Windowing Kip Eieren voor Ontwikkelingsbiologie Studies

Welkom in het Kramer Lab. Ik ben Matt Korn, van de afdeling Neurobiologie en Gedrag aan de University of California Irvine. Vandaag laat ik u zien hoe u kippeneieren voorbereidt voor diverse manipulaties, waaronder het plaatsen van kraaltjes, het injecteren van kleurstoffen of in ovo exploratie.

Laten we zonder verdere vertraging beginnen. We gaan nu het ei reinigen, omdat er veel zaken in de incubator terecht kunnen komen.

We gaan dit afsluiten met tape. We willen voorkomen dat er kleine stukjes rondwaaien bij het venster waar het ei komt, om de kans te verkleinen dat het embryo sterft voordat we het willen verwijderen. Zoals u in de incubator kon zien, liggen de eieren met de brede zijde naar boven.

Wat we nu gaan doen, is het ei pakken en simpelweg op zijn zijkant draaien. Dit heeft twee doelen. Ten eerste bevindt ons venster zich dan precies hier, en ten tweede moet het embryo naar boven drijven zodat we eventuele manipulaties kunnen uitvoeren.

Ik ga er nu een paar uit het rek dat in de incubator stond in een kartonnen eierhouder plaatsen. Dit is overigens het onderdeel dat in de doos zit wanneer de eieren worden geleverd. Voor vandaag gaan we dit dus gewoon gebruiken om de eieren in vast te houden.

De exacte indeling is aan u. Ik doe het graag op deze manier, omdat ik op elk moment bij alle eieren kan en ze elkaar niet raken. Mocht ik een los eitje vinden dat gebarsten is en ik laat het vallen, dan is er voor elk ei voldoende ruimte tussen de andere.

Ik neem nu mijn gaas en maak een mooi stapeltje zoals dit, dat ik vervolgens in tweeën splits. Ik gebruik hier 70% alcohol en vul het aan totdat ik voel dat de onderkant vochtig wordt. Dat is omdat ik dit hele stapeltje ga gebruiken om alle eieren af te nemen.

Ik begin dus met een paar aan de bovenkant, ik doe echt de bovenkant maar in feite bijna het hele ei hier. Wanneer dit is voltooid, droogt de alcohol vrij snel en kunnen we vervolgens tape aanbrengen. De tape hecht goed en tegen de tijd dat ik een set heb afgerond, is de eerste meestal droog en kunnen we doorgaan naar de volgende stap in onze ei-preparatie.

Plaats dit dus opnieuw terug in de afvalbak en we zijn klaar voor de volgende stap. Nu al onze eieren met alcohol zijn afgeveegd, kunnen we een afvoergaatje maken aan de brede zijde van het ei, de basis van het ei. Dit stelt ons in staat om wat albumine te extraheren, want als we het albumine niet verwijderen, zal het embryo niet goed gepositioneerd zijn.

We kunnen geen manipulaties uitvoeren. Daarom gebruik ik simpelweg een mesje om deze plastic tape te verwijderen. Het is een beetje elastisch, wat erg handig is.

Het stelt ons niet alleen in staat om over een gat uit te breiden als dit iets groter is dan gewenst, maar wanneer we het ei daadwerkelijk volledig afdekken, moeten we dit uitrekken. Zo wordt het gebied waar het venster komt volledig bedekt. Ik zal het stuk dus op deze manier afsnijden en vervolgens een strip van ongeveer een millimeter maken.

Daarna kan ik hiermee een stukje tape van ongeveer een vierkante millimeter maken. Vervolgens plaats ik dit vlak boven links van de datum. Ik zet het gewoon daar neer en u kunt het zien.

Het hecht erg goed. Daarna kan ik teruggaan naar de strip die ik al heb gemaakt, en er nog een stukje tape van een millimeter afsnijden. En opnieuw, plaats dit simpelweg links van het getal daar, wat eigenlijk de bovenkant van het ei is.

Nu we het zijwaarts hebben gedraaid, bevindt het zich rechts. En hier nog één onderdeel. Ik draag nu geen handschoenen, want door handschoenen te dragen zou deze tape aan de handschoenen blijven plakken en ik heb mijn handen gewassen.

