Name: Rat mesenterium Angiogenese Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Leer hoe u de novo angiogenese kwantitatief bestudeert in rattenmesenteriumvensters. Deze methode maakt nauwkeurige metingen van bloedvatdichtheid en patroonvorming mogelijk voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiële ondersteuning voor de meeste van de studies werd verstrekt door de Zweedse Medical Research Council (subsidie ​​5942).

1. Dieren <ol><li> Kleine knaagdieren, zoals ratten, muizen en cavia&#39;s, zijn gebruikt als de diermodellen. Helaas, volwassen muizen (veel muizenstammen zijn beoordeeld) hebben de neiging om geen of slechts een zeer gering aantal potentiële-ouder microvaten (waarvan angiogenese kan afkomstig zijn) binnen hun mesenteriale vensters, waardoor studies met muizen onbetrouwbaar. Daarom heeft de test is ontwikkeld in de eerste plaats voor ratten. </li><li> De ratten, die met een standaard omgeving geacclimatiseerd gedurende ten minste 7 dagen na levering van de fokker, worden meestal ondergebracht in paren in een standaard kooi onder een 12-uurs licht / donker cyclus met vrije toegang tot water en pellets. Elk dier is gemarkeerd. We maken gebruik van veelal jonge volwassen ratten (meestal 7-10 weken oud van verschillende stammen, maar meestal mannelijke Sprague-Dawley ratten, bij ratten jonger dan 5-6 weken oud is het aantal inheemse microvaten doorgaans laag), verkregen uit diverse fokkers. In de periode voorafgaand aan het experiment en de rest van het experiment, worden de dieren gewogen om de dag, en altijd op de dag van het offer. Wanneer de dieren worden behandeld gelijktijdig ip (voor de inductie van angiogenese, zie hieronder) en sc of iv of po, ze zijn gewogen per dag. Dit maakt het opzetten van experimentele en controlegroepen van gelijke lichaamsgewicht bij de start van het experiment, en maakt de controle van de invloed van de behandeling op lichaamsgewicht-gain in de loop van het experiment. Omdat volwassen mannelijke ratten groeien robuust fysiologisch (het verkrijgen van ongeveer 40-60 g per week afhankelijk van het type stam), gewicht-gain retardatie is een gevoelige vervanger marker van toxiciteit, systemische welzijn, anorexia, en het niet gedijen. </li></ol> Wij werken in een high-standaard dier zorgcentrum en aanzienlijke inspanningen worden gedaan om de niveaus van stress ervaren door de dieren te minimaliseren. De huidige ethische richtlijnen die zijn vastgesteld door de Workman P. et al.. (Richtlijnen voor het welzijn en het gebruik van dieren in het kankeronderzoek. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). De Animal Ethics Committee van de Universiteit van Göteborg goedgekeurde deze studies. 2. Pro-angiogene intraperitoneale behandeling <ol><li> De kandidaat pro-angiogene factor te testen is opgelost en verdund in het endotoxine-vrije zoutoplossing gebruikt voor intraveneuze infusie van de patiënten (zelfs bij extreem lage niveaus, endotoxine is pro-angiogene). Alle oplossingen zijn opgebouwd uit vers op de dag van de injectie, steriel gefiltreerd (Millipore 0,22-um filtratie), gecontroleerd voor de neutrale pH (7.1 tot 7,3), en worden gebruikt bij kamertemperatuur. De test-agent wordt geïnjecteerd bij lage of zeer lage concentraties. Bijvoorbeeld, rat rVEGF 164 (564-RV/CF, R &amp; D Systems Europe, Ltd, Oxon, Verenigd Koninkrijk) is, dat is de belangrijkste VEGF-A isovorm bij ratten, verdund tot 96 pmol / ml in endotoxine-vrij zout, bevroren en ontdooid en een volume van 5 ml wordt geïnjecteerd ip in de rat. We maken gebruik van een 5-ml spuit met 0,8-mm naald (groene naald, 21G) voor ip injectie. Deze behandeling, tweemaal daags voor 4,5 dagen, dwz., Vanaf maandag &#39;s ochtends (dag 0) tot en met vrijdag ochtend (dag 4), veroorzaakt een stevige kiemen angiogenese reactie in de mesenteriale-test weefsel, met een piek rond dag 21. Het beheer van de oplossing ip zorgt ervoor dat het volledige volume wordt geleverd in de buikholte (en niet in de darmen, blaas of een ander orgaan). De snelle injectie van 5 ml kan tactiele bevestiging door de exploitant dat het fluïdumstraal heeft doorgegeven via de buikwand in de buikholte. Na de, voorafgaand aan of tegelijkertijd met het ip pro-angiogene behandeling, kan elke testen agent van de keuze systemisch worden toegediend. </li></ol> 3. Systemische Administation van angiogenese-modulerende Agents <ol><li> Elke andere route dan de ip route kan worden gebruikt, omdat ip behandeling kan de lopende angiogene reactie door de inductie van de ontsteking of mogelijk door het activeren van mestcellen in de test weefsel, wat kan leiden tot een sterke pro-angiogene respons beïnvloeden. Naast de orale toediening of een enkele injectie sc of iv, we vaak gebruik van subcutane toediening met behulp van osmotische minipompen (een of meer, met wisselende volumes en pompen keer) om de oplossing bij een constante snelheid te leveren voor maximaal twee of meerdere weken. </li><li> Continue subcutane infusie van test-agenten Vullen en implantatie van osmotische minipompen Meestal op dag 5, dat wil zeggen, een dag na het einde van het ip VEGF-behandeling, osmotische minipompjes (bijvoorbeeld Model 2ML2, met een constante pompsnelheid van 5,0 pl / h voor 14 tot 15 dagen; Alzet Osmotische Pompen, Mountain View, CA , USA) zijn gevuld onder steriele omstandigheden met de test agent of het juiste voertuig. Na opslag in steriele 0,9% (w / v) NaCl &#39;s nachts bij 37 ° C, de pomp (s) zijn chirurgisch geïmplanteerd sc op de rug (aan de zijkant van de wervelkolom Column in de regio van de scapulae) van ratten die zijn verdoofd met behulp van isofluraan gas (Isoba dierenarts, Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co, Inc, Whitehouse Station, NJ, USA) in eerste instantie, in een luchtdichte transparante kamer en vervolgens via een masker (om de stress veroorzaakt aan de volgende dierlijke minimaliseren, is de kamer gespoeld met lucht voordat het wordt hergebruikt). De huid incisie gemaakt voor pomp implantatie wordt gehecht onmiddellijk na de implantatie met behulp van zijden draad. Omdat de dieren fysiologisch gewichtstoename tijdens de experimentele periode en de te testen middelen worden toegediend met een constante snelheid, de feitelijke dosering geselecteerd voor een test drug per kg lichaamsgewicht is hoger dan het gemiddelde dosering bij het begin van de infusie periode en is lager dan de gemiddelde dosering aan het eind van de infusie periode. Continu infuus, zoals hier beschreven, kan worden gezien als een uitgebreide vorm van metronomische behandeling. </li></ol> 4. Het beëindigen van de Experiment <ol><li> Een dier op een moment wordt geplaatst in een transparante luchtdichte kamer, die wordt gespoeld met CO 2-gas, die snel doodt het dier. De kamer wordt gespoeld met lucht voordat zij opnieuw worden gebruikt. </li></ol> 5. Oogsten weefselmonsters <ol><li> Zoals weergegeven in de dvd, is de buikwand geopend en de kleine-darm mesenterium is geïdentificeerd, inclusief de meest distale deel dat de ileo-cecal ventiel (de kruising van de dunne darm en de dikke darm) bereikt. Vier (of meer) van de meest distaal gelegen &quot;windows&quot; zijn genummerd en verspreid op objectieve standaard onbehandeld Superfrost Plus-slides (DAKO Denmark A / S, Glostrup, Denemarken). Het is belangrijk om te voorkomen dat, indien mogelijk, besmetting van de monsters met bloed, darminhoud of andere lichaamsvloeistoffen, omdat deze materialen kan worden gekleurd niet-specifiek, maar dit doet niet af aan de daarop volgende immunohistochemische visualisatie van haarvaten. </li><li> Elke mesenteriale venster monster met aangehechte kleine darm segment is verspreid op een dia en gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Daarna wordt de darm stomp afgesneden, terwijl de intacte vliezige mesenterium monsters worden bewaard bij -20 ° C voor langere perioden. Dit wordt getoond in de DVD. </li></ol> Hierbij moet worden opgemerkt dat de weefsel en bloedvaten octrooi kunnen worden gevisualiseerd voor de oogst met doorvallend licht intravitale microscopie. 6. Protocol voor immunohistochemische kleuring van microvaten <ol><li> Dag 0 De monsters mogen van -20 ° C ontdooien tot kamertemperatuur gedroogd in een kast bij 60 ° C gedurende 1 uur, en bewaard bij kamertemperatuur gedurende de nacht. </li><li> Dag 1 Plaats de objectglaasjes in kleuring slide houders (in elke tweede spoor) in een kleuring pot en was twee keer met TBS (pH 7,8) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De oplossing is weggegooid en vervangen door de volgende oplossing, en zo verder voor alle volgende stappen. </li><li> Trypsine behandeling Vul de kleuring potje dat de kleuring diahouder zal de haven met trypsine-oplossing (25 ° C gedurende 20 