Name: Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Leer hoe je menselijke microvasculaire netwerken bioengineert in immunodeficiënte muizen met ECFCs en MSCs in een collageen/fibronectine gel. Deze methode biedt een eenvoudig alternatief voor chirurgische implantatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie ​​K99EB009096-01A1 naar JM-M.

1. Voorbereiding <ol><li> Maak EGM-2 medium (500 ml) <ul><li> Voeg 100 ml foetaal bovine serum (FBS) tot 395 ml Endotheliale Basale Medium (EBM-2). </li><li> Voeg 5 ml van de 100x-Glutamine penicilline-streptomycine-oplossing (GPS). </li><li> Voeg alle EGM-2 SingleQuots supplementen, behalve voor hydrocortison (dat wil zeggen, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, Heparine, ascorbinezuur, en GA-1000). </li><li> Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte vacuüm filter. </li></ul></li><li> Maak MSCGM medium (500 ml) <ul><li> Voeg 5 ml 100x GPS tot 440 ml van mesenchymale stamcellen Basale Medium (MSCBM). </li><li> Voeg de volledige inhoud van de MSCGM SingleQuots kit. </li><li> Voeg hFGF-B aliquot van EGM-2 SingleQuots supplementen. </li><li> Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte vacuüm filter. </li></ul></li><li> Maak DMEM medium (500 ml) <ul><li> Voeg 50 ml foetaal bovine serum (FBS) tot 440 ml 1x hoge glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). </li><li> Voeg 5 ml 100x GPS. </li><li> Voeg 5 ml van de niet-essentiële aminozuren oplossing. </li><li> Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte vacuüm filter. </li></ul></li><li> Maak collageen / fibronectine-oplossing (3,6 ml; gemaakt op dezelfde dag van de injectie) <ul><li> Voeg 0,4 ml van 10x DMEM tot 150 pi gedestilleerd H 2 O. </li><li> Voeg 100 ul van 1 M HEPES (25 mM def.) </li><li> Voorzichtig, voeg 2,4 ml van runderen collageen (5 mg / ml bouillon, 3 mg / ml definitief) en meng voorzichtig op het ijs. </li><li> Stel de pH naar neutraal door toevoeging van 1 N NaOH-oplossing (ongeveer 30 pi). </li><li> Gebruik fenolrood indicator voor neutrale pH-waarde te kunnen beoordelen; alternatief, gebruik pH-test papier om de pH te controleren. </li><li> Voeg 120 ul van de menselijke fibronectine (1 mg / ml bouillon; 30 ug / ml definitief) </li><li> Voeg 0,4 ml van de FBS (10% definitief) </li><li> houden oplossing op ijs tot gebruik. </li></ul></li><li> Maak fibrinogeen-oplossing (1 ml; gemaakt op dezelfde dag van de injectie) <ul><li> Voeg 30 mg in poedervorm fibrinogeen tot 1 ml 0.9N NaCl (pH 7,4)-oplossing (30 mg / ml def.) </li><li> Voorafgaand aan het gebruik, incubeer de fibrinogeenoplossing bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Meng voorzichtig, zonder vortexen, voorafgaand aan de toevoeging ervan aan het collageen / fibronectine gel. </li></ul></li><li> Maak trombine-oplossing (200 ml) <ul><li> Voeg een KU van poedersuiker trombine tot 200 ml 0,9% NaCl normale fysiologische zoutoplossing (50 U / ml). </li><li> Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte spuitfilter en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Voor gebruik verdunnen met 0,9% NaCl fysiologische zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 10 U / mL. </li></ul></li><li> Maak 1% gelatine-oplossing (500 ml) <ul><li> Voeg 5 g gelatine in poedervorm tot 500 ml van fosfaat Dulbecco's gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Filter gesteriliseerd met een 0,2-um poriegrootte vacuüm filter. </li></ul></li><li> Coat 100-mm kultuurplaten met 1% gelatine coating-oplossing <ul><li> Voeg 10 ml van 1% gelatine oplossing voor iedere 100-mm weefselkweek plaat. