Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te bieden voor het verkrijgen van een driedimensionale structuur van helix-geassembleerde moleculen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie. Het protocol begint met de preparatie van cryo-EM-monsters middels een methode van snelle verdunning en backside blotting om de zoutconcentratie tijdelijk te verlagen bij het voorbereiden van het bevroren gehydrateerde EM-rooster. Dit proces waarborgt de eiwitstabiliteit, terwijl de achtergrondruis wordt verminderd en de signaal-ruisverhouding wordt verbeterd tijdens de daaropvolgende low-dose gegevensverzameling voor cryo-EM.

De helixale indexering van de diffractiepatronen is voltooid. Vervolgens wordt de beeldverwerking uitgevoerd, gevolgd door een 3D-reconstructie in de reële ruimte, wat resulteert in de uiteindelijke dichtheidskaart van het HIV-1-capside of de ca-buis. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben, aangezien er verschillende kritieke punten zijn voor een optimale gegevensverzameling en -analyse.

Neem bijvoorbeeld het geval van HIV, waarbij capsid-tubulaire assemblages die alleen in één molaire bronoplossing vormen, de zoutconcentratie snel verminderen zonder de structuur te beïnvloeden. Het is essentieel om cryo-EM-beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen. Gegeven een afbeelding van een tube is het zeer moeilijk om te bepalen hoe een kritische tube geïndexeerd moet worden en welke software kan worden overwogen voor 3D-reconstructie.

Deze video biedt een gedetailleerde en eenvoudige aanpak om een 3D-reconstructie van fysieke objecten te verkrijgen en kan als referentie voor uw experiment dienen. Ik zal de procedure demonstreren samen met Dr. Puja. Wij zijn beiden postdocs van Dr. Laboratory. Om de HIV-1 capsid-eiwitassemblages voor cryo-EM voor te bereiden, begint u met het glow-dischargen van de koolstofzijde van 200 mesh koperen grids bij 25 milliamps gedurende 25 seconden.

Gebruik een vernevelaar om de luchtvochtigheid in de omgevingskamer, die een zelfgemaakte handmatige zwaartekrachtplunjer is, op 80% te brengen. Koel ondertussen vloeibaar ethaan in een vitro-fles plunjerdoer met vloeibare stikstof en monteer de plunge-vriesdoer op de handmatige zwaartekrachtplunjer. Gebruik vervolgens een pincet om de klemmen op de rand van het raster te sluiten.

Breng 2,5 µL van een vooraf samengestelde eiwitoplossing aan op de koolstofzijde van het raster. Plaats vervolgens de pincet in de plunger met de koolstofzijde van het raster naar buiten gericht. Voeg drie µL laagzoute verdunningsbuffer toe aan de achterzijde van het raster.

Dep de grid direct aan dezelfde zijde met een stuk filterpapier. Houd het gehele achteroppervlak van de grid ongeveer zes seconden nauw in contact met het filterpapier. Dompel de grid direct na het verwijderen van het filterpapier in vloeibaar ethaan.

Verwijder tot slot de pincet uit de plunjer en plaats het rooster snel in een bewaardoos voor roosters. Start de cryo-elektronenmicroscopie door het bevroren gehydrateerde rooster in een FEI polar G two elektronenmicroscoop te laden, die werkt bij 200 kilovolt en is uitgerust met een gatin 4K by 4K CCD-camera.

Voeg bij de zoekmodus voor lage dosis een vergroting van ongeveer 200 x toe. Scan het gehele raster op gebieden met geschikt ijs. Sla de posities van deze gebieden op in een stage-bestand.

Roep de opgeslagen posities op en scan deze gebieden verder. Voeg een vergroting van 3.900 x toe in de low dose search-modus. Selecteer de gebieden met een uniforme dunne ijslaag voor datacollectie, die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van lange buisjes die boven een gat zweven.

