op de koolstofzijde van het raster. Plaats vervolgens de pincet op de zuiger, waarbij de koolstofzijde van het raster naar buiten is gericht. Voeg drie µL laag-zout verdunningsbuffer toe aan de achterzijde van het raster.Dep de grid onmiddellijk aan dezelfde zijde droog met een stuk filterpapier. Houd het gehele achteroppervlak van de grid ongeveer zes seconden lang in nauw contact met het filterpapier. Dompel de grid direct na het verwijderen van het filterpapier onder in vloeibaar ethaan.Verwijder tot slot de pincet uit de zuiger en plaats het raster snel in een rasterbewaarbox. Start de cryo-elektronenmicroscopie door het bevroren gehydrateerde raster in een FEI polar G two elektronenmicroscoop te laden. De microscoop werkt bij 200 kilovolt en is uitgerust met een gatin 4K bij 4K CCD-camera.Voeg in de zoekmodus bij een lage dosis een vergroting van ongeveer 200 x toe. Screen het gehele raster op gebieden met geschikt ijs. Sla de posities van deze gebieden op in een stage-bestand.Roep de opgeslagen posities op en scan deze gebieden verder. Voeg een vergroting van 3.900 x toe in de low dose search-modus. Selecteer de gebieden met een uniforme dunne ijslaag voor datacollectie, die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van lange buisjes die boven een gat zweven.Sla alle gebieden op in een bestand voor de tweede fase. Schakel over naar de belichtingsmodus. Stel een vergroting van 59.000 x in en plaats een objectiefdiafragma van 100 micrometer.Stel vervolgens het stigmatisme van de objectieflens en de bundelintensiteit in voor een dosis van ongeveer 15 elektronen per angstroom kwadraat per belichting. Keer terug naar de zoekmodus voor een lage dosis en ga naar een opgeslagen positie. Identificeer en centreer een geschikte tube.Schakel met de CCD-camera over naar de focusmodus, stel de focus in en stel een defocuswaarde in, gewoonlijk tussen 0,5 en 2,5 micrometers. Schakel vervolgens over naar de belichtingsmodus en stel een belichtingstijd van 0,3 tot 0,5 seconden in voor een dosis van 15 elektronen per angstrom squared. Verzamel de beelden op een plaatcamera, waarbij de films 10 seconden de tijd krijgen om te stabiliseren voordat er een belichting plaatsvindt.Nadat de beelden zijn verzameld, gaat u naar de volgende opgeslagen positie en herhaalt u dit proces om meer beelden te verzamelen. Ontwikkel de films in onverdunde D 19 gedurende 12 minuten. Digitaliseer de beelden vervolgens met een Nikon Super cool scan 9.000 ED-scanner met een pixelgrootte van 6,35 micrometers.Een helixvormig object kan worden geïndexeerd door twee parameters: de Bessel-orde N en het laaglijnnummer L in de Fourier-transformatie van het oppervlakterooster van een helixvormig object. Elke laaglijn wordt gekenmerkt door N en L en komt overeen met een set lijnen op het oppervlakterooster, zoals aangeduid door de H- en K-indices.Om te beginnen met de helicale indexering, gebruikt u het programma Helix boxer van Iman om een relatief lange en rechte buis met een uniforme diameter uit te snijden en slaat u de afbeelding op in MRC-formaat. Meet vervolgens de straal van de buis met behulp van het programma boxer van Iman. Bepaal de HEL-herhalingsafstand met behulp van een programma op basis van kruiscorrelatie, zoals I-M-G-C-C-F in het MRC-pakket.Bereken vervolgens de foyer. Transformeer met een nieuwe box-lengte die een veelvoud is van de herhalingsafstand. Kies daarna twee hoofdvlaklijnen die twee basisvectoren van het oppervlakrooster definiëren, één nul en nul één in eenheden van FFT-pixels.Bepaal de nummers van de laaglijnen evenals de radii van de maximale amplitude voor de twee hoofdlaaglijnen in de Fourier-transformatie. Gegeven de nummers van de laaglijnen en de waarden van de Bessel-orden voor de twee hoofdlaaglijnen, kunnen de rotatie tussen subeenheden en de axiale stijging van de eenstervormige helix worden verkregen met behulp van de selectieregel zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Deze twee reële getallen beschrijven de schroefsymmetrie van de buis.De 3D-reconstructie begint met de segmentatie van deeltjes met behulp van het programma Iman.Boxer. Nadat een micrografie met helix-deeltjes is geopend, wordt een deeltje in overlappende segmenten gesneden in het controlepaneel van Boxer. Kies de helix-modus en stel de parameters voor het boxen in.De grootte van het box moet groter zijn dan de diameter van