A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 weergaven • 2:57 min • July 8th, 2025
Begin with a fluorescent-compatible multi-well plate containing a suspension of transgenic mouse-derived T lymphocytes.
These lymphocytes contain a green fluorescent protein or GFP expression cassette, controlled by T cell receptor or TCR engagement with immunomodulatory compounds.
Treat each well with a solution containing immunomodulatory compounds with different potentials.
During incubation, immunomodulatory compounds interact with TCRs on T lymphocytes.
TCR interaction with a stimulating compound triggers the activation of the gene cassette, elevating GFP expression.
In contrast, TCR interaction with an inhibitory compound inhibits the gene cassette and reduces the GFP expression.
Next, overlay the cells with nucleic acid fluorescent dye to stain the nuclei.
Centrifuge the plate to settle the cells for accurate fluorescence measurement.
Under a fluorescence microscope, viable T lymphocytes exhibit two fluorescence signals corresponding to cell nuclei and green fluorescent proteins.
The intensified green fluorescence signifies successful stimulation of T lymphocytes, while a faint intracellular green fluorescence signal confirms the inhibitory effect of immunomodulatory compounds on T lymphocytes.
For small-molecule high-throughput screening, plate 40 microliters of cells per well in a 384-well plate, and treat the appropriate wells with the drug or vehicle of choice for the desired treatment period in the cell culture incubator.
30 minutes before the GFP analysis, stain the cells with the appropriate concentration of Hoechst solution, thoroughly distributing the stain with gentle pipetting. When all of the wells have been dyed, centrifuge the plates to collect the cells at the bottom of the wells, and allow the cells to rest for 15 minutes at room temperature.
Load the plate according to the manufacturer's instructions. Then, set the objective at 40X or higher. Set camera number 4 for the UV lamp and then set camera number 1 for laser 488. Load the plate to the high-content screening system. Next, set the automated confocal high-content screening system to read 6 to 10 fields per well, with two sequential readings per field at 488 nanometers and UV light.
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het beoordelen van T-lymfocytenactivatie met behulp van een fluorescentie-compatibele multi-wellplaat. Door T-lymfocyten afgeleid van transgene muizen te behandelen met diverse immunomodulerende verbindingen, kunnen onderzoekers veranderingen in de expressie van het groen fluorescerende eiwit (GFP) observeren, wat wijst op activatie of inhibitie van T-cellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- T-lymfocyten spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- Groen fluorescent eiwit (GFP) dient als marker voor genexpressie.
- Immunomodulerende verbindingen kunnen de activatie van T-cellen stimuleren of remmen.
- Fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van cellulaire processen mogelijk.
Doel van de studie
- Om de activering van T-lymfocyten te evalueren via GFP-expressie.
- Om onderscheid te maken tussen stimulerende en remmende effecten van immunomodulerende verbindingen.
- Om een high-throughput screeningmethode voor kleine moleculen vast te stellen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van transgene muis-afgeleide T-lymfocyten met GFP-expressie.
- Behandeling van cellen met diverse immunomodulerende verbindingen.
- Fluorescente kleuring van kernen met Hoechst-oplossing.
- Analyse van fluorescentie met behulp van een high-content screeningsysteem.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle stimulatie van T-lymfocyten resulteerde in een verhoogde GFP-expressie.
- Inhiberende verbindingen leidden tot een verminderde GFP-expressie.
- Fluorescentiemicroscopie maakte effectief onderscheid tussen levensvatige en niet-levensvatige cellen.
- De methode maakt high-throughput screening van immunomodulerende verbindingen mogelijk.
Conclusies
- De studie biedt een betrouwbare methode voor het beoordelen van T-celactivatie.
- Fluorescentiegebaseerde assays kunnen de ontwikkeling van geneesmiddelen in de immunologie faciliteren.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor diverse toepassingen in het celbiologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze fluorescentie-gebaseerde lymfocytenassay maakt snelle identificatie van immunomodulerende verbindingen mogelijk door TCR-activering te koppelen aan veranderingen in de GFP-expressie, wat vroege-fase targetvalidatie bij de ontdekking van immunologische geneesmiddelen ondersteunt. De methode biedt kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor stimulerende en inhiberende effecten, waardoor mechanische risicoanalyse van lead-kandidaten mogelijk is voordat er kostbare preklinische investeringen worden gedaan. De compatibiliteit met high-throughput-formaten maakt integratie in screeningcascades mogelijk voor het prioriteren van verbindingen met de gewenste immuunmodulerende profielen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door directe TCR-gemedieerde veranderingen in genexpressie te meten als reactie op immunomodulerende verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via dosisafhankelijke GFP-signaalmodulatie, waardoor het werkingsmechanisme van de verbinding wordt verduidelijkt.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door stimulerende van inhiberende fenotypen te onderscheiden, waardoor ambiguïteit bij vroege screening van immunomodulatoren wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Ontworpen voor 384-well platen met gestandaardiseerde celuitzaaiing (40 µL/well) en protocollen voor compoundbehandeling.
- Kwantitatieve output: Genereert readouts met twee parameters (GFP voor activatie, Hoechst voor levensvatbaarheid), wat normalisatie en hit-bevestiging mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met geautomatiseerde high-content screeningssystemen die 6–10 velden per well lezen, ter ondersteuning van grootschalige evaluatie van compound-bibliotheken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van ziekterelevalente transgene T-lymfocyten met TCR-gestuurde GFP-reporters, waardoor de fysiologische signaleringscontext behouden blijft.
- Preklinische risicoreductie: Biedt mechanistisch inzicht in de effecten van immunomodulatoren, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen voor doorgang naar diermodellen.
- Afstemming van biomarkers: GFP-expressie dient als een translationele biomarker voor T-celactivatie, die kan worden gekoppeld aan klinische farmacodynamische read-outs.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-validatie tot lead-identificatie en biedt een functionele readout op basis van immuuncellen die de biochemische en fenotypische screeningscascades aanvult.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen van immunomodulerende effecten op TCR-signaleringspaden via directe meting van genexpressie.
- Screening: Zorgt voor assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid door gecontroleerde lymfocytenpreparatie en geautomatiseerde confocale beeldvorming.
- Analytics: Maakt vergelijkende analyse van verbindingcondities mogelijk via genormaliseerde GFP-intensiteit, wat de mapping van structuur-activiteitsrelaties faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege screening van immunomodulatoren met preklinische continuïteit via fysiologisch relevante metrieken voor T-celactivatie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor immunologieportfolio's, aanpasbaar aan diverse klassen verbindingen en therapeutische targets.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in het mechanisme van de immunomodulator door TCR-engagement te koppelen aan functionele genexpressie-output.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde protocollen voor celbehandeling, kleuring en imaging.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door vals-positieven te verminderen via op levensvatbaarheid genormaliseerde activiteitsmetingen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulator-hits mogelijk op basis van gevalideerde stimulerende of inhiberende potentie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de kweek van primaire lymfocyten en de hantering van transgene cellen.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopie of high-content imaging-systemen met 488 nm en UV-excitatiecapaciteiten.
- Vereist standaardisatie van de zaaidichtheid van cellen, de duur van de behandeling met verbindingen en het tijdstip van de Hoechst-kleuring tussen teams.
- Aanpassing aan alternatieve modelsystemen kan een herontwerp van het TCR-GFP-reporterconstruct vereisen.
- Praktische beperking: De duur van de assay (inclusief incubatie en kleuring) kan de frequentie van ultra-snelle screening beperken.
Biopharma Veelgestelde Vragen
High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Assay to Evaluate Immunodominance in Cytotoxic T Lymphocyte Responses
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026