Sla alle gebieden op in een bestand voor de tweede fase. Schakel over naar de belichtingsmodus. Stel een vergroting in van 59 000 x en plaats een objectiefdiafragma van 100 micrometer.

Stel vervolgens het stigmatisme van het objectief en de bundelintensiteit in voor een dosis van ongeveer 15 elektronen per ångström kwadraat per belichting. Keer terug naar de zoekmodus met lage dosis en ga naar een opgeslagen positie. Identificeer en centreer een geschikte tube.

Schakel met de CCD-camera over naar de focusmodus, stel de focus in en stel een defocuswaarde in die gewoonlijk tussen 0,5 en 2,5 micrometers ligt. Schakel vervolgens over naar de belichtingsmodus en stel een belichtingstijd van 0,3 tot 0,5 seconden in voor een dosis van 15 elektronen per angstrom squared. Verzamel de beelden met een plaatcamera, waarbij de films 10 seconden de tijd krijgen om te stabiliseren voordat er een belichting wordt gemaakt.

Nadat de beelden zijn verzameld, gaat u naar de volgende opgeslagen positie en herhaalt u dit proces om meer beelden te verzamelen. Ontwikkel de films in onverdunde D 19 gedurende 12 minuten. Digitaliseer vervolgens de beelden met een Nikon Super cool scan 9, 000 ED-scanner met een pixelgrootte van 6.35 micrometers.

Een helixvormig object kan worden geïndexeerd door twee parameters: de Bessel-orde N en het laaglijnnummer L in de Fourier-transformatie van het oppervlakrooster van een helixvormig object. Elke laaglijn wordt gekenmerkt door N en L en komt overeen met een set lijnen op het oppervlakrooster, aangeduid door H- en K-indices.

Om te beginnen met de helische indexering, gebruik het programma Helix boxer van Iman om een relatief lange en rechte buis met een uniforme diameter te selecteren en sla de afbeelding op in MRC-formaat. Meet vervolgens de straal van de buis met behulp van het programma boxer van Iman. Bepaal de HEL-herhalingsafstand met behulp van een programma op basis van kruiscorrelatie, zoals I-M-G-C-C-F in het MRC-pakket.

Bereken vervolgens de foyer. Transformeer met een nieuwe box-lengte die een veelvoud is van de herhalingsafstand. Kies daarna twee hoofdlagenlijnen die twee basisvectoren van het oppervlakrooster definiëren: één nul en nul één in FFT-pixeleenheden.

Bepaal de layerline-nummers en de radii van maximale amplitude voor de twee belangrijkste layerlines in de Fourier-transformatie. Gegeven de layerline-nummers en de waarden van de Bessel-ordes voor de twee belangrijkste layerlines, kunnen de rotatie tussen subeenheden en de axiale stijging van de one-star helix worden verkregen met behulp van de selectieregel zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Deze twee reële getallen beschrijven de schroefsymmetrie van de tube.

De 3D-reconstructie begint met partikelsegmentatie met behulp van het programma Iman.Boxer. Nadat een micrograaf met helic-partikels is geopend, wordt een partikel in overlappende segmenten gesneden in het controlepaneel van boxer. Kies de helix-modus en stel de parameters voor het boxing in.

De grootte van het kader moet groter zijn dan de diameter van het deeltje en de waarde voor OLA moet ongeveer 90% van de kadergrootte bedragen. Na het verlaten van dit scherm zal het klikken op een van de uiteinden van het deeltjeskader automatisch een reeks deeltjeskaders langs de lengte van de helix genereren, waarbij de ingekaderde segmenten en hun coördinaten worden opgeslagen. De volgende stap is het uitvoeren van de initiële 3D-reconstructie met de iteratieve helix real-space reconstructiemethode I-H-R-S-R voorafgaand aan de verdere verwerking met I-H-R-S-R.

Inverseer het contrast van de cryo-EM-beelden en pas een LOWPASS-filter toe. Open vervolgens de grafische interface van het I-H-R-S-R-programma door generator in te typen. Voer in de grafische interface alle informatie voor de stack met boxed particles in, inclusief de naam en het pad van de stack, het aantal beelden in de stack en de waarden voor de symmetrieparameters.