minuten). Gooi de oplossing en incubeer tweemaal met 2,5% sucrose oplossing (kamertemperatuur gedurende 10 minuten per keer). Gooi de oplossing weg en spoel een paar keer in aqua dest (kamertemperatuur gedurende een paar minuten elk). </li><li> Het blokkeren van Vul de kleuring potje dat de kleuring diahouder zal de haven met 0,5% H 2 O 2 in methanol (kamertemperatuur gedurende 30 minuten). Gooi de oplossing en spoel na met gedestilleerd water (kamertemperatuur gedurende een paar minuten). Gooi de oplossing weg en spoel tweemaal met TBS (pH 7,4) (kamertemperatuur gedurende 8 minuten per keer). </li><li> Incubatie Alle incubaties zijn in een vochtige kamer bij kamertemperatuur. Ongeveer 150 pi van elk van de onderstaande oplossingen worden gebruikt per slide. De dia&#39;s worden geplaatst in een bevochtigde kamer en de oplossingen zijn gepipetteerd op de monsters (de niet-membraneuze onderdelen hoeven niet te worden gedekt door de oplossingen). Voor elk van de volgende stappen, schud voorzichtig korting op alle van de oplossing voor de volgende oplossing wordt toegevoegd. <ol><li> Incubatie met Normaal (blocking) serum (paard) (ABC kit) 3 druppels gele oplossing / 10 ml verdunning buffer gedurende 20 minuten. </li><li> Incubatie met primair antilichaam ARU0181, die rat vasculaire endotheliale cellen labels. Het antilichaam wordt verdund met verdunning 1:600 ​​buffer (Biosource) (100 ul verdund 40-voudige [bevroren], plus 900 ul verdunning buffer) en incubatie vindt plaats overnacht bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Dag 2 De dia&#39;s worden verwijderd uit de vochtige kamer, is het primaire antilichaam verwijderd, en de dia&#39;s worden geplaatst in een kleuring diahouder, dat is ondergedompeld in de kleuring pot en twee keer gespoeld met TBS(PH 7,8) gedurende 8 minuten. <ol><li> Incubatie met gebiotinyleerde antilichaam (ABC kit) De dia&#39;s worden horizontaal geplaatst in een bevochtigde kamer en geïncubeerd met een druppel blauwe oplossing / 10 ml verdunning buffer gedurende 30 minuten. Gooi de oplossing weg en plaats de dia&#39;s in een kleuring diahouder ondergedompeld in de kleuring pot en spoel tweemaal met TBS (pH 7,4) gedurende 8 minuten. </li><li> Incubatie met de ABC-reagens De dia&#39;s zijn weer horizontaal geplaatst in een bevochtigde kamer en de volgende oplossingen zijn gepipetteerd op de membraneuze delen van de monsters: 2 druppels oranje oplossing plus 2 druppels van bruine oplossing / 10 ml TBS (pH 7,4) gedurende 30 minuten. Meng zorgvuldig 30 minuten voor gebruik! Gooi de oplossing weg en plaats de dia&#39;s in de diahouder in de kleuring pot en spoel tweemaal met TBS (pH 7,4) gedurende 8 minuten. </li></ol></li><li> Kleuring met DAB (0,05%) Deze stap moet worden uitgevoerd in een geventileerde chemische kap! Plaats de dia&#39;s en voeg de 3,3-diaminobenzidine (DAB, Sigma-Aldrich)-oplossing met een pipet: 0,1% DAB-oplossing in TBS (pH 7,4) [bevroren] wordt verdund 1:1 met een mengsel van 10 pi H 2 O 2 en 7,5 ml TBS (pH 7,4). Deze oplossing is steriel gefiltreerd net voor gebruik (om eventuele deeltjes die de microscopische beeld kan obscure te elimineren). Vlekken op de monsters voor 8 minuten. Gooi de oplossing weg en plaats de dia&#39;s in de kleuring diahouder ondergedompeld in de kleuring pot. Spoel onder stromend water en vervolgens in aqua dest voor een paar minuten. </li><li> Uitdroging De dia&#39;s worden bewaard in de vlekken diahouder. Spoelen van het weggooien en opnieuw vullen van de vlekken pot met aqua dest / ethanol: aqua dest, 70% alcohol, 95% alcohol, absolute alcohol, met 2 minuten in elke oplossing. </li></ol> 7. Imaging en het inschatten van de microvasculaire netwerk in elke Mesenteriale Window Specimen Na immunohistochemische kleuring van de vasculaire endotheliale cellen Zoals te zien in de film, zijn microvaten microscopisch gevisualiseerd in situ in het intacte weefsel. <ol><li> Ten eerste gebruiken we een tekening microscoop met vergroting variëren van 14 tot 34 (Leica Wild M 3Z) om potlood op wit papier het gehele venster gebied, evenals de gehele gevasculariseerde gebied (VA) per mesenteriale venster. VA, als percentage van het hele gebied, is gemakkelijk te meten met behulp van geautomatiseerde of niet-geautomatiseerde planimetrie (of simpelweg door te snijden uit en weging van de afbeelding van het hele venster, en de beelden van al