Ik maak me op dit moment geen zorgen over mogelijke contaminatie van het actieve monster. Daarom gebruik ik een schaar met een scherpe punt. Ik steek deze in het midden van waar ik de tape heb geplaatst en draai deze in een tegenstroomse richting totdat ik voel dat deze een beetje breekt.

En u zult zien dat er daar een klein gaatje zit. Dit gaatje hoeft niet erg groot te zijn, want zodra we de spuit erin plaatsen, wordt het gat groot genoeg gemaakt. Dit doen we om te voorkomen dat we direct met een naald naar binnen gaan en proberen het ei daarmee te breken, omdat dit er vaak toe leidt dat de gehele zijkant van het ei openscheurt.

Dan kunnen we het ei niet meer gebruiken. Oké, ik ga nu het ei leegtrekken. We hebben dat mooie kleine gaatje aan de zijkant en ik ga deze spuit van 10 milliliter en een naald met een vrij grote gauge gebruiken om het albumine te extraheren.

Nu wil ik ongeveer drie of vier milliliter, zeker meer dan drie, maar niet veel meer dan vier en een half of vijf. Dit zorgt ervoor dat ons embryo, dat nu bovenop ligt, een beetje van de schaal afzakt. Vervolgens kunnen we onze manipulaties uitvoeren.

Door onder een hoek van 45 graden naar binnen te gaan, bevind ik me onder de dooier. Vervolgens draai ik hem een klein beetje naar rechts om eronderdoor te glippen; je kunt voelen dat de naaldpunt net de bodem van het ei raakt. Ik ga nu ongeveer drie of vier extracties uitvoeren en het komt er vrij gemakkelijk uit.

Ik zal het albumine nu in mijn afvalbakje doen en vervolgens kan ik doorgaan met de andere eieren. Oké, ik ga nu verder. Zoals u hier kunt zien, is het gat dat ik voor de drainage heb gemaakt iets groter dan ik zou willen, maar dat blijkt geen probleem te zijn.

Waar ik me zorgen over maak, is dat ik het ei niet verder beschadig tijdens het inbrengen van de naald. Dus ik ga dat nu doen. Oké, ik zie al dat het ei al een klein barstje heeft.

Kleine barstjes zijn acceptabel, maar het is zorgwekkend wanneer deze zich uitbreiden naar een ander vlak van het ei. En in dit geval is dat het geval. Dat is te zien aan het gat.

Het loopt vrijwel door tot aan de bovenkant. En inderdaad, dit is waar ons venster zal komen te zitten. Dus helaas voor dit ei, zullen we dit exemplaar moeten weggooien.

En er is niets bijzonders aan het weggooien ervan. U hoeft hiervoor geen specifiek protocol op te stellen of iets dergelijks. We kunnen het gewoon in de afvalbak gooien.

We gebruiken deze zwarte vuilnisbakken om aan te geven dat het om dierlijk afval gaat, maar verder is alles al geregeld. We kunnen doorgaan naar het volgende ei. Oké, nu we alle eieren hebben geleegd, kunnen we het afvoergat afdekken.

Dit is belangrijk, want als we dit niet doen in de incubator, kan er een enorme verdamping optreden van het resterende albumine. En een ei dat uitdroogt, is een ei dat doodgaat. Daarom gaan we nu een stuk tape van ongeveer dezelfde grootte nemen en dit over het gat plakken, zodat we ons geen zorgen meer hoeven te maken over dit gat.

In sommige gevallen, als u besluit dat u meer albumine uit een ei wilt draineren nadat het is geopend, fungeert dit gat als een soort afgesloten gebied waar u vervolgens een naald in kunt steken zonder dat er veel albumine verloren gaat. Oké, klopt dat? Oké, we gaan nu de eieren afdekken met een passend stuk plakband.

Ik vergelijk dit een beetje met het plakken van een stukje tape op een ballon voordat je er een speld in steekt. Het mooie is dat de ballon dan niet knapt, en in dit geval plakken we een stukje tape over het ei. Het ei barst dan niet op meerdere plaatsen, waardoor het venster vervolgens kan worden afgedicht. Wanneer het venster sluit, zorgt het gebruik van de tape voor een goede afsluiting, zodat we ons geen zorgen hoeven te maken over verdamping.