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 60 minuten. </li><li> Voorafgaand aan het gebruik, verwijder dan de gelatine-oplossing en een keer wassen van de platen met PBS. </li></ul></li></ol> 2. Cultuur van de mens navelstrengbloed afgeleide Endotheliale Colony Forming-Cells (ECFCs) Dit protocol veronderstelt bevroren flacons van ECFC zijn beschikbaar in het laboratorium voor dit experiment. ECFC kunnen worden geïsoleerd van de mononucleaire cel fractie van een van beide navelstrengbloed of volwassene perifeer bloed, zoals eerder beschreven 7. <ol><li> Dooi een flacon van ECFCs (meestal 0,5-1x10 6 cellen in 1 ml van de bevriezing media) uit de vloeibare stikstof opslagtank en onmiddellijk de inhoud ervan te verdunnen in een 15-mL conische buis met 10 ml DMEM medium. Draaien op 1200 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de cel pellet in 10 ml warm EGM-2 medium. </li><li> Voeg de 10 mL ECFC suspensie in een 1% gelatine gecoate 100-mm weefselkweek plaat. Plaats de plaat in een vochtige incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. De volgende dag, Zuig voorzichtig uit niet-gebonden cellen en het medium, en diervoeders gebonden cellen met 10 ml vers EGM-2 medium. </li><li> Voer de plaat om de 2-3 dagen met EGM-2 medium. Laat cellen uit te breiden zodanig dat de plaat wordt gedekt door een confluente cellulaire monolaag. Bij samenloop, subcultuur de cellen als volgt: </li><li> Aspireren uit het kweekmedium en was de cellen met 10 ml PBS. </li><li> Verwijder de PBS en voeg 2 ml trypsine-EDTA oplossing voor iedere 100-mm plaat. Schud de platen om gelijkmatig te verdelen de trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 3-5 minuten. Tik voorzichtig de plaat naar de vrijstaande cellen in suspensie zie onder een omgekeerde microscoop. </li><li> Wanneer de cellen helemaal los, voeg 8 ml van de EGM-2 medium en het verzamelen van de cel oplossingTIE in een 15-mL conische buis. Neem 10 pi om de cellen te tellen in een hemocytometer en uit te werken het totaal aantal geoogste cellen. </li><li> Het bord van de cellen in 1% gelatine beklede weefsel cultuur platen bij een seeding dichtheid van 5000 cellen / cm 2 met behulp van EGM-2 medium. Leg de platen in de incubator en ze voeren om de 2-3 dagen met EGM-2 medium. </li></ol> Herhaal deze procedure voor de volgende passages. Blijf op de hoogte van de passage nummer als de cel bevolking is uitgebreid. ECFCs zal worden gebruikt tussen de passages 4-8. 3. Cultuur van de mens beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) Dit protocol veronderstelt bevroren flesjes van het menselijke MSC zijn beschikbaar in het laboratorium voor dit experiment. MSC kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg zuigt zoals eerder 11 beschreven. <ol><li> Dooi een flacon van MSC's (meestal 0,50-1x10 6 cellen in 1 ml invriezen media) uit de vloeibare stikstof opslagtank en onmiddellijk de inhoud ervan te verdunnen in een 15-mL conische buis met 10 ml DMEM medium. Draaien op 1200 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de cel pellet in 10 ml warm MSCGM medium. </li><li> Voeg de 10 mL van de MSC-suspensie in een ongestreken 100-mm weefselkweek plaat. Plaats de plaat in een vochtige incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. De volgende dag, Zuig voorzichtig uit niet-gebonden cellen en het medium, en diervoeders gebonden cellen met 10 ml vers MSCGM medium. </li><li> Voer de plaat om de 2-3 dagen met MSCGM medium. Laat cellen uit te breiden zodanig dat de plaat 80% van de samenvloeiende cellulaire monolaag bereikt. Bij 80% confluentie, subcultuur de cellen als volgt: </li><li> Aspireren uit het kweekmedium en was de cellen met 10 ml PBS. </li><li> Verwijder de PBS en voeg 2 ml trypsine-EDTA oplossing voor iedere 100-mm plaat. Schud de platen om gelijkmatig te verdelen de trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3-5 minuten. Tik voorzichtig de plaat naar de vrijstaande cellen in suspensie zie onder een omgekeerde microscoop. </li><li> Wanneer de cellen helemaal los, voeg 8 ml MSCGM medium en het verzamelen van de cel-oplossing in een 15-mL conische buis. Neem 10 pi om de cellen te tellen in een hemocytometer en uit te werken het totaal aantal geoogste cellen. </li><li> Het bord van de cellen in weefselkweek ongecoate platen bij een seeding dichtheid van 10.000 cellen / cm 2 met behulp van MSCGM medium. Leg de platen in de incubator en ze voeren om de 2-3 dagen met MSCGM medium. </li></ol> Herhaal deze procedure voor de volgende passages. Blijf op de hoogte van de passage nummer als de cel bevolking is uitgebreid. MSC's zal worden gebruikt tussen de passages 4-8. 