haar gevasculariseerd delen). </li><li> Met behulp van een andere tekening microscoop, individuele microvessel profielen, die gemakkelijk worden geïdentificeerd, zijn getekend in zwarte inkt op wit papier bij 80 vergroting in willekeurig gekozen gebieden. Dit is het uitgangspunt voor de daaropvolgende geautomatiseerde morfometrische beoordeling van microvasculaire lengte (MVL), die in feite een meting van de microvasculaire dichtheid. </li><li> Optioneel, variabelen met betrekking tot microvasculaire patroonvorming, kan evenals die voor de beoordeling van het aantal microvasculaire spruiten en de lengte van de individuele microvasculaire spruiten (nr. SP en Le. SP, respectievelijk) worden bepaald. -De optimale contrast tussen de afgebeelde zwarte schip structuren en de witte achtergrond maakt gedetailleerde analyses van de beelden in de meeste commerciële morfometrische geautomatiseerde programma&#39;s. </li><li> In de meeste gevallen zijn de belangrijkste variabelen zijn VA en MVL, die bij elkaar vermenigvuldigd genereren van de totale lengte van microvasculaire (TMVL). </li></ol> 8. Statistische analyse We meestal gebruik van de standaard niet-parametrische Mann-Whitney U-test om ongepaarde (tweezijdig) waarnemingen te analyseren. Een gemiddelde van vier mesenteriale ramen per dier wordt gebruikt als de onafhankelijke data-punt voor elke variabele van de mesenteriale venster. Het criterium voor de statistische significantie is P ≤ 0,05.

<ol><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+testing+with+angiogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li>
<li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast-cell-mediated+angiogenesis%3A+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch.+B+Cell.+Pathol.+Incl.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li>
<li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+meteronomic+chemotherapy%3A+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li>
<li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp, T. uneberg, S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF%28165%29-mediated+angiogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li>
<li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dalteparin%2C+a+low-molecular-weight+heparin%2C+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res.%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li>
</ol>

De test werd geïntroduceerd in 1986 3 en is achtereenvolgens verder ontwikkeld en verfijnd in ons laboratorium 7,10-12. Zoals besproken in review papers (uitgenodigde) 1, 2, de test vergelijkt goed met andere zoogdieren in vivo angiogenese assay in name gelet op belangrijke functies, zoals de volwassen-test weefsel is native gevasculariseerd en mist fysiologische angiogenese, minimaal trauma, indien van toepassing, is toegebracht aan het weefsel; echt kwantitatieve variabelen worden gemeten, wat een goede statistische analyse met betrekking tot de dosis-respons en moleculaire-activiteit studies mogelijk maakt; kiemen angiogenese voordoet, die overwegend in normale weefsels en tumoren, en toxiciteit zijn eenvoudig opgebouwd in ratten die robuust groeien fysiologisch op volwassen leeftijd. Nadelig functies kunnen zijn het feit dat de test is relatief veel tijd in beslag, in het bijzonder bij de beoordeling van het aantal en de lengte van de individuele microvessel segmenten en microvessel spruiten, dat het niet real-time/serial waarnemingen mogelijk te maken; en dat is nauwelijks geschikt voor muizen omdat veel mesenteriale ramen in muizen gebrek aan potentiële ouder haarvaten van waaruit nieuwe haarvaten kan ontstaan. Real-time waarnemingen zijn echter mogelijk gemaakt door intravitale microscopie, waar de exteriorized maar intact mesenteriale ramen zijn uit gespreid over een microscoop podium terwijl het dier onder narcose is, zoals besproken in een. Aanzienlijke vooruitgang in angiogenese onderzoek zijn bereikt in de afgelopen decennia met behulp van modellen zoals de hoornvlies micropocket, chick chorion-membraan, en sc Matrigel plug assays, die nuttig zijn, maar uiteindelijk beperkt tools. Toekomstige klinische toepassingen van anti-angiogene en pro-angiogene therapieën noodzakelijk de vestiging en de validatie van meer gevoelige en biologisch relevante, echt kwantitatieve pre-klinische modellen, zoals die wordt beschreven in het huidige rapport.

