Name: Ex vivo beeldvorming van T-cellen in muizen lymfkliertest Plakjes met Widefield en confocale microscopen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer fluorescerende T-cellen visualiseren in lymfklierplakjes van muizen met widefield- en confocale microscopie. Deze methode maakt real-time analyse van T-celmigratie mogelijk voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Alain Trautmann, die ons aangemoedigd om lymfeklier plakjes uit te voeren bedanken. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Ligue Nationale Contre le Cancer, de Fondation pour la Recherche Medicale en Frankrijk en de Association pour la Recherche sur le Cancer.

1. Voorbereiden segmenten van lymfeklieren <ol><li> Bereid een 4% laag smeltpunt agarose oplossing voor de inbedding. Verdunnen agarose in PBS en een magnetron deze oplossing. Wanneer de agarose helemaal is opgelost, houden de oplossing bij 37 ° C tot aan gebruik. </li><li> Bereid een 6-well weefselkweek plaat. Voeg 1,1 ml RPMI compleet kweekmedium per goed, en plaats een organotypische filter in elk putje. Plaats de 6-well plaat staan ​​bij 4 ° C tot gebruik plakjes te dragen. </li><li> Plaats roestvrijstalen ringen, met innerlijke diameter van 4 mm, in een plastic schaaltje gevuld met RPMI volledig medium. Ringen zal verder worden gebruikt om de cellen op het vibratome gesneden plakje concentreren. </li><li> Offer van de muis in overeenstemming met de plaatselijke regelgeving voor dierenwelzijn. Verwijder voorzichtig de perifere lymfeklieren uit het omringende weefsel en leg ze in een plastic schotel met ijskoud PBS. Zorg moet worden genomen niet aan de lymfeklier structuur schade, omdat deze organen zijn erg zacht. </li><li> Giet de 4%-agarose gel in een 35-mm kunststof schotel en subtiel de knooppunten te zetten in de gel. Laat de agarosegel op ijs gedurende 5 minuten om uit te harden. </li><li> Verwijder het blok van de schotel en trim de agar om 3-5 mm van de gel te verlaten rond elk lymfeklier. </li><li> Bevestig de ingesloten knooppunten op het model schijf van de vibratome met niet-giftige lijm weefsel. Installeer het monster disk in de lade vol met ijskoude PBS. </li><li> Gedeelte van de agar-ingebed weefsel bij 320 micrometer dikte met de vibratome snelheid in te stellen op een langzame (0,3 mm / s) en de trillingsfrequentie ingesteld op een medium range (1,5 mm). </li><li> Zorgvuldig overdracht lymfeklier plakken als ze worden afgesneden op de organotypische cultuur inzetstukken met fijne pincet. Leg 3 plakjes op elke insert. Wees uiterst voorzichtig als plakjes kunnen gemakkelijk worden beschadigd. Een typische perifere lymfeklier zal opleveren vijf delen als cut op 320 um. Gooi de eerste en de laatste plakken, aangezien ze bevatten enkel oppervlakkige weefsel. </li><li> Plaats roestvrijstalen ringen op elke afzonderlijke plak. Zorg ervoor dat ringen zijn goed gepositioneerd op de agarose rondom het weefsel. </li><li> Incubeer de plaat cultuur bij 37 ° C in een 5% CO 2 bevochtigde incubator pas klaar plaat T-cellen. </li></ol> 2. Isoleren van T-cellen van muis lymfeklieren <ol><li> Isoleer T-cellen op basis van de eerder gepubliceerde Jupiter artikel 3. </li><li> Onmiddellijk gebruik van T-cellen en ga naar de volgende sectie. Anders zou lymfocyten 's nachts worden gekweekt in volledige RPMI-medium aangevuld met 10 ng / ml IL-7. </li></ol> 3. Etikettering van geïsoleerde T-cellen <ol><li> Was de cellen in HBSS. Resuspendeer ze in dezelfde buffer op 10 x 10 6 per ml. </li><li> Voeg hetzelfde volume van HBSS met 1 uM Cell Tracker groene CMFDA het geven van een uiteindelijke concentratie van 0,5 uM. </li><li> Incubeer de celsuspensie bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Twee keer wassen cellen met volledige RPMI-medium. </li><li> Resuspendeer cellen in een eindconcentratie van 10 x 10 6 per ml in volledige RPMI-medium. Deze gelabelde cellen worden uitgeplaat op de plakjes. </li></ol> Andere fluorescente kleurstoffen dan CMFDA misschien te worden gebruikt, maar houd in gedachten dat deze moleculen zijn potentieel toxische boven bepaalde concentraties. 4. Plating gelabelde T-cellen op lymfeklier plakjes <ol><li> Verwijder overtollig medium in het binnenste deel van de wasmachine met een pipet. Sta niet toe dat het weefsel droog worden; het werk snel tijdens deze stap. </li><li> Zachtjes afzien van 10 tot 20 ul gelabelde T-cellen die komt overeen met 1 tot 2 x 10 5 cellen in het binnenste deel van de wasmachine. Zorg moet worden genomen niet om het weefsel raken met de punt van de pipet. Zorg ervoor dat de druppel celsuspensie blijft op zijn plaats. </li><li> Leg de plakjes met cellen in de broedstoof bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende minstens 30 minuten om lymfocyten te migreren in het weefsel. </li></ol> 5. Imaging T-cellen in lymfeklieren plakjes In deze video-artikel, wij image fluorescerende T-cellen in lymfeklier plakjes met een groothoek omgekeerde microscoop