4. Resuspensie van cellen in Collageen / fibronectine / fibrinogeenoplossing (Dag 0) Voorafgaand aan het experiment, zorg ervoor dat er voldoende ECFCs en MSC's in cultuur; 0.8x10 6 ECFCs en 1.2x10 6 MSC's nodig zullen zijn voor elk implantaat en muis. <ol><li> Aspireren uit het medium van elke cultuur bord en was de cellen met 10 ml PBS. Verwijder de PBS en voeg 2 ml trypsine-EDTA oplossing voor iedere 100-mm plaat. Schud de platen om gelijkmatig te verdelen de trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer gedurende 3-5 minuten. Tik voorzichtig de plaat naar de vrijstaande cellen in suspensie zie onder een omgekeerde microscoop. </li><li> Wanneer de cellen helemaal los, voeg 8 ml DMEM medium en het verzamelen van de cel-oplossing in een 15-mL conische buis. Neem 10 pi om de cellen te tellen in een hemocytometer en uit te werken het totale aantal ECFCs en MSC's geoogst. </li><li> Overdracht 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 cellen) en 6x10 6 mediterrane partnerlanden (5x 1.2x10 6 cellen) samen in een enkele 50-mL conische buis. Dit is de totale hoeveelheid cellen die nodig is voor vijf individuele implantaten en muizen. Centrifugeer bij 1200 rpm en verwijder het supernatant. </li><li> Zacht, voeg 100 ul van fibrinogeen oplossing 0,9 ml van collageen / fibronectine-oplossing (3 mg / ml uiteindelijke fibrinogeen concentratie), dit mengsel op ijs. </li><li> Resuspendeer de cel pellet op 1 ml ijskoude collageen / fibronectine / fibrinogeenoplossing, mengen de cellen zeer voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Laad het mengsel in een 1-ml steriele spuit en plaats een 26-gauge naald met zijn pet op de punt van de spuit. Houd de geladen spuit op het ijs tot de injectie. </li></ol> 5. Injectie in immuundeficiënte Naakt Mouse (Day 0) Alle dierlijke experimenten zullen worden uitgevoerd met 6-week oud athymische naakt (nu / nu) muizen. <ol><li> Voorafgaand aan de injectie, verdoven de immunodeficiënte muizen door ze in een gaskamer het leveren van isofluraan. Laat de muizen om de isofluraan inhaleren voor ongeveer 2 minuten tot ze verdoofd en reageert tot teen knijpen (monitor hun hart klopt door de inspectie). </li><li> Voor elke muis, injecteren 50 ul van trombine-oplossing (10 U / ml) subcutaan in de bovenste dorsale regio met behulp van een 26-gauge naald. </li><li op dezelfde plaats waar trombine werd ge injecteren pi van de cel mengsel met behulp een naald. collageen gel bij c en fibrinogeen zal vormen fibrine-gel in aanwezigheid trombine. als gevolg daarvan moet het implantaat kleine maar merkbare bobbel onder huid.><li> Na de injectie, plaatst u de muizen op een laag gaas voor comfort en warmte en observeren ze totdat ze ambulant. Dan na, dagelijks houden aan de muizen voor de eerste drie dagen. </li></ol> 6. Oogsten (Dag 7) <ol><li> Een week na de injecties, euthanaseren de muizen door ze in een gaskamer het leveren van samengeperst CO 2 gas. </li><li> Eenmaal gedood, opengesneden de huid in de buurt van het gebied van de injectie en chirurgisch te verwijderen van de gel plug. Digitale foto's van de opgehaalde gel stekkers met een schaal worden geadviseerd. </li><li> Plaats de geoogste gel stekkers in histologische cassette en diep ze in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende de nacht bij kamertemperatuur. </li><li> Na fixatie, was het 10% neutraal gebufferde formaline weg met gedestilleerd H 2 O en plaats de histologische cassettes bij 4 ° C in PBS tot histologische evaluatie. </li></ol> 7. Evaluatie: Histologie (H &amp; E) en immunohistochemie (hCD31) <ol><li> Voor histologische evaluatie, zijn de implantaten ingebed in paraffine en coupes (7 micrometer dikke delen) met behulp van standaard-histologische procedures. </li><li> Kwantificeren microvessel dichtheid door een evaluatie van Hematoxilin en eosine (H &amp; E) gekleurde coupes genomen uit het