Buffers en reagentia 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) stock-oplossing Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60,57 g) wordt opgelost in ~ 900 ml gedestilleerd water en ~ 45 ml 25% HCl (geconcentreerd) wordt toegevoegd om de pH 7,8, gevolgd door verdunning tot 1 liter met gedestilleerd water te bereiken. Tris-buffer zoutoplossing (TBS, pH 7,8) Tot 200 ml van de stockoplossing wordt toegevoegd 18 g NaCl opgelost in ~ 1800 ml gedestilleerd water met een aanpassing van de pH op 7,8 met behulp van de voorraad-oplossing, gevolgd door verdunning tot 2 liter met aqua dest. TBS (pH 7,4) Tot 200 ml van de stockoplossing wordt toegevoegd 18 g NaCl opgelost in opgelost in ~ 1800 ml gedestilleerd water met een aanpassing van de pH tot 7,4 met behulp van de voorraad-oplossing, gevolgd door verdunning tot 2 liter met aqua dest. Trypsine-oplossing (0,05% trypsine, 0,1% CaCl 2) Bevat 0,1 g trypsine en 0,2 g CaCl 2 in 200 ml TBS (pH 7,8). Sucrose-oplossing 2,5% Bevat 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7,8). Stock oplossing van 1% Natriumazide in TBS (pH 7,4) Bevat 1 g Na-azide in 100 ml met TBS (pH 7,4). Verdunnen buffer: 0,1% BSA, 0,01% Na-azide (Wordt gebruikt om antilichamen te verdunnen in de Vectastain ABC kit). Bevat 0,1 g runder serum albumine (BSA) en 1 ml van 1% Na-azide, verdund tot 100 ml met TBS (pH 7,4). ABC-kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase muizen-IgG Normaal paard serum, het blokkeren van serum; gele oplossing: 3 drops/10 ml verdunning buffer. Gebiotinyleerd antilichaam; anti-muis IgG, blauwe oplossing: een drop/10 ml verdunning buffer. ABC-reagens: oranje oplossing, 2 druppels plus bruine oplossing 2 ml drops/10 TBS (pH 7,4). Meng deze oplossingen 20 minuten voor gebruik! Muis (monoklonaal) anti-rat endotheel (Biosource International, Camarillo, CA, USA) <table border="1"><tbody><tr><td> Catalog # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Kloon # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Dit antilichaam is gericht tegen alle vasculaire endotheliale cellen in de rat, met uitzondering van die in de hersenen. Vectastain peroxidase avidine biotine Complex (ABC) kit De kit bevat primaire antilichaam, gebiotinyleerd tweede antilichaam, avidine-gebiotinyleerde enzym complex (ABC), en enzym substraat. Zie <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> of <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> voor protocollen. Bovine serum albumine (BSA) (Sigma-Aldrich, catalogus # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalogus # D 9015). Trypsine uit Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalogus # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, muis IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Jarfalla, Zweden)

rat mesenterium angiogenese assay

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

De volwassen rat mesenterium venster angiogenese assay is biologisch passend en is bij uitstek geschikt voor de studie van kiemen angiogenese in vivo [zie review papers], dat is de dominante vorm van angiogenese in de menselijke tumoren en niet-tumor weefsel, zoals besproken in uitgenodigde herziening papers 1,2. Angiogenese geïnduceerd in het membraneuze mesenteriale onderdelen door intraperitoneale (ip) injectie van een pro-angiogene factor kan gemoduleerd worden door subcutane (sc), intraveneus (iv) of orale (po) behandeling met het wijzigen agenten van keuze. Elk membraneuze deel van het mesenterium is doorschijnend en omlijst door vetweefsel, waardoor het een window-achtige uitstraling. De test heeft de volgende gunstige eigenschappen: (i) de test weefsel is