en een confocale microscoop rechtop. <ol><li> Stel de temperatuur op 37 ° C. Onze microscopen zijn uitgerust met temperatuur-gecontroleerde kamers. </li><li> Installeer een perfusie systeem waarmee continue perfusie van de lymfeklier slice met zuurstofrijk (5% CO 2, 95% O 2) fenol rood-vrij RPMI medium. In ons systeem, doorbloed media komt in de beeldvorming kamer van een kant door de zwaartekracht. Het medium wordt afgezogen met een pomp is aangesloten op een inzameling van afval kolf. Stel de media debiet tot 1 ml / min. </li><li> Met fijne tang, delicaat nemen de slice van de 6-well plaat en dip de bereiding in warme zuurstofrijke RPMI medium voor een paar seconden om zich te ontdoen van fluorescerende cellen niet geïnfiltreerd in het weefsel. </li></ol> ImaGing T-cellen met een wide-field omgekeerde microscoop <ol start="4"><li> Leg de plak ondersteboven op een custom-made imaging kamer, die bestaat uit nylon draden gelijmd op de binnenkant van een glazen bodem schaal. In deze kamer, de nylon draden verheffen van de slice van het glas en kan de zuurstof oplossing te diffunderen in het weefsel. Dit is nodig als T-cel migratie in de lymfklieren is sterk afhankelijk van zuurstof. Zet de slice door het toevoegen op het een roestvrij stalen ring. In deze omstandigheden is de slice ligt een paar micron boven de bodem van de schaal, die de vernieuwing van de perfusie-oplossing vergemakkelijkt. </li><li> Voor het vastleggen van een groot gezichtsveld (800 x 800 micrometer, ongeveer een derde van slice het knooppunt van het oppervlak), het verzamelen van beelden met behulp van een 10x droog objectief. We vonden dat de 10x Nikon S fluor 0.5 NA was het meest geschikt voor onze analyses. </li></ol> Een typische time-lapse imaging experiment vangt 5 optische toestellen verspreid over een totale diepte van 50 micrometer in de axiale (z) dimensie. Fluorescerende T-cellen worden meestal afgebeeld met tussenpozen variërend 10 tot 30 seconden gedurende 10 tot 20 minuten. Imaging T-cellen met een confocale microscoop rechtop De confocale microscoop die in dit protocol is een Leica SP5 is uitgerust met een 20x water immersie objectief (Olympus, 20x/0.95 NA). <ol start="6"><li> Bevestig de slice om de beeldvorming fase van de microscoop. Opmerking: Wij meestal een ring op de voorbereiding om het te immobiliseren. </li><li> Stel een imaging-sessie door het verzamelen van een serie beelden langs de z-as. Om de afbeelding T-cellen in een intact weefsel structuur, is de start positie doorgaans vastgesteld op 5 tot 10 micrometer onder de eerste label T-cel. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Door het volgen van deze video-protocol moet je verwachten dat een groot aantal fluorescerende T-cellen opgebouwd in de T-zone van het knooppunt, een fenomeen dat normaal gesproken optreedt in deze bijzondere omgeving in vivo (figuur 1) te visualiseren. In het bijzonder moet T-cellen worden uitgesloten van B-cel-zones, die meestal net onder de capsule. Een succesvolle experiment zal ook resulteren in T-cellen aangeworven in het weefsel (figuur 2), het weergeven van een zeer beweeglijke gedrag (figuur 3) in overeenstemming met gepubliceerde resultaten verkregen in intacte lymfeklieren 4. Gemiddeld zou de gemiddelde snelheid van de individuele T-cellen in plakjes dicht bij 10 micrometer / min (figuur 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. T-cellen hopen zich op in een lymfeklier slice. Fluorescent gelabelde T-cellen (CMFDA, groen) werden toegevoegd aan een lymfeklier plakje 30 minuten voor Image Acquisition (bovenste foto). Het beeld is de maximale projectie van 5 beelden verspreid over 50 um in de z-richting. De heldere veld afbeelding wordt getoond in bodem. Beelden werden gemaakt met een groothoek microscoop. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. T-cellen worden gerekruteerd in een lymfeklier slice. Fluorescent gelabelde T-cellen (CMFDA, groen) werden toegevoegd aan een lymfeklier plakje 30 minuten voordat de foto acquisitie met behulp van een confocale microscoop. Beelden werden vastgelegd op het snijvlak (foto boven) en 40 micrometer beneden (onderste foto). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. T-cellen zijn zeer beweeglijk in een lymfeklier slice. Fluorescent-gelabelde T-cellen werden belicht gedurende 12 minuten met behulp van een groothoek microscoop. Trajecten van de individuele T-cellen worden weergegeven als kleur-gecodeerde tracks de toenemende verplaatsingen vertegenwoordigen van blauw (lage beweeglijke cellen) naar rood (hoge beweeglijke cellen). Sporen werden berekend op basis van Imaris software. De witte lijn volgt de rand van de knoop, terwijl de gestippelde ovaal begrenst de vermeende B-cel zone. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Binnen een lymfeklier slice, de T-cel snelheid ligt dicht bij de 10 um / min. De snelheden werden berekend op basis van Imaris software van tracks weergegeven in figuur 3.