middelste deel van de implantaten. Standaard protocollen voor H &amp; E kleuring kan elders worden gevonden. Microvaten kunnen worden geïdentificeerd als lumenale structuren die rode bloedcellen bevatten. Rapport bloedvaten dichtheid als het gemiddeld aantal rode bloedcellen gevulde bloedvaten uit het veld geanalyseerd en uitgedrukt als schepen / mm 2. </li><li> Om aan te tonen van de menselijke natuur van de microvasculaire schepen, delen van de opgehaalde implantaat moet immunohistochemisch worden gekleurd met een mens-specifieke CD31 (hCD31) antilichaam met behulp van standaard kleuringen protocollen. Wij raden het gebruik van de muis monoklonaal anti-humaan CD31 antilichaam van DakoCytomation (Clone JC70A;. Kat # M0823) bij een 1:100 verdunning. De menselijke specificiteit van dit antilichaam is bevestigd door de negatieve reactie die wordt verkregen met een diversiteit van de muis weefselcoupes die werden gekleurd in parallel 7,11. Van de nota, muis bloedvaten vaak gezien in de implantaten (speciaal rond de grens), maar de muis schepen zal niet positief vlek met dit antilichaam. Daarnaast kan de aanwezigheid van de menselijke MSC worden gedetecteerd door immunohistochemische kleuring met mens-specifieke antilichamen tegen CD90 of α-gladde spiercel actine (α-SMA). Menselijke MSC zijn te vinden zowel in de perivasculaire regio van nieuw gevormde bloedvaten en interstitially verspreid over het implantaat 11. </li></ol> 8. Representatieve resultaten <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Typische uitzicht van ECFC en MSC culturen. Fase contrast microfoto weergave van het typische uiterlijk van ECFCs en MSC's in de cultuur. (A) Confluente monolaag van navelstrengbloed afgeleide ECFCs het weergeven van de karakteristieke keien stenen morfologie van endotheelcellen. (B) Human beenmerg-afgeleide MSC's tonen van een spindel vorm morfologie. Scaler bars, 200 um. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Verschijning van geëxplanteerde stekkers op dag 7. Menselijk navelstrengbloed afgeleide ECFCs en beenmerg-afgeleide MSC's zijn ingebed in collageen / fibronectine / fibrine gel en subcutaan geïmplanteerd in muizen naakt, zoals beschreven in de tekst. (A) Na 7 dagen, nadat de muis is gedood, opengesneden de huid in de buurt van het gebied van de injectie en bloot de cel / gel stekker omkeren door de huid. (B) Uiterlijk van de stekker chirurgisch verwijderd van de muis en voorafgaand aan de formaline fixatie. De rode kleur van het implantaat is een indicatie van vascularisatie. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Histologische identificatie van vasculaire netwerk in geëxplanteerd pluggen. Hematoxilin en eosine (H &amp; E) gekleurde coupes genomen uit het middelste deel van de geëxplanteerd pluggen. (A) lage vergroting (10x) microfoto het weergeven van het implantaat (gemarkeerd door een gele onderbroken lijn) in het kader van de omliggende weefsels gastheer (dat wil zeggen, vetweefsel en skeletspieren). (B) High vergroting (40x) microscoop het weergeven van meerdere microvaten (gele pijlpunt wijst op een aantal van hen) in de stekker microvaten geïdentificeerd kan worden als lumenale structuren die rode bloedcellen bevatten. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Immunohistochemische identificatie van menselijkelumen. immunohistochemisch gekleurde coupes genomen uit het middelste deel van de geëxplanteerd pluggen. Kleuring werd uitgevoerd met behulp van een monoklonaal muis anti-humaan CD31 (hCD31) antilichaam van DakoCytomation (Clone JC70A;. Kat # M0823) bij een 1:100 verdunning; celkernen werden tegengekleurd met hematoxilin. (A) lage vergroting (10x) microfoto het weergeven van het implantaat (afgebakend door een zwarte stippellijn) in de context van de omliggende weefsels gastheer. Menselijke specifieke, CD31-positieve microvaten zijn gekleurd in bruin (peroxidase kleuring). (B) High vergroting (40x) microscoop het weergeven van meerdere menselijke microvaten (zwarte pijlpunt wijst op een positieve hCD31-lumen) in de stekker.