het particle en de waarde voor OLA moet ongeveer 90% van de boxgrootte bedragen. Nadat dit is gebeurd, zal het klikken op een van de uiteinden van de particle box automatisch een reeks particle boxes langs de lengte van de helix genereren, waarbij de ingeboxte segmenten en hun coördinaten worden opgeslagen. De volgende stap is het uitvoeren van de initiële 3D-reconstructie met de iteratieve helix real space reconstructiemethode I-H-R-S-R voorafgaand aan de verwerking met I-H-R-S-R.Inverseer het contrast van de cryo-EM-beelden en pas LOWPASS-filtering toe. Open vervolgens de grafische interface van het I-H-R-S-R-programma door generator in te typen. Voer in de grafische interface alle informatie voor de stack met boxed particles in, inclusief de naam en het pad van de stack, het aantal beelden in de stack en de waarden voor de symmetrieparameters.Klik op de knop 'voltooien' om het reconstructiescript te maken. B 25 SP.I Gebruik een massieve of holle cilinder als initiële referentie en laat de procedure cyclisch doorlopen totdat er geen wijzigingen meer optreden in de gedefinieerde schroefsymmetrie, wat gewoonlijk na enkele cycli gebeurt. Een rechtsdraaiende helixsymmetrie zou een stabiel geconvergeerde reconstructie moeten opleveren.De reconstructie die in de vorige cyclus is gegenereerd, zal worden gebruikt als initiële referentie voor verdere verfijning. Voer ten slotte een 3D-reconstructie uit met iteratieve verfijning, waarbij de 3D-densiteitskaart die door I-H-R-S-R is gegenereerd, als initiële referentie dient voor aanvullende verfijning tijdens het proces. De helicale symmetrie is vastgesteld op de rotatie tussen subeenheden en de axiale stijging, welke zijn bepaald via de I-H-R-S-R-procedure.Bepaal vervolgens de defocus en het astigmatisme in de micrograaf met behulp van de programma's CTF find three en CTF tilt uit de spider-programmapakketten, genaamd FT en mu; vermenigvuldig de partikelsegmenten met de contrastoverdrachtfunctie (contrast transfer function), afgekort als CTF. Voer projectiematching uit door projecties van de referentievolumes te vergelijken met de CTF-gecorrigeerde beelden met behulp van multi-referentie-uitlijning. De variatie in de tilthoek buiten het vlak is beperkt tot plus of minus 10 graden en wordt bemonsterd in stappen van één graad; introduceer beperkingen zoals hoge correlatiecoëfficiënten voor hoeken in het vlak nabij nul of 180 graden en beperkte X-verschuivingen.Houd voor de uitlijningsparameters van elk segment in de reconstructie alleen die segmenten aan die aan de beperkingen voldoen. Na elke iteratieve verfijningscyclus wordt er een 3D-reconstructie gegenereerd met behulp van back projection, gedeeld door een bepaalde waarde over de CTF squared, waarna de helikale symmetrie wordt toegepast om een symmetries volume te genereren. De iteratieve verfijning wordt beëindigd wanneer er geen verdere verbetering meer optreedt in de resolutie van de nieuwe 3D-reconstructie.Een enkele assemblage van een HIV-1 capside, een buis van 92 e, werd uitgesneden en de Fourier-transformatie hiervan werd berekend voor helix-indexering van de twee radii; de laaglijnnummers en de radii van maximale amplitude voor de laaglijnen 10 en 01 werden bepaald. Eindwaarden van respectievelijk -12 en 11 werden vervolgens berekend voor 10 en 01 met een herhalingsafstand van 5195,48 angstroms. De schroefsymmetrie van de buis werd bepaald als delta Z = 6,81 angstroms en delta phi = 328,88 graden; delta Z en delta phi werden verfijnd tot 7,13 angstroms en 328,86 graden met behulp van I-H-R-S-R, waarna na 10 iteratieve cycli een initiële reconstructie werd gegenereerd.De uiteindelijke reconstructie na iteratieve verfijning verbeterde de dichtheidskaart aanzienlijk ten opzichte van het initiële model dat met I-H-R-S-R was berekend. De dichtheidskaart van de assemblagebuizen van het capside wordt weergegeven als drie orthogonale doorsneden parallel aan de as van de buis en dicht bij het oppervlak, loodrecht op de as van de buis, en parallel aan en door de as van de buis. De getoonde structuur is het resultaat van surface rendering van de 3D-dichtheidskaart met een contour van 1,8 Sigma die 100% van het volume omsluit.Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed begrip moeten hebben van hoe u een 3D-structuur van een volledig geassembleerd molecuul verkrijgt met behulp van cryo-elektronenmicroscopie.