Zo kunt u de grootte van de tape zien; het is waarschijnlijk het grootste stuk dat ik tot nu toe heb geknipt, maar zelfs dan ga ik het nog een klein beetje uitrekken en er echt aan trekken, met een beetje spanning, en het over het ei plaatsen. Daarna ga ik via de achterkant heel voorzichtig over het ei rekken, zodat er geen kreukels ontstaan precies daar waar mijn venster komt te zitten. U kunt de tape daarna nog een beetje bijstellen.

Het plakt niet zo erg dat u zich daar zorgen over hoeft te maken. Eenmaal vastgeplakt, blijft het zitten. En u kunt zien dat dit algemene gebied hier de plek is waar ik het venster ga uitsnijden.

Nu we tape op alle eieren hebben aangebracht, kunnen we een venster in de bovenkant snijden. Dit kan het moeilijkste gedeelte zijn en vaak is dit het punt waarop u de meeste eieren verliest. Daarom ga ik mijn schaar grondig afnemen met gaas gedrenkt in alcohol en deze vervolgens droogmaken.

Alcohol droogt vrijwel vanzelf op, maar u wilt niet dat de alcohol direct in het ei terechtkomt. Daarom ga ik precies in het midden van de tape naar binnen en gebruik ik opnieuw die beweging met de klok mee en tegen de klok in tot ik hoor dat het een beetje kraakt. Dan weet ik dat mijn mesje naar binnen is.

Vervolgens beweeg ik de schaar naar buiten zodat deze bijna vlak tegen het oppervlak van het ei ligt. Daarna maak ik kleine knipjes tot de hele schaar erin past. Wanneer ik een halve cirkel heb gemaakt, ga ik de andere kant op; ik wil de cirkel niet volledig sluiten omdat ik een opening wil behouden, waarna ik het ei kan openen.

En op dit moment lijken ze ongeveer de leeftijd te hebben die ik had verwacht; ze hebben niet heel veel bloedvaten, maar er is wat bloed rondom waar het embryo ligt, voornamelijk vanuit de delion-regio waar het bloed nu is begonnen en de hartslag is gestopt. Ik ga het nu dichtdoen, het gewoon zo laten liggen en er later opnieuw naar kijken en dan zal ik de vensters sluiten. En opnieuw, gewoon vlak op het oppervlak en terug de andere kant op.

En goed, we hebben hier een paar belletjes en het blijkt dat het embryo aan de zijkant ligt. Er zijn nu twee dingen die we kunnen doen. Als we voldoende eicellen hebben en het niet erg vinden om niet elke enkele te gebruiken, kunnen we deze gewoon weggooien.

Of wat we kunnen doen, is het venster sluiten en het zo instellen dat het embryo weer naar boven drijft, naar de plek waar we het willen hebben. Tegen de tijd dat we tot de manipulaties overgaan, bevindt het zich mogelijk op de gewenste positie. Als dat niet het geval is, kunnen we het op dat moment weggooien.

Ik heb het hier simpelweg onder een hoek geplaatst. Er zal een kleine hoeveelheid albumine weglopen, maar dat helpt het embryo terug te keren naar de juiste positie. Oké, nu we al deze vensters hebben, moeten we ervoor zorgen dat ze gesloten zijn; we willen dat ze gesloten zijn voordat we enige manipulaties uitvoeren.

Vervolgens kunnen we het ei weer verzegelen. Als er een opening overblijft, kan de dooier er soms uitglijden. Als het ei een beetje kantelt terwijl u van de ene naar de andere kamer loopt, wilt u niet dat de hele inhoud eruit valt.

Ik knip dus een stukje plastic tape van ongeveer twee of drie millimeter lang, sorry, breed, en ik plaats dit in het midden. Als ik het vervolgens voor het ei naar beneden kan trekken, zorgt dat ervoor dat het strak komt te zitten.

En u kunt zien waar het venster past, precies waar de andere tape zat, waar we het venster hebben uitgesneden, waardoor het voor nu redelijk goed is afgesloten. Ik bedoel, we gaan over een minuutje enkele handelingen uitvoeren, dus het hoeft niet volledig luchtdicht te zijn. Dat is hoe u uw eieren voorbereidt en voorziet van een venster.

Veel succes met uw experimenten.