Klik op de knop 'finish' om het reconstructiescript te maken. B 25 SP.I Gebruik een massieve of holle cilinder als initiële referentie en laat de procedure cyclen totdat er geen wijzigingen meer optreden in de gedefinieerde schroefsymmetrie, wat meestal na enkele cycli gebeurt. Een rechtse helixsymmetrie zou moeten leiden tot een stabiel geconvergeerde reconstructie.

De reconstructie die in de laatste cyclus is gegenereerd, zal worden gebruikt als initiële referentie voor verdere verfijning. Voer ten slotte een 3D-reconstructie uit met iteratieve verfijning, waarbij de 3D-dichtheidskaart die door I-H-R-S-R is gegenereerd, als initiële referentie wordt gebruikt voor aanvullende verfijning tijdens het proces. De helixsymmetrie is gefixeerd op de rotatie tussen subeenheden en de axiale stijging, welke zijn bepaald via de I-H-R-S-R-procedure.

Bepaal vervolgens de defocus en het astigmatisme in de micrografie met de programma's CTF find three en CTF tilt via de spider-programma's FT en mu; vermenigvuldig de partikelsegmenten met de contrastoverdrachtsfunctie (CTF). Voer projectiematching uit door projecties van de referentievolumes te vergelijken met de CTF-gecorrigeerde beelden met behulp van multi-referentie-uitlijning. De variatie in de out-of-plane tilt-hoek is beperkt tot plus of min 10 graden en wordt gesampled in stappen van één graad; introduceer beperkingen zoals hoge correlatiecoëfficiënten bij in-plane hoeken nabij 0 graden of 180 graden en beperkte X-verschuivingen.

Wat betreft de uitlijningsparameters van elk segment worden bij de reconstructie alleen die segmenten opgenomen die aan de restricties voldoen. Na elke iteratieve verfijningscyclus wordt er een 3D-reconstructie gegenereerd met behulp van back projection en gedeeld door een bepaalde waarde over de CTF in het kwadraat, waarbij de helicale symmetrie wordt toegepast om een symmetrievolume te genereren. De iteratieve verfijning wordt beëindigd wanneer er geen verdere verbetering meer optreedt in de resolutie van de nieuwe 3D-reconstructie.

Een enkele HIV-1 capsid-assemblage, een 92 e buis, werd uitgesneden en de Fourier-transformatie ervan werd berekend voor helix-indexering van de twee radii; de layer-line nummers en de radii van maximale amplitude voor layer lines één nul en nul één werden bepaald. Eindwaarden van -12 en 11 werden vervolgens respectievelijk berekend voor één nul en nul één met een herhalingsafstand van 5195,48 angstroms. De schroefsymmetrie van de buis werd bepaald als delta Z gelijk aan 6,81 angstroms en delta vijf gelijk aan 328,88 graden; delta Z en delta vijf werden verfijnd tot 7,13 angstroms en 328,86 graden met behulp van I-H-R-S-R, waarna na 10 iteratieve cycli een initiële reconstructie werd gegenereerd.

De uiteindelijke reconstructie na iteratieve verfijning verbeterde de dichtheidskaart aanzienlijk ten opzichte van het initiële model dat met I-H-R-S-R was berekend. De dichtheidskaart van de capsid-assemblagetubuli wordt weergegeven als drie orthogonale doorsneden parallel aan de as van de tubulus en dicht bij het oppervlak, loodrecht op de as van de tubulus en parallel aan en door de as van de tubulus. De getoonde structuur is het resultaat van surface rendering van de 3D-dichtheidskaart met een contour van 1,8 Sigma, wat 100% van het volume omsluit.

Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed begrip moeten hebben van hoe u een 3D-structuur van een samengesteld molecuul kunt verkrijgen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie.