Name: Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer hoe groeifactoren de celbestemming beïnvloeden in kippenembryo's met behulp van in ovo preparatie. Deze methode biedt inzicht in ontwikkelingsbiologie en eiwitinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Verwijder eieren van de broedmachine Bij E2-2.5 (~ Sint-17 HH), verwijder de eieren en dienovereenkomstig bereiden. Ze kunnen worden gewerkt of onmiddellijk terug naar de incubator voor een paar uur. De eieren kunnen worden geplaatst op kamertemperatuur veilig voor meer dan een uur. Eieren kunnen uit het verblijf voor de duur van de manipulaties. Soms zijn deze kan een uur of meer. Let op: Hoe langer ze zitten bij kamertemperatuur, hoe minder kans dat ze om te overleven. 2. Voorbereiding van de Oost-Indische inkt <ol><li> Bereid een verse oplossing van 4% Oost-Indische inkt in steriele PBS. </li><li> Vul een 3 ml spuit met de oplossing. </li><li> Plaats een 27 gauge, ½ inch naald op de spuit. </li><li> Met behulp van een paar hemostats, buig de naald een hoek van 90 °. </li></ol> 3. Het openen van de eieren en injectie van Oost-Indische inkt <ol><li> Met behulp van een pincet, schil de band af en open het venster, vastzetten met behulp van de achterzijde van de tape op de achterkant van het ei. </li><li> Gids in de gebogen naald totdat het ligt net onder het embryo. Het plaatsen van de naald onder de zwevende schijf zorgt ervoor dat de inkt, die giftig is voor het embryo, niet in direct contact komen. </li><li> U moet alleen injecteren genoeg inkt om een ​​comfortabele contrast te creëren. Dit is typisch minder dan ¼ ml. </li></ol> 4. Het openen van de neurale buis <ol><li> Neem een ​​paar van fijne dissectie schaar en knip de dunne membraan dat ligt op de top, of soms rond, het embryo. </li><li> Neem een ​​paar van 55 tang of een wolfraam sonde en open de neurale buis van posterior naar anterior. Zorg ervoor dat de opening groot genoeg is om een ​​kraal plaats in. </li></ol> Opmerking: Afhankelijk van de leeftijd, een fijne wolfraam probe kan gebruikt worden om hetzelfde te doen. 5. Het ophalen van een gecoate heparine-acryl kraal <ol><li> Met behulp van een paar van 55 pincetten, vindt een intact kraal in de oplossing. Laat de kraal zich hechten aan de tip, langzaam sluit de tang. </li><li> Haal de kraal uit de oplossing en breng deze over op de top van het ei. </li><li> Zodra de kraal is uit de oplossing, zal het waarschijnlijk niet komen af ​​totdat is geplaatst in de albumine. </li></ol> 6. Het plaatsen van de kraal <ol><li> Zodra de kraal is geplaatst op de top van het doelgebied, gebruik dan een wolfraam sonde om haar te leiden naar de voorhersenen of het probleem te verhelpen in de achterhersenen. </li><li> Voeg een paar druppels PBS met behulp van een pipet 10 pi. </li></ol> 7. Het sluiten van het ei <ol><li> Sluit het ei met behulp van de dunne stukje tape om het venster te sluiten. </li><li> Seal het ei volgens de prepping protocol, beschikbaar op <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Afhankelijk van de eiwitten die je wenst te gebruiken, zijn er verschillende protocollen over hoe de kralen te bereiden. In deze experimenten maken we gebruik van heparine-acryl kralen, maar Affi-gel kralen kunnen ook gebruikt worden. We hebben gevonden dat de heparine-acryl kralen zijn makkelijker te manipuleren in de waterige omgeving van de ei-albumine. Kralen zijn gedrenkt in 5 l eiwit overnacht bij 4 ° C. Controle kralen worden geplaatst in steriel PBS tot het moment van plaatsing. Het voordeel bij het ​​gebruik van een in-ovo voorbere...

<table><tbody><tr><td>Eieren</td><td>Dier</td><td></td><td></td><td>Bevrucht, E2-2,5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indiase inkt</td><td>Instrument</td><td>Higgins</td><td></td><td>Bereid een 4% oplossing in steriele PBS.</td></tr><tr><td>Steriele PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>Als alternatief kan een antilichaamcocktail worden gebruikt</td></tr><tr><td>1ml spuit</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2 naalden</td><td>Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>In een hoek van 90 graden</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Instrument</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>maat 55</td></tr><tr><td>Hemostaten</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectieschaar</td><td>Instrument</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas, 8,5cm</td></tr><tr><td>Parafilm tape</td><td></td><td></td><td></td><td>om eieren af te dichten</td></tr><tr><td>Wolfraamsonde</td><td>Instrument</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>Instrument #24. Handvat optioneel.</td></tr></tbody></table>

het plaatsen van growth factor-coated kralen op early stage kippenembryo&#39;s

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

De neurale buis drukt vele eiwitten in specifieke tijdruimtelijke patronen tijdens de ontwikkeling. Deze eiwitten is aangetoond dat ze kritisch zijn voor lot van de cel bepalen, celmigratie, en de vorming van neurale circuits. Neuronale inductie en patroonvorming te betrekken botmorfogenetische eiwit (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast groeifactor (FGF), onder anderen. In het bijzonder, het expressiepatroon van Fgf8 is in de nabijheid van de regio&#39;s uiten BMP4 en SHH. Deze uitdrukking patroon is in overeenstemming met ontwikkelingsstoornissen interacties die patronen te vergemakkelijken in de telencephalon. Hier bieden wij een visuele demonstratie van een methode waarbij een in-ovo preparaat kan worden gebruikt om de effecten van fgfs in de vorming van de voorhersenen test. Kralen worden gecoat met eiwit en geplaatst in de zich ontwikkelende neurale buis om langdurige blootstelling te bieden. Omdat de procedure maakt gebruik van kleine, zorgvuldig geplaatste kralen, het is minimaal invasief en kunnen verschillende kralen worden geplaatst binnen een neurale buis. Bovendien is de methode zorgt voor verdere ontwikkeling, zodat embryo&#39;s kunnen worden geanalyseerd op een meer volwassen stadium veranderingen in de anatomie en in neurale patronen op te sporen. Deze eenvoudige maar nuttige protocol zorgt voor real-time beeldvorming. Het biedt een manier om ruimte en tijd beperkte wijzigingen aan endogene eiwit niveaus.

Een verscheidenheid van groeifactoren en eiwitten interageren te bewegen cellen op zich te nemen andere cel lot tijdens de ontwikkeling. Hier laten we zien het gebruik van een in-ovo voorbereiding op mogelijke interacties tussen verschillende eiwitten in de ontwikkeling te pakken door het plaatsen van kralen op E2.5 kippenembryo&#39;s.

Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryo&#39;s

De neurale buis tot expressie brengen van veel eiwitten in specifieke spatiotemporele patronen tijdens de ontwikkeling. Er is aangetoond dat deze eiwitten cruciaal zijn voor cel...

