Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te bieden om een driedimensionaal model van heli geassembleerde moleculen te verkrijgen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie. Het protocol begint met de voorbereiding van cryo EM-specimens met behulp van een snelle verdunning en backside blotting-methode om de zoutconcentratie tijdelijk te verlagen bij het voorbereiden van de bevroren gehydrateerde EM-grid. Dit proces zorgt voor eiwitstabiliteit terwijl het achtergrondgeluid wordt verminderd en de signaal-ruisverhouding wordt verbeterd tijdens de cryo EM low-dosis dataverzameling die volgt op de daaropvolgende dataverzameling.

De helicale indexering van diffractiepatronen is voltooid. Vervolgens wordt beeldverwerking uitgevoerd, gevolgd door 3D-reconstructie in de reële ruimte, resulterend in de definitieve dichtheidsmap van het HIV-een-capside of ca-buis. Over het algemeen zullen mensen die onbekend zijn met deze methode worstelen omdat er verschillende kritieke punten zijn voor optimale dataverzameling en analyse.

In het geval van HIV-een-capside tubulaire assemblages die zich slechts in één molaire bronoplossing vormen, is het snel verlagen van de zoutconcentratie zonder de structuur te beïnvloeden cruciaal. Het is van cruciaal belang om hoogwaardige cryo EM-beelden te verkrijgen. Als je een buisbeeld hebt, is het erg moeilijk om te leren wat je moet doen om een kritieke buis te indexeren en welke software kan worden overwogen om 3D-reconstructie uit te voeren.

Deze video biedt een gedetailleerde en eenvoudige aanpak om een 3D-reconstructie van fysieke objecten te verkrijgen en kan als referentie voor uw experiment worden gebruikt. Ik zal de procedure demonstreren met Dr.Puja. We zijn allebei postdocs van Dr.Laboratory Om de HIV-een-capside-eiwitassemblages voor cryo em voor te bereiden, begint u door de koolstofzijde van 200 mesh koperroosters onder 25 milliampères gedurende 25 seconden te ontladen.

Gebruik een vernevelaar om de luchtvochtigheid op 80% te brengen in de omgevingskamer, wat een zelfgemaakte manuele zwaartekrachtplunjer is. Koel ondertussen vloeibaar ethaan in een vitro bott plunjerdoer met vloeibaar stikstof. Monteer de plunjerfreesdoer op de manuele zwaartekrachtplunjer. Gebruik vervolgens een pincet om de pincetten op de rasterrand te klemmen.

Breng 2,5 microliter van een voorgeassembleerde eiwitoplossing aan op de koolstofzijde van het raster. Laad vervolgens het pincet op de plunjer met de koolstofzijde van het raster wegwijzend. Voeg drie microliter lage zoutverdunningsbuffer toe aan de achterkant van het raster.

Blot het raster onmiddellijk met een stuk filterpapier aan dezelfde kant. Houd de hele achterkant van het raster gedurende ongeveer zes seconden in nauwe contact met het filterpapier. Nadat het filterpapier is verwijderd, dompelt u het raster onmiddellijk in vloeibaar ethaan.

Verwijder ten slotte het pincet van de plunjer en breng het raster snel over in een rasteropslagdoos. Begin met cryo-elektronenmicroscopie door de bevroren gehydrateerde raster in een FEI polar G two elektronenmicroscoop te laden. Werkende op 200 kilovolt en uitgerust met een gatin 4K bij 4K CCD-camera.

In de modus voor lage dosis zoeken, voegt u een vergroting van ongeveer 200 x toe. Zoek het hele raster af naar gebieden met geschikt ijs. Bewaar de posities van deze gebieden in een stagesbestand.

Herinner de opgeslagen posities en screen deze gebieden verder. Voeg in de modus voor lage dosis zoeken een vergroting van 3.900 x toe. Selecteer de gebieden met een uniforme dunne laag ijs voor dataverzameling, die worden gekenmerkt doordat ze lange buizen bevatten die boven een gat worden opgehangen.

Bewaar alle gebieden in een tweede stagesbestand. Schakel over naar de blootstellingsmodus. Voeg een vergroting van 59.000 x toe en plaats een objectiefopening van 100 micrometer.

Pas vervolgens de objectiefstigmatisering en stralingsintensiteit aan voor een dosis van ongeveer 15 elektronen per angström vierkant per blootstelling. Keer terug naar de modus voor lage dosis zoeken en ga naar een opgeslagen positie. Identificeer en centreer een goede buis.

Gebruik de CCD-camera om naar de focusmodus over te schakelen, pas de focus aan en stel een defocuswaarde in die normaal tussen 0,5 en 2,5 micrometer ligt. Schakel vervolgens over naar de blootstellingsmodus en stel een blootstellingstijd van 0,3 tot 0,5 seconden in voor een dosis van 15 elektronen per angström vierkant. Verzamel de beelden op een platencamera, laat de films 10 seconden bezinken voordat een belichting wordt gemaakt.

Na de verzameling van beelden, gaat u naar de volgende opgeslagen positie en herhaalt u dit proces om meer beelden te verzamelen. Ontwikkel de films in volle sterkte D 19 gedurende 12 minuten. Digitaliseer vervolgens de beelden met behulp van een Nikon Super cool scan 9.000 ED-scanner met een pixelgrootte van 6,35 micrometer.

Een helicoïdaal object kan worden geïndexeerd door twee parameters. De Bessel-orde N en het aantal laaglijnen L in de Fourier-transformatie van het oppervlakteraster van een helicoïdaal object. Elke laaglijn wordt gekenmerkt door N en L en komt overeen met een set lijnen op het oppervlakteraster zoals aangegeven door H en K-indices.

Om met helicoïdaal indexeren te beginnen, gebruikt u het Iman-programma Helix boxer om een relatief lange en rechte buis met een uniforme diameter uit te stippelen en slaat u het beeld op in MRC-formaat. Meet vervolgens de straal van de buis met behulp van Iman's boxer-programma. Bepaal de HEL-herhaalafstand met behulp van een programma op basis van kruiscorrelatie, zoals I-M-G-C-C-F in de MRC-pakket.

Bereken vervolgens de foyer. Transformeer met een nieuwe dooslengte die een integraal van de herhaalafstand is. Kies vervolgens twee hoofdlaaglijnen die twee basisoppervlakterastervectoren één nul en nul één in eenheden van FFT-pixel definiëren.

Bepaal de laaglijnnummers en de radii van maximale amplitude voor de twee hoofdlaaglijnen in de Fourier-transformatie. Ge