<ol><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li>
<li>Koike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+creation+of+long-lasting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels.</a> Nature. 428, 138-139 (2004).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+complex+microvessels+lined+by+human+endothelial+cells+in+an+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).</li>
<li>N&ouml, r, E, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+functional+human+microvessels+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice.</a> Lab Invest. 81, 453-463 (2001).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-1305 (2008).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Traktuev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Functional+Vascular+Network+Formation+In+Vivo+by+Cooperation+of+Adipose+Progenitor+and+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells.</a> Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Myeloid+Cells+Are+Necessary+for+Creating+Bioengineered+Human+Vascular+Networks+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit is een experimenteel model van biotechnologie humane vasculaire netwerken. De belangrijkste kenmerken van dit model zijn: 1) microvaten worden gevormd uit menselijke cellen geïsoleerd uit postnatale weefsels (bijv. bloed en beenmerg), 2) microvaten worden gevormd in een volwassen dier, en 3) microvaten komen niet voort uit pre bestaande (host) schepen, maar in plaats daarvan worden gevormd, de novo, van enkelvoudige cellen gesuspendeerd in een geschikt gel. Angiogenese speelt een belangrijke rol in deze test, omdat verbindingen met de muis vasculatuur zijn nodig om rode bloedcellen gevulde vaten, een van de functionele read-out in deze test te bereiken. Daarnaast zijn gastheer myeloïde cellen aangeworven om het implantaat in de vroege dagen na transplantatie, en ze zijn nodig voor de vorming van de nieuwe vasculaire bed 12. Dit experimenteel model biedt een veelzijdige, kwantificeerbaar, en relatief eenvoudig model systeem om postnatale vorming van humane vasculaire netwerken in vivo studie. Bovendien, deze test is eenvoudig uit te voeren en het vereist geen een incisie of chirurgische ingreep. Het model kan gebruikt worden om de vasculogene potentieel van de verschillende bronnen van menselijke endotheelcellen en perivasculaire cellen te bestuderen. Het model kan worden gebruikt voor het screenen op anti-en / of pro-vasculogene verbindingen. Ten slotte kan het model gebruikt worden om de rol (len) van specifieke genen bij de vorming en functie van een vasculaire netwerk bestaat uit humaan endotheel te bestuderen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Endotheliale Basale Medium, EBM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuot supplementen </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamine-penicilline-streptomycine oplossing, 100x GPS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 30 tot 009-CI </td><td></td></tr><tr><td> Mesenchymale stamcellen groeimedium BulletKit, MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Hoge glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, 1x DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM niet-essentieel aminozuur oplossing, 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Hoge glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle, in poedervorm DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES Bufferoplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex Bovine Collagen I-oplossing </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex Human Fibronectine </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fibrinogeen van runderen plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8630-1G </td><td></td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Visser </td><td> DF0143-17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA-oplossing, 1x </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluraan, vloeistof voor inhalatie </td><td> Buxter Healthcare Corporation </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> Trombine van runderen plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4648-1KU </td><td></td></tr><tr><td> Formaline oplossing, neutraal gebufferde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonale Mouse Anti-Human CD31 antilichaam </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> Kloon JC70A </td></tr></tbody></table>

