Name: Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Leer hoe je bacteriële belasting meet en enkelvoudige celoplossingen genereert uit lever en milt van muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes. Deze methode karakteriseert immuunresponsen en analyseert verschillen tussen gevoelige en resistente muizenstammen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan en Jonathan Wilksch bedanken voor het advies en reagentia. Dit werk werd gefinancierd door de Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) en de Australische National Health en Medical Research Council (575.552). NW wordt ondersteund door een Australische Postgraduate Award. OW wordt ondersteund door een RD Wright Fellowship van de Australische National Health Medical Research Council.

<ol><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+clinical+and+experimental+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: clinical and experimental update.</a> J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).</li>
<li>Conlan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+host-pathogen+interactions+in+the+liver+and+spleen+during+systemic+murine+listeriosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview.</a> Immunobiology. 201, 178-187 (1999).</li>
<li>Neuenhahn, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+functions+of+splenic+CD8alpha%2B+dendritic+cells+during+infection+with+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens.</a> Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).</li>
<li>Cousens, L. P., Wing, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+defenses+in+the+liver+during+Listeria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate defenses in the liver during Listeria infection.</a> Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).</li>
<li>Cheers, C., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+and+susceptibility+of+mice+to+bacterial+infection%3A+genetics+of+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis.</a> Infect Immun. 19, 755-762 (1978).</li>
<li>Garifulin, O., Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+as+a+probe+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes as a probe of immune function.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).</li>
<li>Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+resistance+to+Listeria+monocytogenes%3A+regulation+of+leukocyte+inflammatory+responses+by+the+Hc+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus.</a> J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).</li>
<li>Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C5-sufficient+A%2FJ+congenic+mouse+strain.+Inflammatory+response+and+resistance+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).</li>
<li>Boyartchuk, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenic+control+of+Listeria+monocytogenes+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice.</a> Nat Genet. 27, 259-260 (2001).</li>
<li>Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+resistance+locus+sst1+controls+innate+immunity+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice.</a> J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).</li>
<li>Pan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipr1+gene+mediates+innate+immunity+to+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis.</a> Nature. 434, 767-772 (2005).</li>
<li>Garifulin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf3+polymorphism+alters+induction+of+interferon+beta+in+response+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection.</a> PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).</li>
<li>Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+different+strains+of+Listeria+monocytogenes+serovar+1%2F2a%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a.</a> Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).</li>
<li>Wollert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Listeria is een van de meest gebruikte organismen om immuunresponsen van de gastheer op intracellulaire bacteriën te karakteriseren6. Het hier gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om de bacteriële load en de responsen van immuuncellen in hetzelfde weefsel van een specifieke muis te meten. Deze dubbele meting van een bepaald weefsel per geïnfecteerde muis zorgt voor robuustere vergelijkingen binnen en tussen muiscohorten (die respectievelijk verschillende muizenstammen of tijdstippen na infectie vertegenwoordigen). Hoewel Listeria-infectie via orale toediening ook zou kunnen worden gebruikt om immuunresponsen bij muizen te bestuderen, wordt infectie via intraveneuze injectie vaak gebruikt omdat: 1) het een snelle en effectieve afgifte in de bloedbaan garandeert; 2) het resulteert in een gesynchroniseerde en consistente systemische infectie; en 3) de Mus-soort een mutatie vertoont in het gen dat codeert voor de E-cadherine-receptor, wat Listeria-infectie via orale toediening beperkt (deze mutatie beïnvloedt het vermogen van Listeria om zich aan de E-cadherine-receptor van de muis te binden en de epitheelwand van het gastro-intestinale kanaal efficiënt te passeren)16-18.