<ol><li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li>
<li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL21+mediates+CD4%2B+T-cell+costimulation+via+a+DOCK2%2FRac-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li>
</ol>

We hebben beschreven een eenvoudige, snelle en robuuste techniek voor het genereren van lymfeklier plakken, die worden gebruikt om het gedrag van de geïntroduceerde T-cellen te onderzoeken. In de afgelopen jaren, is deze methode met succes is toegepast met behulp van de thymus en de lymfeklieren plakken aan de extracellulaire factoren die T-cel positionering en beweeglijkheid van 1,5 te identificeren. Het is ook gebruikt om Ca 2 + reacties te meten in thymocyten tijdens de positieve selectie en in de T-cellen bij herkenning antigeen 2,6. De overlay slice test biedt voordelen en beperkingen die verdienen te worden besproken. Van de nota, dit systeem maakt de toegang tot het weefsel, handig als men moet farmacologisch manipuleren plakjes in om te interfereren met de moleculaire controle van de cel migratie. Na de beeldvorming, kan de plakjes worden verwerkt voor immunohistochemie om nadere informatie over de structuren die zijn afgebeeld te verzamelen. Bovendien kan observatie worden gemaakt met een traditionele groothoek fluorescentie microscoop. Hoewel de resolutie is niet zo goed als met een confocale of een twee-foton microscoop en dat fototoxiciteit is in principe ernstiger met een-foton dan met twee-foton microscopie, het heeft de voordelen van eenvoud, een lagere kostprijs, en grotere keuze van golflengten. De beeldvorming van T-cellen in een intacte lymfeklier vereist intraveneuze injectie van gelabelde lymfocyten, die vervolgens thuis lymfoïde organen. Zoals we eerder hebben laten zien een, het schijfje test is perfect verenigbaar met adoptieve overdracht experiment. Echter, de tijd die nodig is voor de T-cellen naar huis in de lymfeklieren bemoeilijken het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die een neiging om uit te lekken van de cellen na verloop van tijd hebben. Dit is het geval van de Ca 2 + kleurstof Fura-2. Met de snelle werving (&lt;30 min) van T-cellen in het weefsel, de slice test biedt de mogelijkheid om dergelijke kleurstoffen te gebruiken. Tot slot, deze methode heeft het grote voordeel dat T-cel-functies te analyseren in verschillende menselijke weefsels in leven gehouden. Deze experimentele systeem stelt ook beperkingen die moeten worden bewaard in het achterhoofd. Schade in verband met het snijden van invloed kunnen zijn op T-cel functioneren, vooral in de oppervlakkige regio van het weefsel bij het snijvlak. Met het oog op celdood kan beoordelen binnen de slice, hebben we de fluorescente kleurstof SYTOX groen dat cellen doordringt met een verminderde plasma-membraan. Onze experimenten tonen aan dat ongeveer 20% van het totaal knooppunten cellen, meestal gelokaliseerd in de oppervlakkige regio van het weefsel, fluorescent werden gemerkt met deze nucleaire kleurstof. Een ander potentieel probleem met de test is het vermogen van de plakjes om belangrijke oplosbare factoren, waaronder de chemokines te behouden. Hoewel, we hebben geen indicatie dat onze gegevens werden getroffen door deze problemen, omdat T-cellen vertonen een goede beweeglijkheid binnen de slice, willen we het belang van beeldvorming T-cellen bij gezonde regio&#39;s ligt op enkele tientallen microns van het snijvlak stress. Overwegende dat dit kan worden gedaan met de traditionele microscopen (groothoek of confocale) zoals in dit protocol, is het waarschijnlijk dat de lymfeklier slice voorbereiding gecombineerd met twee-foton beeldvorming zal de ruimtelijke resolutie te verhogen in de diepte en vermindering van de fototoxiciteit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Fijn Forceps </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mm Cultuur inserts </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> Volledige RPMI-medium wordt gemaakt door toevoeging van 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalf serum en penicilline / streptomycine </td></tr><tr><td> Balanced Salt Hanks &#39;Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Lage temperatuur geleren Agarose, type VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butyl Cyanoacrylaat Lijm, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Roestvrij stalen ringen, 4 mm binnendiameter </td><td> Bouwmarkt </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cel Tracker groen CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo beeldvorming van t-cellen in muizen lymfkliertest plakjes met widefield en confocale microscopen