bioengineering human microvasculaire netwerken in immunodeficiënte muizen

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

De toekomst van tissue engineering en cel-gebaseerde therapieën voor weefselregeneratie zal waarschijnlijk beroep doen op ons vermogen om functionele vasculaire netwerken genereren van in vivo. In dit opzicht is de zoektocht naar experimentele modellen om bloedvat netwerken op te bouwen in vivo is van het grootste belang 1. De haalbaarheid van biotechnologie microvasculaire netwerken in vivo werd voor het eerst aangetoond met behulp van menselijke weefsels afgeleide mature endotheelcellen (EC) 2-4, maar een dergelijke autologe endotheelcellen huidige problemen voor brede klinische toepassing, want ze zijn moeilijk te verkrijgen zijn in voldoende hoeveelheden en vereisen oogsten uit bestaande bloedvaten. Deze beperkingen hebben aangestuurd op het zoeken naar andere bronnen van EC. De identificatie van endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in het bloed presenteerde een kans om niet-invasief te verkrijgen EC 5-7. Wij en andere auteurs hebben aangetoond dat volwassen en navelstrengbloed afgeleide ECFCs het vermogen om functionele vasculaire netwerken te vormen in vivo 7-11 hebben. Belangrijk is dat deze studies hebben ook aangetoond dat een stabiele en duurzame vasculaire netwerken te verkrijgen, ECFCs nodig co-implantatie met perivasculaire cellen. De test beschrijven we hier illustreert dit concept: we laten zien hoe menselijk navelstrengbloed afgeleide ECFCs kan gecombineerd worden met beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) als een enkele celsuspensie in een collageen / fibronectine / fibrinogeen gel tot een functionele menselijke vorm vasculaire netwerk binnen 7 dagen na implantatie in een immunodeficiënte muis. De aanwezigheid van de menselijke ECFC omzoomde lumen met gastheer erytrocyten kan worden gezien door de implantaten geeft niet alleen de formatie (de novo) van een vasculair netwerk, maar ook de ontwikkeling van functionele anastomosen met de gastheer bloedsomloop. Dit muizenmodel van bioengineered humane vasculaire netwerk is bij uitstek geschikt voor onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen van de menselijke vasculaire netwerk vorming en voor de ontwikkeling van strategieën om engineered weefsels vascularize.

Hier beschrijven we een methode om menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheel kolonie-vormende cellen (ECFCs) en beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s), ingebed in een collageen / fibronectine gel, subcutaan in immunodeficiënte muizen. Te leveren Deze cel / gel combinatie genereert een humane vasculaire netwerk dat verbindt met de muis vaatstelsel.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