Er zijn enkele kritieke stappen in dit protocol. Ten eerste moet de Listeria-inoculumvoorraad worden gegenereerd uit een verse overnight HBA-cultuur om de levensvatbaarheid en virulentie te waarborgen. Ten tweede is het belangrijk om de CFU-concentratie van het inoculum nauwkeurig te bepalen vóór en na het injecteren van alle muizen, om ervoor te zorgen dat de CFU-concentratie niet sterk verschilt tussen de eerste en de laatste geïnjecteerde muis. Ten derde moet de injectie van Listeria in de staartvin consistent zijn voor alle muizen. Ten slotte is het noodzakelijk om de lever te perfunderen om niet-residente leukocyten te verwijderen, zodat immuuncellen binnen de lever nauwkeurig kunnen worden gemeten en niet de leukocyten die via het perifere bloed passeren. Als een van deze stappen niet succesvol wordt uitgevoerd, kan dit leiden tot ongewenste variabiliteit in de bacteriële load en/of immuunresponsen tussen individuele muizen die zijn geïnfecteerd met Listeria.
Twee beperkingen van dit protocol zijn de vaardigheid van de onderzoeker bij het infecteren van muizen via intraveneuze injectie en de detectie van de bacteriële load in weefsels. Als één persoon een groot aantal muizen injecteert, kan de levensvatbaarheid van Listeria (d.w.z. de CFU-concentratie) in de loop van de tijd afnemen zodra het bevroren inoculum is ontdooid (bijv. &gt;2 uur tussen de injectie van de eerste en de laatste muis). Het is aan de onderzoeker om te bepalen hoeveel muizen hij/zij kan injecteren voordat het inoculum is aangetast. Een andere beperking van deze methode is dat de Listeria-load niet nauwkeurig kan worden gemeten onder de 100CFU/orgaan vanwege de relatief kleine hoeveelheden gekweekt weefselhomogenaat (bijv. Figuur 3 geeft aan dat 100CFU/orgaan de detectielimiet is). Om lagere waarden voor CFU/orgaan nauwkeuriger te meten, kan een grotere hoeveelheid weefselhomogenaat worden gekweekt (tot 0,5mL per plaat, er kunnen meerdere platen worden gebruikt), zodat een groter deel van het weefsel wordt bemonsterd voor de detectie van Listeria. Als er geen Stomacher beschikbaar is, kunnen alternatieve methoden om het weefsel te homogeniseren, zoals het gebruik van een weefselhomogenisator, in plaats daarvan worden gebruikt voor stappen 7.1-7.2. Wat betreft de praktijk: als de ruimte in de 37°C incubator beperkt is voor het kweken van weefselmonsters van geïnfecteerde muizen, kunnen HBA-cultureplaten 2-3 dagen bij kamertemperatuur worden geïncubeerd (de kolonies zullen bij kamertemperatuur langzamer groeien). Kamertemperatuur mag echter niet worden gebruikt bij het kweken van culturen voor de bereiding van bevroren Listeria-stocks.
Dit protocol biedt een basisbenadering voor het karakteriseren van Listeria-infecties bij muizen en kan worden gebruikt met andere Listeria-stammen naast EGD. Naast de lever en milt kunnen er ook enkeltcel-suspensies van lymfeklieren worden gegenereerd. In beide gevallen kunnen deze enkeltcel-suspensies worden gebruikt voor diverse analyses, waaronder het meten van immuuncel-subsets en de in vitro stimulatie van gesorteerde immuuncellen. Zodra de basistechnieken beheerst zijn, kan dit protocol ook worden aangepast om Listeria-specifieke T-cellen te isoleren19, dendritische cellen te karakteriseren20, of immuuncel-depletie uit te voeren op bepaalde tijdstippen na infectie21,22 om de immuunrespons bij met Listeria geïnfecteerde muizen grondiger te karakteriseren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Paard bloed agar base No.2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> De voorbereiding van agar basis voor HBA platen </td></tr><tr><td> Paard bloed (gedefibrineerd) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> Voeg 5-10% agar-agar base </td></tr><tr><td> Brain hart infusie (BHI) bouillon (10 ml) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> Brain hart infusie uitgedroogd media </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well vlakke bodemplaat </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um zeef cel </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischaaltje </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 Biomaster lab systeem </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastic zakken Stomacher </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine serum albumine </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> FACS buffer </td><td></td><td></td><td> 0,1% (w / v) runder serum albumine in PBS </td></tr><tr><td> Isotone Percoll (33,75% Percoll in PBS) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS maakt 100 ml isotone Percoll </td></tr><tr><td> TAC Buffer </td><td></td><td></td><td> 17mm Tris, 140mm ammoniumchloride in gedestilleerd water </td></tr><tr><td> FCS / EDTA-buffer </td><td></td><td></td><td> Foetaal kalf serum met 10mm EDTA </td></tr><tr><td> FACS / EDTA-buffer </td><td></td><td></td><td> FACS buffer + 5mM EDTA </td></tr><tr><td> Trypan blauw </td><td> Sigma </td><td> T6146 </td><td> 0,4% (w / v) in PBS, filter gesteriliseerd </td></tr><tr><td> 2 ml Cryovial </td><td> Greiner Bio Een </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 gauge/1mL insulinespuit </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> Naald </td><td> Terumo Medical Products </td><td> NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> Injectiespuit </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS-01t (1 ml), SS-053 (5 ml), SS-10S (10 ml) </td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met listeria monocytogenes</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is een Gram-positieve facultatief intracellulaire pathogeen 1. Muizen studies meestal intraveneuze injectie van Listeria in dienst, wat resulteert in de systemische infectie 2. Na injectie, Listeria verspreidt snel naar de milt en lever als gevolg van opname door CD8α + dendritische cellen en Kupffercellen 3,4. Eenmaal gefagocyteerd, diverse bacteriële eiwitten kunnen Listeria naar het fagosoom ontsnappen, in het cytosol te overleven, en de naburige cellen infecteren 5. Tijdens de eerste drie dagen van de infectie, de verschillende aangeboren immuun cellen (bijvoorbeeld monocyten, neutrofielen, NK-cellen, dendritische cellen) bemiddelen bactericide mechanismen die Listeria proliferatie te minimaliseren. CD8 + T-cellen worden vervolgens gerekruteerd en verantwoordelijk voor de uiteindelijke klaring van Listeria van de gastheer, meestal binnen 10 dagen na infectie 6. Succesvolle klaring van Listeria van geïnfecteerde muizen afhankelijk van de juiste begin van de gastheer immuunreacties 6. Er is een breed scala aan gevoeligheden onder inteelt muizenstammen 7,8. Over het algemeen, muizen met een verhoogde gevoeligheid voor Listeria infecties zijn minder in staat om bacteriële proliferatie controle, waaruit blijkt toegenomen bacteriële belasting en / of vertraagde klaring ten opzichte van resistente muizen. Genetische studies, waaronder linkage analyses en knock-out muis stammen, hebben geïdentificeerd verschillende genen die sequentievariatie gastheer reacties treft om Listeria besmetting 6,8-14. Bepaling en vergelijking van de infectie kinetiek tussen de verschillende muizenstammen is dan ook een belangrijke methode voor het identificeren van gastheer genetische factoren die tot immuunreacties bij te dragen tegen Listeria. Vergelijking van de gastheer reacties op de verschillende stammen Listeria is ook een effectieve manier om bacteriële virulentie factoren die kunnen dienen als potentiële doelwitten voor antibiotica of vaccins ontwerp te identificeren. We beschrijven hier een eenvoudige methode voor het meten van bacteriële belasting (kolonievormende eenheden [CFU] per weefsel) en het voorbereiden van eencellige suspensies van de lever en milt voor FACS-analyse van immuunresponsen bij Listeria-geïnfecteerde muizen. Deze methode is vooral nuttig voor de initiële karakterisering van Listeria-infectie in nieuwe muizenstammen, evenals de vergelijking van de immuunrespons tussen verschillende muizenstammen die besmet zijn met Listeria. We gebruiken de Listeria monocytogenes EGD stam 15 die, wanneer gekweekt op bloed-agar, een karakteristieke stralenkrans rond elke kolonie als gevolg van β-hemolyse 1 (figuur 1) vertoont. Bacteriële belasting en immuunreacties kan worden bepaald op welk tijdstip-punt na de infectie door het kweken van weefsel homogenaat op bloed agar platen en het voorbereiden van weefsel celsuspensies voor FACS analyse met behulp van de hieronder beschreven protocollen. Wij merken dat individuen die immuungecompromitteerd zijn of zwanger bent niet mag Listeria hanteren, en de desbetreffende institutionele bioveiligheid commissie en dier moet het management worden geraadpleegd voordat het werk begint.

Listeria monocytogenes is een modelorganisme voor het bestuderen van immuunreacties en de genetische gevoeligheid voor bacteriën intracellulaire bij muizen. Deze methode stelt je in staat om bacteriële lading te meten en single-cell suspensies van de lever en de milt van de muizen voor het genereren van FACS-analyse van veranderingen in het immuunsysteem van cellen als gevolg van Listeria-infectie te bepalen.

Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is een Gram-positief facultatief intracellulair pathogeen1. In muisstudies wordt doorgaans gebruikgemaakt van intraveneuze injectie van ...

Deze video demonstreert een methode voor het meten van de bacteriële last en het genereren en analyseren van enkelcel-suspensies van de lever en milt van muizen. Allereerst wordt een listeria-inoculum voorbereid en intraveneus geïnjecteerd in muizen. Vervolgens worden bloed, lever en milt geoogst van geëuthanaseerde muizen op gekozen tijdstippen.Enkelcel-suspensies worden bereid uit geoogste weefsels en weefselhomogenaten die zijn gekweekt op paardenbloedagarplaten. De resulterende celsuspensies kunnen vervolgens via FACS-analyse worden geanalyseerd op levensvatbaarheid en immuuncelgehalte, terwijl de bacteriële load wordt bepaald op basis van colony forming units. Deze methode kan helpen bij het karakteriseren van immuunresponsen op een steroidinfectie, zoals die tussen vatbare en resistente mal-stammen, terwijl gelijktijdig de bacteriële load in geïnfecteerde organen wordt bepaald.Begin deze procedure door het listeria-inoculum voor te bereiden tot de gewenste concentratie; instructies voor het kweken, bewaren en voorbereiden van listeria zijn te vinden in het bijbehorende geschreven protocol. Zodra het inoculum gereed is, brengt u twee aliquots van 100 µL over naar steriele microcentrifugebuisjes met 900 µL PBS om een verdunning van 1:10 te maken, breng vervolgens 100 µL van elke verdunning over naar paardenbloedagar (HBA) platen en verspreid dit grondig met een steriele spreider voor het bepalen van het aantal colony forming units (CFU); incubeer de platen vervolgens ondersteboven bij 37 °C gedurende de nacht. Plaats daarna de muizen in een schone kooi.Plaats de kooi vijf minuten lang op 50 centimeter onder een infraroodlamp van 250 watt om ervoor te zorgen dat de staartvene gedilateerd is. Dit zorgt voor een betere visualisatie tijdens de injectie. Hier worden de listeriabestendige muizenstam, C 57 black six, en de listeria-gevoelige muizenstam Valve C geïnjecteerd. Meng de listeriasuspensie voorzichtig door de buis een paar keer om te keren.Vul vervolgens een spuit van 1 milliliter met een naald van 27 gauge voor de injectie van 200 µL per muis. Zorg ervoor dat eventuele luchtbellen in de spuit worden verwijderd vóór de injectie. Plaats de muis in een fixatieapparaat.Lokaliseer vervolgens de laterale staartader van de muis door eerst de staartslagader te identificeren, die zich in het midden van de dorsale zijde bevindt. Draai de staart daarna iets naar de laterale zijde om de ader te identificeren. Veeg de staart voorzichtig schoon met een 70% ethanol-doekje en injecteer vervolgens nadat de spuit is teruggetrokken.Oefen kort druk uit op de insteekopening met een steriel gaasje. Let op dat het na de injectie veel moeilijker is om de staartvene bij zwartgekleurde muizen te identificeren. Plaats de muis terug in de kooi nadat alle muizen van de plaat zijn geïnjecteerd en incubeer het resterende inoculuum voor het tellen van de colony forming units.Tel, net als op de vorige dag, het aantal kolonies en bepaal de concentraties van het listeria-inoculum vóór en na de injectie. De karakteristieke halo rondom individuele kolonies, zoals hier getoond, is het gevolg van bèta-hemolyse. Zodra de tellingen vóór en