Welkom in het Raburn Lab. Ik ben Matt Korn, van de afdeling Neurobiologie en Gedrag aan de University of California Irvine. Vandaag gaan we een ei openen en er een kraal in plaatsen die is gedrenkt in groeifactor.De uitstekende preparatie van een ei stelt ons in staat om een groeifactor toe te voegen om het lot van een aantal verschillende typen weefsels in deze vroege fase van de embryonale ontwikkeling te veranderen. Dag twee en een half, of stadium 17. Oké, we zijn nu hier bij de microscoop.Ik heb mijn eieren en al mijn hulpmiddelen. Ga dus maar voor en pak hier een ei; je kunt zien waar onze tape zit. Raamafdichting.Ik heb deze leuke kleine donut. Deze is gemaakt van artistieke klei die je in een kunstenaarsbenodigdhedenwinkel kunt kopen. En ik ga een echt slecht paar pincetten gebruiken.Deze zijn al lange tijd in gebruik. De punten zijn vrij bot, maar ze werken uitstekend om de tape net genoeg op te tillen zodat het venster opengaat. Ik kan ze neerleggen.Ik vouw dit nu om en steek het ei, dit venster, daarachter zoals dit. Nu kan ik het onder de microscoop plaatsen en eventuele manipulaties uitvoeren. In dit geval gaan we de kralen gebruiken, en ik pak nu mijn India-inkt, zonder de India-inkt.U kunt zien dat hier een kleine embryonale schijf aanwezig is, die enigszins aan de zijkant ligt. Als ik het ei draai, kan ik zien waar een deel van het bloed een cirkel vormt. Vervolgens kan ik mijn naald met de India-inkt pakken.En ik ga nu naar de zijkant bewegen en onder de schijf kijken, daar bevindt zich een embryo. Ik wil het niet te ver verplaatsen, maar net genoeg om het contrast van het embryo tegen het zwart te zien. Vervolgens zal ik dit draaien zodat het rostrale deel van het embryo naar voren is gericht.En wat u hier ziet is de cephalonregio. De neurale buis komt hier terug en we zien enkele somieten die ons in staat stellen om de ouderdom te bepalen. En als ik verder inzoom, kunnen we zien dat het hart een zeer trage maar consistente hartslag heeft, wat uitstekend is.Het hart was aanwezig, maar sloeg niet. We moeten ons een beetje afvragen of dit wel een vitaal monster was. Omdat er geen echt dik membraan overheen zit, kan ik direct overgaan naar mijn wolfraamsonde.Ik, en er is een dun membraan, en ik ga nu opzij schuiven zodat ik bij het embryo kan komen. We plaatsen kralen in zowel de voorhersenen als de achterhersenen. Bij deze ga ik voor de voorhersenen.Om daar te komen, moet ik nu door een membraan snijden. Wanneer ze jonger zijn, kan ik gewoon een wolfraamsonde gebruiken om via de neurale buis naar binnen te gaan, waardoor ik toegang krijg tot de regio waar ik de kraal wil plaatsen. Ik ga nu over naar mijn wolfraamsonde.Ik gebruik beide handen om mijn hand stabiel te houden. Ik ga nu het embryo manoeuvreren. Zodra ik het kraaltje hier heb, kan ik het direct in de neurale buis plaatsen en omhoog richting de voorhersenen.Nu het embryo is geopend, kan ik beginnen met de voorbereiding en het plaatsen van het kraaltje. Hiervoor steek ik mijn probe iets dieper in om de neurale buis te openen, zoals u hier kunt zien. Ik zal nu iets verder inzoomen.Ik pas hier de focus een beetje aan. Je kunt zien dat er een mooi klein openingetje is, maar ik heb geen gat gemaakt boven waar het staartcephalon zit, en dat komt omdat de kraal daar moet komen. Ik wil dus geen gat hebben waardoor de kraal naar buiten kan drijven.Ik wil het een klein beetje naar achteren plaatsen, zodat ik de kraal kan invoeren en naar voren kan duwen. Nu ga ik een kraal pakken. Zoals u kunt zien, zijn er veel verschillende maten.Dit zijn heparine-acrylaat, ze bevinden zich in PBS. Ik gebruik nu een pincet van 55. Je ziet dat ik in de PBS ga en er gewoon eentje uitzoek die goed is.En zodra het uit de PBS is, blijft het meestal aan de pincet plakken, daar is het te zien. Ga verder en bedek de beads. Haal mijn ei terug.Ik ga het ei scherpstellen. Daarom ga ik de kraal met de 55-pincet oppakken. Hij zit iets hoger op de pincet dan ik gewend ben, maar zo is hij gepakt.Vervolgens leid ik het naar het gat dat ik in de neurale buis heb gemaakt. Zodra het in de neurale buis zit, is het eenvoudig om het naar de voorkant van de in ontwikkeling zijnde hersenen te manoeuvreren. Ik gebruik nu mijn wolfraamsonde om het simpelweg door te duwen.Bij het plaatsen van de kraal in het cephalon moet u voorzichtig zijn, omdat het embryo naarmate het ouder wordt, voorover en vervolgens opzij zal gaan buigen. Vaak gebeurt het dat de kraal bij plaatsing in de voorhersenen (het cephalon) richting de snavel glijdt, omdat de snavel zich vormt op het ventrale deel van het embryo, terwijl de hersenen zich in de dorsale regio bevinden. Maar dit ziet er vrij goed uit.Ik ben hier redelijk tevreden over. Ik zal nu een pipet nemen met 10 µL steriele PBS en daar een paar druppels van toevoegen. Oké, we kunnen het ei nu sluiten.En wat ik nu ga doen, is het venster hier omhoog en overvouwen, aangezien het ei nog niet is afgesloten. Om te voorkomen dat het uitdroogt, ga ik een stuk van de plastic tape gebruiken die we al hebben gebruikt en daar een stukje van afsnijden. Het is ongeveer dezelfde grootte, net iets groter dan het venster.Ik ga het een klein beetje uitrekken en ik plaats het precies over het venster hier en zorg dat het goed strak zit. Zo zijn alle gaten die we hebben gemaakt, zowel bij het draineren van het albumine als bij het uitsnijden van het venster, afgedicht. De eicel is nu dus verzegeld, waardoor er geen albumine verloren kan gaan en deze niet zal uitdrogen.Het zou normaal moeten kunnen rijpen. Dat is alles voor de plaatsing van de kraaltjes. Veel succes met uw experimenten met kuikens, en ik hoop dat u de gewenste resultaten behaalt.

placing-growth-factor-coated-beads-on-early-stage-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont twee werkwijzen voor het bereiden en het plaatsen van kralen, die zijn bekleed met groeifactor, op explantaten van de zich ontwikkelende cerebrale cortex. Deze kralen kunnen gebruikt worden om ruimtelijk beperkte genexpressie te induceren op het ontwikkelen van zenuwweefsel, zoals voorhersenen explantaten. Methoden worden gegeven voor gebruik van zowel Affi-Gel kralen en heparine acryl kralen.

Growth Factor-Coated Bead Plaatsing op Dorsale voorhersenen Explantaten

Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

Dit artikel beschrijft het oppervlak etikettering en...

Tracking Morfogenetische Tissue vervormingen in de vroege Chick Embryo

Een benadering voor het analyseren van migratie en de uiteindelijke lot van aviaire neurale lijst cellen in kwartel-chick chimere embryo's wordt beschreven. Deze methode is een eenvoudige en directe techniek voor het opsporen van neurale lijst cellen tijdens migratie en differentiatie die anders moeilijk te onderscheiden binnen een ongemanipuleerde kippenembryo.

Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Het bekijken en toegang krijgen tot het kippenembryo tijdens de ontwikkeling kan een uitdaging zijn. We hebben een ex ovo methode ontwikkeld die eenvoudig, kosteneffectief is en gemakkelijk kan worden gebruikt in een klaslokaal of onderzoeksomgeving. Deze methode biedt toegang tot het embryo tot in de late stadia van de embryonale ontwikkeling (HH 40).

Geoptimaliseerd Ex-ovo Het kweken van kippenembryo's tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Hier melden we dubbele etikettering van neurale kuifcellen en bloedvaten met behulp van chickGFP neurale buis intraspecies enting in combinatie met intra-vasculaire DiI injectie. Deze experimentele techniek stelt ons in staat om tegelijkertijd de ontwikkeling van het NCC-afgeleide (enterische) zenuwstelsel en het vasculaire systeem te visualiseren en te bestuderen, tijdens organogenese.

Dual Labeling van neurale kuifcellen en bloedvaten in kippenembryo's met behulp van ChickGFP Neural Tube Enting en Carbocyanine Dye DiI Injection

Door kralen gedrenkt in groeifactoren of specifieke remmers van signaalroutes in zich ontwikkelende embryo's te enten, is het mogelijk om hun effecten direct in vivo te testen. In dit protocol worden kralen in de ledemaatknop geënt om de effecten van deze moleculen op genexpressie en signaaltransductie te bepalen.

Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Protocollen die ondoordringbare barrières gebruiken om inductie-evenementen te blokkeren tussen weefsels van de hoofdlichaamsas en de flank in het kippenembryo, die nodig zijn voor ledeformatie, worden beschreven. Kralen gedrenkt in kandidaat-inductieve signalen worden gebruikt om het effect van barrièreplaatsing te overwinnen en analyse van genexpressie bevestigt dit.

Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

Hier presenteren we een nieuwe techniek om kuikenembryo's ex ovo te kweken voor time-lapse beeldvorming met behulp van doorgelaten licht en fluorescentiemicroscopie. De ondergedompelde filterpapiersandwich is een variant van de bekende filterpapierdragertechniek1 die het mogelijk maakt om kuikenembryo's volledig ondergedompeld in een vloeibaar kweekmedium te kweken.

Een Ondergedompeld Filter Paper Sandwich voor de lange termijn Ex Ovo Time-lapse beeldvorming van Early kippenembryo's

Bij deze methode zijn embryonale cardiale weefsels chirurgisch microdissected, losgekoppeld, fluorescently label en host embryonale weefsels ingeplant. Dit biedt een platform voor het bestuderen van de individu of weefsel niveau developmental organisatie onder ectopische hemodynamische voorwaarden en/of veranderde omgevingen van de paracrine/juxtacrine.

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

De geweekte kraaltest omvat gerichte toediening van testreagens op elk ontwikkelingstijdpunt om de regulatie van celdifferentiatie en morfogenese te bestuderen. Een gedetailleerd protocol, toepasbaar op elk proefdiermodel, voor het bereiden van drie verschillende soorten geweekte kralen en het implanteren hiervan in de interdigit van een kippenembryo wordt gepresenteerd.

Analyse van celdifferentiatie, morfogenese en patronen tijdens kippenembrogenese met behulp van de soaked-bead assay

Leer hoe groeifactoren de celbestemming beïnvloeden in kippenembryo's met behulp van in ovo preparatie. Deze methode biedt inzicht in ontwikkelingsbiologie en eiwitinteracties.

Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryo's

Meer video's verkennen