Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een in vivo menselijk vasculair netwerk. Dit wordt bereikt door eerst menselijke, uit bloed afgeleide endotheliale colony-forming cellen en menselijke, uit beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen te cultiveren. Beide celtypen worden vervolgens gemengd in een gel op basis van collageen, die subcutaan in een immuundeficiënte muis wordt geïnjecteerd.

Zeven dagen later wordt het implantaat geoogst en geëvalueerd op de vorming van een menselijk vasculair netwerk. De aanwezigheid van mensspecifieke microvaten in de implantaten kan uiteindelijk worden geverifieerd via histologie en immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van een alternatieve methode, zoals de chirurgische implantatie van het construct, is dat het eenvoudig uit te voeren is en geen chirurgie vereist.

Begin met het ontdooien van één vial E CFC's en verdun de cellen onmiddellijk in een kegelvormige buis van 15 milliliter die 10 milliliter DMEM bevat. Centrifugeer de celsuspensie bij 1200 RPM gedurende vijf minuten en resuspendeer de celpellet in 10 milliliter warm EGM two-medium. Breng de cellen vervolgens over naar een weefselkweekplaat van 100 millimeter die is gecoat met 1% gelatine en incubeer de cellen overnight in een bevochtigde incubator.

De volgende ochtend het medium en alle niet-gebonden cellen voorzichtig aspireren. Voeg vervolgens 10 milliliters vers E GM two medium toe aan de gebonden cellen. Herhaal dit proces gedurende de volgende paar dagen totdat er een confluente monolaag is gevormd.

Was vervolgens de cellen met 10 milliliters PBS. Vervang de PBS door twee milliliters tripsin EDTA en plaats de plaat gedurende vijf minuten terug in de incubator. Tik na vijf minuten onder een microscoop voorzichtig tegen de plaat en controleer of de cellen zijn losgelaten.

Indien dit niet het geval is, herhaal dan de korte incubaties met voorzichtig schudden. Zodra de cellen volledig zijn losgekomen, voeg acht milliliter EGM two medium toe aan de cellen en breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis. Tel de cellen en centrifugeer ze bij 1200 RPM gedurende vijf minuten.

Zaai de cellen nu uit op weefkweekplaten die gecoat zijn met 1% gelatine, met een zaaidichtheid van 5 000 cellen per vierkante centimeter. Incubeer de cellen in EGM two-medium en verschoon het medium elke twee tot drie dagen met EGM two-medium. Herhaal deze procedure voor opeenvolgende passages tussen passage vier en acht.

De E CFC's zullen klaar zijn voor gebruik. Dit protocol kan ook worden gebruikt om MSC's op te kweeken. Vervang simpelweg E GM two medium door M-S-C-G-M medium.

Gebruik een ongecoate kweekplaat. Begin de subcultuur bij een confluentie van 80% en subcultiveer met een zaaidichtheid van 10.000 cellen per vierkante centimeter. Voor dit experiment zijn 800.000 E CFCs en 1.200.000 MSCs per implantaat nodig.

Over het algemeen worden vijf implantaten gelijktijdig voorbereid. Begin met het afzuigen van het celmedium uit de kweekplaten en was elke plaat met cellen met 10 milliliter PBS. Vervang de PBS door twee milliliter trypsine-EDTA en incubeer de platen onder voorzichtig schudden.

Controleer de cellen elke twee tot vijf minuten onder een microscoop totdat alle cellen zijn losgekomen. Voeg vervolgens acht milliliter DMEM toe en verzamel de celoplossing. Tel de cellen in een conisch buisje van 15 milliliter en breng voldoende cellen voor vijf implantaten over naar een enkel conisch buisje van 15 milliliter.

Centrifuge de cellen vervolgens 5 minuten bij 1200 RPM en verwijder het supernatant. Bereid voorzichtig een mengsel van fibrinogeen en collageen fibronectine op ijs voor. Resuspendeer de celpellet daarna zeer voorzichtig in het ijskoude mengsel.

Laad de celsuspensie in een spuit van één milliliter terwijl de vorming van luchtbellen wordt vermeden, en bevestig een afgedekte naald van 26 gauge. Bewaar de gevulde spuit op ijs tot het celmengsel wordt geïnjecteerd. Narcoseer vier zes weken oude athymische naakte immuundeficiënte muizen met behulp van een ISO-fluorchamerkamer.

Zodra de muizen zijn geanestheseerd en niet meer reageren op een knijpreflex in de teen, kunnen de injecties per muis worden uitgevoerd. Gebruik een naald van 30 gauge om 50 µL thrombine-oplossingen subcutaan in de bovenste dorsale regio te injecteren. Injecteer op dezelfde locatie 200 µL van het celmengsel.

Met behulp van een naald met maat 26 zullen de geïnjecteerde macromoleculen geleren en een kleine maar waarneembare bult onder de huid vormen. Plaats de muizen na de injectie op een laag gaas voor comfort en warmte. Observeer hen totdat zij weer mobiel zijn.

Voer gedurende de volgende drie dagen dagelijks een observatie uit van de algemene gezondheid van het dier. Euthanaseer de muizen één week na de injecties met koolstofdioxide en verwijder de gelplug chirurgisch. Fotografeer de teruggewonnen gelpluggen naast een liniaal, plaats vervolgens elke gelplug in een histologische cassette en dompel deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur onder in 10% neutraal gebufferde formaline.

Was de volgende dag de 10% neutraal gebufferde formaline weg met gedestilleerd water. Bewaar de cassettes in PBS bij vier graden Celsius tot ze worden onderworpen aan histologische evaluatie. Maak coupes van zeven micron van het in paraffine ingebedde implantaat.

Kwantificeer vervolgens de dichtheid van de microvaten in het middelste gedeelte van de implantaten. Bepaal met behulp van een H&E-kleuring het aantal vaten per vierkante millimeter om de menselijke oorsprong van de microvasculaire vaten aan te tonen. Kleur de coupes met een commercieel verkrijgbare anti-human CD 31-antilichaam in een verdunning van 1:100.

Deze fasecontrastafbeelding toont de karakteristieke klinkerwegmorfologie van endotheliale cellen in een typische confluente monolaag van navelstrengbloed-afgeleide e CFCs. Deze afbeelding toont de typische spoelvormige morfologie van menselijke beenmerg-afgeleide MSCs. Na een incubatieperiode van een week in de muisgast zag het implantaat, aangegeven door een gele stippellijn, er bij een hogere vergroting zeer anders uit dan de weefsels van de gastheer.

Meerdere microvaten werden zichtbaar waarbij hun luminale structuren rode bloedcellen bevatten, wat is aangegeven door de gele pijlpunten. Bij immunohistochemisch onderzoek van de plugs bleek het lumen van de microvaten reactief voor een monoklonaal antilichaam tegen menselijk CD 31. De celkernen werden tegengekleurd met hematine.

Zodra deze technologie onder de knie is, kan deze binnen één ounce worden uitgevoerd als dit correct wordt gedaan.