na de injectie zijn bepaald, wordt het gemiddelde aantal colony forming units berekend door de tellingen van de colony forming units vóór en na de injectie bij elkaar op te tellen en te delen door twee.Verzamel tot slot op verschillende tijdstippen na injectie bloed en oogst de lever en milt van de geëuthanaseerde muizen. Indien er een fax-analyse zal worden uitgevoerd, moet de lever voor verwijdering worden geperfuseerd om bloed te verwijderen; voer direct na euthanasie een hartpunctie uit en verzamel zoveel mogelijk bloed in een geschikte opvangbuis. Om de lever te perfuseren, opent u eerst de buikholte en verwijdert en verwierpt u de galblaas.De vena cava inferior is een ader die parallel aan de wervelkolom loopt en bloed uit het onderste deel van het lichaam, inclusief de lever, naar het hart transporteert. Gebruik een schaar om de ader net onder het hart door te snijden, zodat er een uitgang ontstaat voor het perfusievloeistof. Klap vervolgens de leverkwabben richting de kop en schuif de darmen naar rechts om de vena portae hepatis bloot te leggen, die in de onderzijde van de lever uitmondt.Steek vanaf de rechteronderzijde een gebogen naald van 26 gauge en een halve inch lengte in de vena portae hepatis en injecteer 10 milliliters PBS. Nadat één tot twee milliliters PBS is geïnjecteerd, zal de lever veranderen van donkerrood naar lichtbruin. De geïnjecteerde oplossing zal uit de doorgesneden vena cava inferior stromen. Leverperfusie garandeert dat de geoogste cellen uit de lever komen en niet uit het circulerende bloed.Verwijder vervolgens de geperfuseerde lever uit de lichaamsholte van de muis en dompel deze onder in de buis met facts-buffer op ijs. Verwijder daarna de milt en plaats deze op ijs voor verwerking op een soortgelijke wijze als beschreven in de volgende sectie. Om uit de lever suspensies van enkelvoudige hepatische cellen te genereren, begint u met het overbrengen van de geperfuseerde lever vanuit de fax-buffer naar een cellenzeef van 70 micron die in een Petrischaal van 60 millimeter is geplaatst.Duw het weefsel met de zuiger van een spuit van vijf liter door de celzeef in de Petrischaal. Breng de suspensie van enkelvoudige cellen over naar een conische schroefdopbuis van 50 milliliter en vul het totale volume aan tot 40 milliliter met koude fax-buffer.Vortex de celsuspensie. Zet vervolgens een aliquot van 1 ml apart voor de bepaling van de bacteriële load. Plaats later in de procedure de koker van 50 ml in de centrifuge en pellet de cellen door deze vijf minuten te centrifugeren bij 500 ×g en 4 °C.Nadat het supernatant is weggegooid, wordt deze wasstap herhaald door het pellet te resuspenderen in 40 milliliters koud fax-buffer en te centrifugeren. Resuspendeer het pellet vervolgens in 20 milliliters isotoon per hole bij kamertemperatuur en centrifugeer de celsuspensie bij 700 times G gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur.Na het centrifugeren zal een schijfvormige laag hepatocyten bovenop het percoll drijven en zullen de leukocyten opnieuw naar de bodem van de buis worden gepelletteerd; gooi de hepatocytenlaag en het percoll weg door deze in een afvalcontainer te gieten. Resuspendeer vervolgens het pellet met leukocyten in vier milliliters TAC-buffer om erytrocyten te lyseren en incubeer de cellen tot 10 minuten bij kamertemperatuur onder frequente inversie. Filtreer na de incubatie de celsuspensie door een nylon membraan van 100 micron in een nieuwe centrifugebuis van 10 milliliter.Voeg één milliliter FACS-EDTA-buffer toe onder de gefiltreerde celсусpensie, zoals hier getoond. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 350 ×g bij 4 °C. Resuspendeer na de centrifugatie in vijf milliliter FACS-EDTA-buffer, centrifugeer opnieuw en resuspendeer het pellet in 0,5 tot 3 milliliter FACS-EDTA-buffer, afhankelijk van de grootte van het pellet. Bepaal het aantal levensvatbare hepatische leukocyten met een hemocytometer op basis van trypaanblauw-uitsluiting.Enkelcel-suspensies kunnen vervolgens worden gelabeld met antilichamen die specifiek zijn voor de gewenste celoppervlaktemarkers en geanalyseerd worden via FACS. Zodra de enkelcel-suspensies uit lever- en miltweefsel zijn gegenereerd, wordt voor bepaalde delen van de procedure de bacteriële last bepaald. Een Stomacher-machine wordt gebruikt om het weefsel te homogeniseren, waarbij een Stomacher-zak stevig wordt gesloten om lekkage te voorkomen.Begin met het plat neerleggen op een schone werkbank. Rol met een dikke ronde pen over het weefsel totdat het weefsel in de zak is geplet. Voeg vijf milliliters PBS toe aan elke zak met maaginhoud die geplet weefsel bevat.Plaats de maag of de zakken in de stomach blender en laat deze 10 minuten op hoge snelheid draaien. De stomach blender heeft twee peddels die de maag of zakken met een specifieke snelheid persen, waardoor de inhoud wordt gemengd tot een uniform homogenaat. Meng het homogenaat in de zak met behulp van een pipette om eventuele aerosolen te beheersen. Breng vervolgens 300 µL in dubbelvoud over naar een 96-well plaat met een platte bodem.Voer in de wells van de 96-well plaat seriële verdunningen van 1:10 uit tot een verdunning van 10⁻⁵. Gebruik voor elk weefselhomogenaatmonster voorzichtig een steriele spreider om 0,1 milliliters van elke verdunning uit te strijken op een vooraf gedroogde HBA-plaat. Incubeer de platen gedurende één nacht bij 37 °C.Tel de volgende dag het aantal kolonievormende eenheden voor elke verdunning en bereken de kolonievormende eenheden per weefsel, rekening houdend met het weefselgedeelte, de verdunningsfactoren en het volume homogenaat. Om te zien of C 57 black six muizen waren geïnfecteerd met ongeveer 2000 kolonievormende eenheden listeria, werden de muizen drie en zeven dagen na infectie geëuthanaseerd en werden de lever geperfuseerd en geoogst samen met de milt. Verdunningen van het milt-homogenaat of de hepatische single-cell suspensie werden gekweekt op HBA-platen om de bacteriële load te bepalen.In de hier getoonde resultaten geeft de stippellijn de detectielimiet aan van 100 colony forming units per orgaan. Let op dat de listeria-last op dag drie hoger is dan op dag zeven. Dit komt doordat diverse immuuncellen tegen dag zeven leiden tot de klaring van listeria.In deze twee weefsels, milt en lever, werden enkelcel-suspensies gekleurd met trypaanblauw en geladen op een hemocytometer. Cellen binnen het telgebied dat in het rode kader is aangegeven, worden geteld. Niet-levende cellen nemen trypaanblauw op en kleuren blauw, terwijl levende cellen ongekleurd blijven.Zoals hier wordt getoond, neemt het aantal levensvatbare cellen in de milt (links) en het aantal levensvatbare leukocyten in de lever (rechts) toe tijdens het verloop van de infectie. Deze toename is te wijten aan immuuncellen, waaronder neutrofielen en lymfocyten, die worden geactiveerd, prolifereren en migreren naar deze twee infectieplaatsen. Als voorbeeld van de immuuncelspiegels tijdens het verloop van een listeria-infectie worden hier representatieve fax-plots en het aantal CD8-positieve T-cellen getoond.Het aantal CD8-positieve T-cellen neemt tijdelijk af als gevolg van lymfopenie in de milt op dag twee tot drie, om vervolgens vanaf dag vijf na infectie aanzienlijk toe te nemen in zowel de milt als de lever. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals oscillatie van androgenen, antigeenspecifieke T-cellen en functionele assays van gesorteerde immuuncellen, worden uitgevoerd om de immuunresponsen op een listeria-infectie verder te karakteriseren.