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Naïeve T-cellen voortdurend het verkeer naar secundaire lymfoïde organen, waaronder perifere lymfeklieren, om zeldzame uitgedrukt antigenen te detecteren. De migratie van T-cellen in de lymfeklieren is een complex proces dat zowel cellulaire en chemische factoren, waaronder chemokines inhoudt. Onlangs heeft het gebruik van twee-foton microscopie toegestaan ​​om T-cellen track in intacte lymfeklieren en te ontlenen enkele kwantitatieve informatie over hun gedrag en hun interacties met andere cellen. Hoewel er duidelijke voordelen aan een in-vivo-systeem, deze aanpak vergt een complexe en kostbare instrumenten en biedt beperkte toegang tot het weefsel. Voor het analyseren van het gedrag van de T-cellen in muizen lymfeklieren, hebben we een stukje test 1, oorspronkelijk opgezet door neurobiologen en recent omgezet voor muriene thymus 2. In deze techniek worden fluorescent gelabelde T-cellen geplateerd op de top van een acuut bereid lymfeklier slice. In deze video-artikel, zijn de lokalisatie en migratie van T-cellen in het weefsel geanalyseerd in real-time met een groothoek en een confocale microscoop. De techniek die een aanvulling in vivo twee-foton microscopie biedt een effectieve aanpak om de afbeelding T-cellen in hun natuurlijke omgeving en licht te werpen op mechanismen die ten grondslag liggen aan T-cel-migratie.

Dit protocol beschrijft een methode om de afbeelding fluorescerende T-cellen geïntroduceerd in lymfeklier plakjes. De techniek maakt real-time analyses van T-cel migratie met traditionele groothoek fluorescentie of confocale microscopen.

Ex vivo beeldvorming van T-cellen in muizen lymfkliertest Plakjes met Widefield en confocale microscopen

Naïeve T-cellen migreren continu naar secundaire lymfoïde organen, waaronder perifere lymfeklieren, om zeldzaam tot expressie gebrachte antigenen te detecteren. De migratie ...

