Karakteriseren Herbivore resistentiemechanismen: Spittlebugs op Brachiaria Spp. als een voorbeeld

Hallo, mijn naam is Ush Bara en ik ben entomoloog bij het International Center for Tropical Agriculture. Het algemene doel is om via video een methode te demonstreren om mechanismen van gastplantresistentie tegen herbivorie te karakteriseren ter ondersteuning van samenwerkingsinspanningen, namelijk ons kweekinitiatief om de resistentie tegen landbouwspitbugs te verbeteren. Hierbij dienen grassen als voorbeeld.

Spuugwantsen zijn ernstige plagen voor veel economisch belangrijke grassen, waaronder tropische weidegrassen, suikerriet en maïs. In de Amerikaanse tropen zijn weidegrassen behorend tot het geslacht bacteria hun belangrijkste waardplanten. Een plant kan zich tegen schade door herbivoren verdedigen via drie brede mechanismen.

Antibiose, intolerantie of soms non-preferentie is de mate waarin een plant wordt vermeden wanneer de herbivoor in staat is om planten te selecteren. Antibiose wordt doorgaans vastgesteld in keuzeproeven waarbij herbivoren toegang krijgen tot meer dan één genotype. Antibiose is de mate waarin de plant de fitness beïnvloedt van de herbivoor die ervan voedt.

Ten slotte is tolerantie de mate waarin de plant schade veroorzaakt door de HBO kan weerstaan of herstellen zonder de groei en voortplanting van de HBO in gevaar te brengen. Zowel antibiotica als tolerantie kunnen het beste worden aangetoond in 'no choice'-testen, waarbij de hbo's worden opgesloten en daardoor gedwongen worden zich van één enkele plant te voeden. Onze video demonstreert een 'no choice'-test die is ontworpen om de antibiotica-intolerantie van de spuugluis IV te schatten. Bij grassoorten in aria is de resistentie van de waardplant een cruciale tactiek voor de beheersing van de spuugluis.

Echter, resistentie gebaseerd op sterke antibiotica zou selectiedruk kunnen creëren voor meer virulente plaagbiotypen. Aan de andere kant zou resistentie gebaseerd op tolerantie ervoor zorgen dat populaties van de spuithond kunnen blijven groeien totdat de aantallen de plant overweldigen. Duurzame resistentie kan daarom bepaalde niveaus van zowel antibiotica als tolerantie vereisen.

Dit protocol demonstreert hoe de relatieve bijdragen van elk tot de resistentie tegen spit bugs kunnen worden geschat. De Aria-genotypes zijn afkomstig uit de kiemplasmabank van het International Center for Tropical Agriculture. De planten worden vegetatief vermeerderd uit enkelvoudige stamsnoedels, afkomstig van volwassen planten die als experimentele eenheden worden gebruikt.

De stekken worden teruggesneden tot 10 centimeter om uniformiteit van het plantmateriaal te waarborgen en besmetting door plantpathogenen te voorkomen. De stekken worden gedurende twee minuten gewassen in een 3% natriumhypochlorietoplossing en vervolgens grondig afgespoeld met kraanwater. Elke stek wordt geplant in ongeveer 36 gram steriele grond in een PVC-buis, die aan de onderzijde is afgedicht met een gedeelte van een piepschuimbeker en is afgesloten met een PVC-bus.

De stek wordt op zijn plaats gehouden door een schuimrubberen ring die in de centrale opening van de bussing is geplaatst. De planten worden bemest en er is water nodig om een adequaat bodemvochtgehalte te behouden. De planten groeien gedurende één maand voordat ze worden blootgesteld aan insecten, wat de ontwikkeling van oppervlakkige wortels mogelijk maakt, die dienen als voedingsplaatsen voor wortelvretende insecten.

Het omkeren van de planten in het spittle bog NIMS gedurende acht dagen vóór infestatie stimuleert de groei van oppervlakkige wortels verder, waardoor gedeeltelijk wordt gecorrigeerd voor inherente verschillen in de wortelarchitectuur. Deze stap vereist een kunstmatige lichtbron, die wij 24 uur per dag aanbieden. Planten met weinig of geen oppervlakkige wortels.