measuring-bacterial-load-immune-responses-mice-infected-with-listeria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Lo, B. C., et al. Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the quantification of bacterial load in a mouse model of chronic infection with streptomycin-resistant Salmonella typhimurium. Following euthanasia and sterile dissection, cecal and splenic tissues are harvested, homogenized with steel beads to release bacteria, and serially diluted. Dilutions are plated on selective agar, and visible colonies are counted to estimate...

Quantification of Tissue Bacterial Load in a Mouse Model of Chronic Intestinal Infection

Source: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the injection of Listeria monocytogenes into the tail vein of a mouse to establish systemic infection. It shows bacterial circulation, organ colonization, and the quantification of bacterial load in the heart by homogenizing tissue, performing serial dilutions, and plating.

Quantifying Bacterial Load in the Mouse Heart Following Tail Vein Injection of Listeria monocytogenes

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

This video demonstrates the quantification of the infective bacterial load from the perfused mouse brain infected with Listeria monocytogenes.

Assessing Bacterial Colonization in a Mouse Brain following Listeria monocytogenes Infection

Dit document beschrijft een nieuwe werkwijze voor orale infectie van muizen...

Mondelinge transmissie van<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Muizen via inname van besmet voedsel

Listeria monocytogenes veroorzaakt foetale infecties bij zwangere vrouwen en meningitis bij gevoelige populaties.  Subpopulaties van bacteriën kunnen hartweefsel koloniseren, waardoor myocarditis ontstaat bij patiënten en proefdieren.  Hier presenteren we een protocol dat beschrijft hoe L. monocytogenes cardiale celinvasie in vitro en cardiale kolonisatie bij geïnfecteerde dieren te beoordelen.

Beoordeling van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en hartkolonisatie bij geïnfecteerde muizen met listeria monocytogenes

Dit protocol beschrijft het enten van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) en interferon-γ (IFN-γ) responsen door natuurlijke killer (NK) cellen, natuurlijke killercellen (NKT) cellen te meten, en adaptieve T-lymfocyten na de infectie. Dit protocol beschrijft ook hoe om te overleven onderzoek bij muizen na infectie met een aangepaste LD 50 dosis van de ziekteverwekker.

Experimentele infectie met<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als een model voor de studie Host Interferon-γ Responses

Tijdens de infectie is Listeria monocytogenes geschikt voor het oversteken van de bloed - hersen barrière om te koloniseren van de hersenen. In dit protocol, laten we zien hoe te beoordelen van bacteriële kolonisatie van organen na infectie van muizen. Is voorzien in een procedure voor het uitvoeren van hele orgel perfusie voor specifieke bepaling van bacteriële aantallen in de hersenen parenchym.

Listeria monocytogenes Infectie van de hersenen

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

Hier presenteren we een elegante protocol voor in vivo evaluatie van vaccin effectiviteit en host immuunrespons. Dit protocol kan worden aangepast voor vaccin modellen die studeren virale, bacteriële of parasitische ziekteverwekkers.

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Leer hoe je bacteriële belasting meet en enkelvoudige celoplossingen genereert uit lever en milt van muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes. Deze methode karakteriseert immuunresponsen en analyseert verschillen tussen gevoelige en resistente muizenstammen.

Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes

Meer video's verkennen