Het algemene doel van deze procedure is het in beeld brengen van fluorescente T-cellen in plakjes lymfeklieren via widefield- en confocale microscopie. Dit wordt bereikt door eerst een lymfeklier van een muis te verwijderen en deze in laagsmeltende agar te embedden. De klier wordt vervolgens met een vibratoom in secties van 320 micron dik gesneden.Vervolgens worden fluorescent gekleurde T-cellen op een plakje lymfeklier geplaatst. Ten slotte worden de T-cellen die het plakje zijn binnengedrongen gevisualiseerd met behulp van widefield- en confocale microscopie. Uiteindelijk kunnen stilstaande beelden en video-opnames worden verkregen die laten zien hoe T-cellen in de lymfeklier worden gerekruteerd en welk motiel gedrag zij vertonen binnen het lymfeweefsel.Het belangrijkste voordeel van deze technieken met een bestaand metaal, zoals twee fotomicroscopie en intacte organen, is dat de T-cellen hier gevisualiseerd kunnen worden in een driedimensionaal systeem met een conventionele lichtveldmicroscoop. Bovendien maken de lichte preparaties toegang tot het weefsel mogelijk. Begin met het bereiden van een 4% laagsmeltende agarose-oplossing door agarose te verdunnen in PBS en het resulterende mengsel in de magnetron te verhitten nadat de agarose volledig is opgelost.Houd de oplossing op 37 °C tot gebruik. Vul vervolgens een plastic schaaltje met RPMI compleet kweekmedium en plaats roestvrijstalen ringetjes met een binnendiameter van 4 mm in het schaaltje.Vul een ander schaaltje met ijskoud PBS en voeg vervolgens ongeveer 1,1 milliliter RPMI toe. Maak het kweekmedium per putje in een six-well tissue culture plate aan. Plaats een organotypisch filter in elk putje van de six-well plate en zet de plaat bij vier graden Celsius.Verwijder voorzichtig de perifere lymfeklieren uit het omringende weefsel van een geëuthanaseerde muis. Disseceer de lymfeklieren zorgvuldig, aangezien deze zeer zacht zijn. Het is zeer belangrijk om al het vet uit het weefsel te verwijderen, omdat dit zeer toxisch is voor de cellen.Plaats de lymfeklieren in de plastic schaal met ijskoud PBS. Giet nu de 4% agarosegel in een plastic schaal van 35 millimeter en breng de klieren voorzichtig over naar de gel. Plaats de agarose vervolgens vijf minuten op ijs om te laten stollen. Nadat de agarose is gestold, wordt het blok uit de schaal verwijderd en wordt de agarose bijgesneden, waarbij ongeveer drie tot vijf millimeter gel rond elke lymfeklier overblijft.Gebruik vervolgens niet-toxische lijm om de ingebedde knopen op de preparatieschijf van een viome te bevestigen. Plaats de preparatieschijf in de uitneembare lade van de viome en vul de lade met ijskoud PBS. Stel de snelheid van de viome in op een laag bereik en de vibratiefrequentie op een gemiddeld bereik om het in agar ingebedde weefsel in coupes van 320 micron dikte te snijden.Gooi de eerste plak weg aangezien deze alleen oppervlakkig weefsel bevat, en gebruik vervolgens een fijne pincet om de lymfeklierschijfjes voorzichtig in de organotypische kweekinserts over te brengen terwijl ze worden gesneden. Plaats roestvrijstalen ringen op elk individueel schijfje, waarbij u erop let dat de ringen op het agar liggen en het lymfeklierenweefsel omringen zonder het te bedekken. Incubeer vervolgens de kweekplaat met de lymfeklierschijfjes bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide.Gebruik bij het voorbereiden van de T-cellen voor deze stap overnight gecultiveerde T-cellen gesupplementeerd met IL-7, die zijn geïsoleerd via CD4-positieve bead-selectie met behulp van MILTENI Biotec MagSeparator Max, zoals gedemonstreerd in het eerder gepubliceerde JoVE-artikel van Matthew en Callaghan. Was de T-cellen in HBSS gedurende vijf minuten bij 300 ×g bij 20 °C. Resuspendeer ze in vers HBSS op een concentratie van 10 × 10⁶ cellen per ml.Voeg vervolgens één micromolaire cell tracker green C-M-F-D-A toe aan een buis met HBSS en meng deze oplossing met de celoplossing tot een uiteindelijke kleurstofconcentratie