Na deze inversie worden de behandelingen uit het experiment verwijderd. 30 dagen na het planten wordt elke plant aan het bodemoppervlak geïnfecteerd met zes volwassen eieren afkomstig uit onze spittle bug-kolonies. Om deze kolonies op te zetten, worden volwassen spittle bugs in het veld verzameld, geïdentificeerd op soortniveau en in kooien geplaatst waar zij bladvertering van vatbare aria krijgen om van te voeden. De vrouwtjes leggen hun eieren in grond die zich bevindt in een ondiepe verwijderbare tray, geplaatst op de bodem van de kooien.

Na enkele dagen wordt de bodem in water gesuspendeerd en door een reeks zeven geleid om de eitjes te verzamelen. Het suspenderen van het materiaal in een 30% zoutoplossing zorgt ervoor dat de rijpe eitjes gaan drijven, terwijl onrijpe eitjes achterblijven op het overgebleven organische materiaal. Om contaminatie door insectenpathogenen te voorkomen, worden de eitjes vijf minuten gedesinfecteerd in een 0,5% natriumhypochlorietoplossing en vervolgens gespoeld met gedestilleerd water; alleen rijpe eitjes die kortstondig zullen uitkomen, worden geselecteerd voor infestaties.

Ze kunnen worden geïdentificeerd aan de aanwezigheid van twee rode stippen in het voorste gedeelte, die overeenkomen met de ogen van het insect. Roze markeringen in het achterste gedeelte komen overeen met het abdomen van het insect, en een volledig uitgezette a perm. Een succesvolle uitkomst wordt vier dagen later bevestigd, waarna elk niet uitgekomen ei wordt vervangen door een neonataal spitblok.

Uit onze kolonietest. Planten zijn gerangschikt in een gerandomiseerd volledig blokontwerp met zes herhalingen. Het experiment wordt ongeveer 30 dagen na infestatie geëvalueerd.

De score voor plantenschade geeft een schatting van de tolerantie. Terwijl de score voor insectenoverleving een schatting geeft van de antibioticumgevoeligheid. Schade wordt gescoord met een visuele schaal van één tot vijf, waarbij één overeenkomt met geen zichtbare schade en vijf overeenkomt met de dood van de plant.

Vervolgens wordt de overleving beoordeeld door de insecten te tellen die ofwel hun laatste insteekpunt of hun volwassen stadium bereiken. Om resistentiemechanismen te categoriseren, is het nuttig om de resultaten te visualiseren met een plot waarbij de overleving van de insecten op de x-as staat en de plantschade op de Y-as. De antibioticumresistentie neemt toe naarmate men van rechts naar links beweegt.

Aan de andere kant neemt de tolerantie toe naarmate men van boven naar beneden beweegt. We beschouwen planten als resistent als de respons op herbivoren in de onderste helft van deze grafiek valt. Als deze respons in het linkerkwadrant valt, is het dominante resistentiemechanisme antibiotica.

Als de respons in het rechterkwadrant valt, is het dominante resistentiemechanisme tolerantie. Hier is een representatieve steekproef van onze screeningsgegevens. De punten bovenaan vertegenwoordigen vatbare planten.

De punten in het kwadrant linksonder vertegenwoordigen planten die resistent zijn door antibioticose. De punten in het kwadrant rechtsonder vertegenwoordigen planten die resistent zijn door tolerantie. We hebben zojuist een demonstratie gezien van een 'no choice assay' om de relatieve bijdragen van antibioticose en intolerantie aan de plantresistentie te schatten, ongeacht hoe dit werkt.

We gebruiken de resistentie tegen spuugluizen in Aria als voorbeeld, maar de gepresenteerde principes zouden relevant moeten zijn voor andere systemen. We hopen dat onze video u helpt bij uw eigen inspanningen. Veel succes.