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De kroon van de verschillende regio V3 lus sequenties van het oppervlak enveloppe glycoproteïne (gp120) van HIV-1 kan structureel worden gekarakteriseerd in veel gevallen door in silico vouwing van de posities 10 tot 22 van de lus met behulp van een...

Beoordeling van immunologisch relevante Dynamic tertiaire structurele kenmerken van de HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence door Ab initio Folding

Het protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het bepalen van de structuren van membraaneiwitten met behulp van cryo-electron tomografie-en 3D-beeldverwerking. Het omvat de details van prepareren, data verzamelen, data verwerken en interpreteren, en afgesloten met het vervaardigen van een vertegenwoordiger doelstelling voor de aanpak, de HIV-1 Envelop glycoproteïne. Deze computationele procedures zijn ontworpen op een manier die onderzoekers en studenten in staat stelt om op...

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Er wordt een benadering gepresenteerd voor het bepalen van structuren van virale membraan glycoproteïne complexen door gebruik te maken van een combinatie van elektronen cryo-tomografie en sub-tomogram averaging met het computationele pakket Jsubtomo.

Een gemiddelde van virale envelop glycoproteïne Spikes uit Electron Cryotomography Reconstructies met Jsubtomo

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Dit artikel presenteert een protocol voor gegevensverwerking van influenzavirussen, in beeld gebracht met behulp van cryo-elektronentomografie en daaropvolgende subtomogrammiddeling van het hemagglutinineglycoproteïne. Dit protocol omvat stapsgewijze gegevensverwerking, van beeldvoorverwerking tot de verfijning van het uiteindelijke model.

Subnanometer-resolutie structurele bepaling van hemagglutinine uit cryo-elektronentomografie van griepvirussen

HIV tropisme kan worden afgeleid uit de V3 gebied van de virale envelop. V3 is PCR geamplificeerde in drievoud met geneste RT-PCR, in volgorde, en geïnterpreteerd met behulp van bio-software. Monsters met met 1 of meer sequentie (s) met een lage G2P scores worden geclassificeerd als niet-R5-virus.

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Leer een methode voor driedimensionale reconstructie van helikale structuren met cryo-elektronenmicroscopie. Dit protocol toont iteratieve helicale real-space reconstructie toegepast op HIV-1 capsid assemblies voor structurele biologie.

Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw

Meer video's verkennen