van 0,5 µM. Incubeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 37 °C. Nadat de cellen tweemaal zijn gewassen met compleet RPMI-medium gedurende vijf minuten bij 300 ×g en 20 °C, worden de gelabelde T-cellen geresuspendeerd tot een uiteindelijke concentratie van 10 × 10⁶ cellen per milliliter.Haal de lymfeknoopsnijplaten uit de incubator in vers, compleet RPMI-kweekmedium. Verwijder het overtollige medium in het midden van de washer met een pipet zonder het weefsel aan te raken. Dispenseer met de pipetpunt voorzichtig 10 tot 20 µL gelabelde T-cellen in het midden van de washer.Zorg ervoor dat de druppel cel-suspensie op zijn plaats blijft. Incubeer de coupes en T-cellen gedurende ten minste 30 minuten om de lymfocyten de kans te geven in het weefsel te migreren. Stel, om te beginnen met de beeldvorming, de temperatuurregeling van de klimaatkamer op de microscoop in op 37 °C.Vul een fusiesysteem om continue perfusie van de lymfeknoopsnijplak met geoxygeneerd fenolroodvrij RPMI-medium mogelijk te maken; vul op dit moment ook een klein plastic schaaltje met geoxygeneerd RPMI en warm dit op. In het hier getoonde systeem stroomt het geperfuseerde medium door zwaartekracht van één zijde de beeldvormingskamer binnen. Het medium wordt afgevoerd met een pomp die is verbonden met een afvalopvang.Haal de met T-cellen geïnfiltreerde lymfeknoopsnijplakjes met een fijne pincet uit de incubator. Verwijder voorzichtig een snijplakje uit de zeswellplaat. Dompel het plakje enkele seconden in het voorverwarmde, gezuurstofte RPMI-medium om eventuele fluorescerende cellen die het weefsel niet zijn binnengedrongen weg te wassen.Plaats vervolgens de vers gewassen plak ondersteboven op de beeldvormingskamer. De nylon draden tillen de plak op van het glas en maken het mogelijk dat de zuurstofrijke oplossing in het weefsel diffundeert. Dit is noodzakelijk omdat de migratie van T-cellen in lymfeklieren sterk afhankelijk is van zuurstof.Zet vervolgens de plak vast door er een roestvrijstalen ringetje bovenop te plaatsen om een groot gezichtsveld te verkrijgen. Neem beelden op met een 10-voudige droge objectieflens. Plaats de vers gewassen plak lymfeklier met de bovenkant naar boven in een plastic schaaltje.Plaats een ringetje op het preparaat om het te immobiliseren. De coupes zijn nu klaar voor beeldvorming. Plaats het preparaat op de tafel van de rechtopstaande confocale microscoop en stel scherp met het 20x objectief.Start vervolgens een imagingsessie en start de acquisitie.C-M-F-D-A. Gemarkeerde T-cellen in het groen werden 30 minuten voor de beeldacquisitie aan een lymfeknoopsnijverband toegevoegd, zoals hier te zien is. Het beeld is de maximale projectie van vijf beelden die 50 microns in de Z-richting beslaan, vastgelegd met een widefield-microscoop.Dezelfde figuur is in deze video te zien als een brightfield-opname. Groen fluorescerende T-cellen die een lymfeknoopsnijplakje zijn binnengedrongen, werden gedurende negen minuten afgebeeld met een widefield-microscoop. De animatie представляет een Z-projectie van 50 micron.Let op de actieve migratie van T-cellen binnen de slice. De trajecten van individuele T-cellen uit hetzelfde microscopieveld worden hier weergegeven als kleurgecodeerde sporen om hun toenemende verplaatsing weer te geven, van blauwe cellen met een lage mobiliteit naar rode cellen met een hoge mobiliteit. De sporen zijn berekend met behulp van een Mars.De witte lijn geeft de rand van de lymfeknoop aan, terwijl de gestippelde ovalen de vermoedelijke B-celzones afbakenen. Hier werden T-cellen die aan een plakje lymfeknoop waren toegevoegd gedurende 10 minuten afgebeeld met een confocale microscoop. De animatie is een Z-projectie van 50 micron.Ja, deze techniek kan worden aangepast voor andere typen weefsel. En wat interessant is, is dat de slice de enige manier is om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de migratie en lokalisatie van T-cellen in humane tumoren, zum voorbeeld.