De toekomst van weefselengineering en celgebaseerde therapieën voor weefselregeneratie zal waarschijnlijk afhangen van ons vermogen om functionele vasculaire netwerken te genereren ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een in vivo menselijk vasculair netwerk. Dit wordt bereikt door eerst menselijke endotheliale kolonievormende cellen afgeleid van bloed en menselijke mesenchymale stamcellen afgeleid van beenmerg te kweken. Beide celtypen worden vervolgens gemengd in een gel op basis van collageen, die subcutaan in een immuundeficiënte muis wordt geïnjecteerd.Zeven dagen later wordt het implantaat geoogst en geëvalueerd op de vorming van een menselijk vasculair netwerk. Uiteindelijk kan de aanwezigheid van mensspecifieke microvaten in de implantaten worden geverifieerd via histologie en immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van een traditionele methode, zoals de chirurgische implantatie van een construct, is dat het eenvoudig uit te voeren is en geen chirurgie vereist.Begin met het ontdooien van één vial E CFC's en verdun de cellen onmiddellijk in een kegelvormige buis van 15 milliliter met 10 milliliter DMEM. Centrifugeer de celsuspensie bij 1200 RPM gedurende vijf minuten en resuspendeer de celpellet in 10 milliliter verwarmd EGM two-medium. Breng de cellen vervolgens over naar een weefkweekplaat van 100 millimeter die is gecoat met 1% gelatine en incubeer de cellen overnight in een bevochtigde incubator.De volgende ochtend het medium en alle ongebonden cellen voorzichtig aspireren. Voed de gebonden cellen vervolgens met 10 milliliters vers E GM two medium. Herhaal dit proces gedurende de volgende paar dagen totdat er een confluente monolaag is gevormd.Was de cellen vervolgens met 10 milliliters PBS. Vervang de PBS door twee milliliters tripsin EDTA en plaats de plaat gedurende vijf minuten terug in de incubator. Tik na vijf minuten voorzichtig tegen de plaat en controleer onder een microscoop of de cellen zijn losgekomen.Indien dit niet het geval is, herhaal dan de korte incubaties met voorzichtig schudden. Zodra de cellen volledig zijn losgekomen, voeg acht milliliter EGM two medium toe aan de cellen en breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis. Tel de cellen en centrifugeer deze bij 1200 RPM gedurende vijf minuten.Zaai de cellen nu uit op weefselkweekplaten die zijn gecoat met 1% gelatine bij een zaaidichtheid van 5, 000 cellen per vierkante centimeter. Incubeer de cellen in EGM two medium en ververs het medium elke twee tot drie dagen met EGM two medium. Herhaal deze procedure voor opeenvolgende passages tussen passage vier en acht.De E CFC's zullen klaar zijn voor gebruik. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor het opkweken van MSC's. Vervang simpelweg E GM two medium door M-S-C-G-M medium.Gebruik een ongecoate kweekplaat. Begin met subcultiveren bij 80% confluentie en subcultiveer met een zaaidichtheid van 10.000 cellen per vierkante centimeter. Voor dit experiment zijn 800.000 E CFCs en 1.200.000 MSCs per implantaat vereist.Over het algemeen worden vijf implantaten gelijktijdig voorbereid. Begin met het aspireren van het celmedium uit de kweekplaten en was elke plaat met cellen met 10 milliliters PBS. Vervang de PBS door twee milliliters trypsine EDTA en incubeer de platen onder zacht schudden.Controleer de cellen elke twee tot vijf minuten onder een microscoop totdat alle cellen zijn losgekomen. Voeg vervolgens 8 mL DMEM toe en verzamel de celoplossing. Tel de cellen in een conische buis van 15 mL en breng voldoende cellen voor vijf implantaten over naar een enkele conische buis van 15 mL.Centrifuge de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 1200 RPM en verwijder het supernatant. Bereid voorzichtig een mengsel van fibrinogeen en collageen-fibronectine op ijs voor. Resuspendeer de celpellet daarna zeer voorzichtig in het ijskoude mengsel.Laad de celsuspensie in een spuit van één milliliter terwijl de vorming van luchtbellen wordt vermeden, en bevestig een afgedekte naald van 26 gauge. Bewaar de gevulde spuit op ijs totdat het celmengsel wordt geïnjecteerd. Anestheseer vier zes weken oude athyme nude immunodeficiënte muizen met behulp van een ISO-fluorchamber.Zodra de muizen zijn geanestheseerd en niet meer reageren op een knijpreflex in de teen, worden de injecties bij elke muis uitgevoerd. Gebruik een naald van 30 gauge om 50 µl thrombine-oplossingen subcutaan in de bovenste dorsale regio te injecteren. Injecteer op dezelfde locatie 200 µl van het celmengsel.Met een naald van 26 gauge zullen de geïnjecteerde macromoleculen geleren en een kleine maar merkbare bult onder de huid vormen. Plaats de muizen na de injectie op een laag gaas voor comfort en warmte. Observeer ze totdat ze weer mobiel zijn.Houd de algemene gezondheid van het dier gedurende de volgende drie dagen dagelijks in de gaten. Euthanaseer de muizen één week na de injecties met koolstofdioxide en verwijder de gelplug chirurgisch. Fotografeer de gelpluggen na extractie naast een liniaal, plaats elke gelplug vervolgens in een histologische cassette en dompel deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur onder in 10% neutraal gebufferde formaline.Was de volgende dag het 10% neutraal gebufferde formaline af met gedestilleerd water. Bewaar de cassettes in PBS bij vier graden Celsius totdat ze worden onderworpen aan histologische evaluatie. Maak coupes van zeven micron van het in paraffine ingebedde implantaat.Kwantificeer vervolgens de dichtheid van de microvaten in het middelste gedeelte van de implantaten. Bepaal met behulp van een H&amp;E-kleuring het aantal vaten per vierkante millimeter om de humane aard van de microvasculaire vaten aan te tonen. Kleur de coupes met een commercieel verkrijgbaar anti-humaan CD 31-antilichaam in een verdunning van 1:100.Deze fasecontrastopname toont de karakteristieke kasseistenenmorfologie van endotheliale cellen in een typische convergente monolaag van uit navelstrengbloed afgeleide e CFCs. Deze afbeelding toont de typische spoelvormige morfologie van uit menselijk beenmerg afgeleide MSCs. Na een incubatie van een week in de muisgast zag het implantaat, aangegeven door een gele stippellijn, er bij een hogere vergroting zeer anders uit dan de weefsels van de gastheer.Meerdere microvaten bleken luminale structuren te bevatten met rode bloedcellen, welke zijn gemarkeerd met de gele pijlpunten. Bij immunohistochemisch onderzoek van de pluggen bleek het lumen van de microvaten reactief voor een monoklonaal antilichaam tegen humaan CD 31. De celkernen werden tegengekleurd met hematine.Zodra deze technologie onder de knie is, kan deze binnen één ounce worden uitgevoerd mits dit correct gebeurt.