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Twee-foton beeldvorming heeft blootgelegd lymfocyten beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en gedurende een immuunrespons 1. Hier laten we zien adoptieve overdracht van T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de geëxplanteerd lymfeklier.

Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen

Recente ontwikkelingen in de 2-foton microscopie hebben real-time...

Intravitale Imaging van de muis knieholte lymfkliertest

This video describes the imaging of resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Real-Time Analysis of Resident T-cell Migration in Different Tumor Regions Using Confocal Microscopy

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Dit protocol beschrijft een methode om te afbeelding resident tumor-infiltreren CD8 T cellen aangeduid met fluorescently gekoppelde antilichamen binnen de menselijke longen tumor segmenten. Deze techniek staat real-time analyses van CD8 T-cel migratie met behulp van de confocal microscopie.

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

Het doel van het protocol is te tonen longitudinale intravital real-time tracking van thymocytes door laser scanning microscopie in serie implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. De transparantie van het hoornvlies en vascularisatie van de prothese zorgt voor de continu opname progenitor cel aanwerving en rijpe T-cel-uitgang.

Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

Leer fluorescerende T-cellen visualiseren in lymfklierplakjes van muizen met widefield- en confocale microscopie. Deze methode maakt real-time analyse van T-celmigratie mogelijk voor immunologisch onderzoek.

Ex vivo beeldvorming van T-cellen in muizen lymfkliertest Plakjes met Widefield en confocale microscopen

Meer video's verkennen