bioengineering-human-microvascular-networks-in-immunodeficient-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a method for grafting human skin onto an immunodeficient mouse with a suppressed neutrophil response. The method involves applying human split-thickness skin to the mouse's graft bed, sealing it, and covering it for recovery. Eventually, the human skin adheres to the mouse's skin, establishing vascularization and circulation, resulting in a successful skin xenograft.

A Technique for Human Skin Grafting in a Mouse Model

We beschrijven protocollen voor onze muis graft arteriosclerois (GA) modellen die tussenkomst van een muis bloedvatsegment betrekken in een ontvanger van dezelfde inteeltstam. Door terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor kan het model het effect van specifieke genen op GA beoordelen.

Muismodellen voor Graft Arteriosclerosis

Neisseria meningitidis is een humaan specifieke ziekteverwekker die de bloedvaten infecteert. In dit protocol menselijke bloedvaten in een muis worden geïntroduceerd door enten menselijke huid op immuungecompromitteerde muizen. Bacteriën zich uitgebreid naar menselijke vaten, waardoor vasculaire beschadiging en ontwikkeling van de purpura uitslag typisch waargenomen in menselijke gevallen.

Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Wij presenteren een protocol voor vetweefsel afgeleide microvasculaire brokken belovend vascularisatie eenheden vertegenwoordigen isoleren. Ze kunnen snel worden geïsoleerd, vereisen geen in vitro verwerking en kunnen aldus worden gebruikt voor één-stap prevascularization op verschillende gebieden van weefselengineering.

Isolatie Murine vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten als Vascularisatie eenheden voor Tissue Engineering

Een methode om verschillende gehumaniseerde beenmergnissen in muizen te creëren en te leven, wordt gepresenteerd. Op basis van de ondersteunende niche die door menselijke mesenchymale cellen is gecreëerd, induceert de toevoeging van menselijke endotheelcellen de vorming van menselijke vaten, terwijl de toevoeging van rhBMP-2 de vorming van chimerisch volwassen weefsel van humane muizen veroorzaakt.

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Hier beschreven zijn drie experimentele benaderingen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie in gehumaniseerde muizen. De eerste maakt de studie van chronische infectie gebeurtenissen, terwijl de twee laatsten voor de studie van acute gebeurtenissen na primaire infectie of virale reactivatie.

Chronische, acute en Gereactiveerde HIV-infectie in gehumaniseerde Immunodeficiënte Muismodellen

Intrafemorale injecties maken de implantatie van een klein aantal hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) mogelijk door de cellen direct in de beenmergholte te plaatsen. Hier beschrijven we een experimenteel protocol van intrafemorale injectie van menselijke HSPC's in immunodeficiënte muizen.

Intrafemorale injectie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen in immuungecompromitteerde muizen 

We presenteren een reproduceerbaar muismodel van heterotopische vascularisatie allotransplantatie van achterpoot tot hals. Dit supermicrochirurgisch protocol, waarbij 0,3-0,5 mm vatenanastomosen worden gebruikt, integreert nylonfilamentgeleiding en veneuze manchetten. Het biedt een betrouwbaar platform voor translationele studies naar tolerantie, ischemie-reperfusieschade en immunologische mechanismen bij vasculariseerde samengestelde allotransplantatie.

Heterotopische achterpoot-naar-nek transplantatie bij de muis: een supermicrochirurgisch model van vasculariseerde composietallotransplantatie

Leer hoe je menselijke microvasculaire netwerken bioengineert in immunodeficiënte muizen met ECFCs en MSCs in een collageen/fibronectine gel. Deze methode biedt een eenvoudig alternatief voor chirurgische implantatie.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

Meer video's verkennen