native gevasculariseerd, zij het ​​mondjesmaat, en omdat het is extreem dun, het microvessel netwerk is zo goed als twee-dimensionale, waardoor het hele netwerk om microscopisch worden beoordeeld in situ; ( ii) bij volwassen ratten de test weefsel mist belangrijke fysiologische angiogenese, die de meeste normale volwassen weefsels zoogdieren kenmerkt, de mate van inheemse vascularisatie is echter gecorreleerd met de leeftijd, zoals besproken in een, (iii) het verwaarloosbaar niveau van de trauma-geïnduceerde angiogenese zorgt voor een hoge gevoeligheid, (iv) de test een replica van de klinische situatie, aangezien de angiogenese-modulerende testen drugs zijn systemisch toegediend en de responsen waargenomen weerspiegelen het netto-effect van alle metabolische, cellulaire en moleculaire veranderingen veroorzaakt door de behandeling, (v) de assay kunnen evaluaties van objectieve, kwantitatieve, onpartijdige variabelen van microvasculaire ruimtelijke uitbreiding, dichtheid, en netwerk patroonvorming, evenals van capillaire kiemen, waardoor robuuste statistische analyses van de dosis-effect en moleculaire structuur-activiteit relaties, en (vi ) de test laat zien met een hoge gevoeligheid van de toxische of schadelijke effecten van behandelingen op het gebied van verminderde mate van fysiologische lichaamsgewicht te winnen, als volwassen ratten groeien robuust. Mast-cel-gemedieerde angiogenese werd voor het eerst aangetoond met behulp van deze test 3,4. Het model toont een hoge mate van discriminatie ten aanzien van dosis-effect relaties en de gemeten effecten van systemisch toegediende chemisch of functioneel nauw verwante drugs en eiwitten, waaronder: (i) een lage dosering, metronomically toegediende standaard chemotherapeutica dat diverse, drug-specifieke effecten opleveren (dat wil zeggen, angiogenese-onderdrukkende, neutraal of angiogenese-stimulerende activiteiten 5), (ii) natuurlijke ijzer-onverzadigde humaan lactoferrine, dat VEGF-A-gemedieerde angiogenese 6 stimuleert, en natuurlijk ijzer-onverzadigde runderen lactoferrine, dat remt VEGF-A- gemedieerde angiogenese 7, en (iii) een laag-moleculair-gewicht heparine fracties geproduceerd door verschillende manieren 8,9. Bovendien is de test zeer geschikt voor studies naar de gecombineerde effecten op de angiogenese van de agenten die systemisch worden toegediend in een gelijktijdige of opeenvolgende mode. Het idee van het maken van deze video is ontstaan ​​uit de late dr. Judah Folkman toen hij een bezoek bracht ons laboratorium en was getuige van de methodiek wordt gedemonstreerd. Overzichtsartikelen (uitgenodigd) bespreken en de beoordeling van de test Norrby, K. In vivo modellen van angiogenese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, K. Drug testen met angiogenese modellen. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

De angiogenese-assay in het mesenteriale venster van de volwassen rat is biologisch adequaat en is uitmuntend geschikt voor het bestuderen van uitlopende angiogenese in ...

Welkom bij de afdeling Pathologie van het GaN University Hospital in Guttenburg, Zweden. Ik ben Dr. Klaus Norby, en de methode die u nu gaat zien is ontwikkeld in mijn laboratorium. Klinisch relevante angiogenese, die optreedt in verband met hypoxie, solide tumoren of elke andere angiogenese-gerelateerde aandoening, vindt bijna uitsluitend plaats in van nature gevasculariseerd weefsel. Bij volwassen kleine knaagdieren bevat het mesenterium, dat de dunne darm met de achterwand van het lichaam verbindt, een aantal dunne vliezige delen. Bij ratten zijn er ongeveer 40 tot 50 van deze mesenteriale vensters. Ze zijn vrijwel transparant en lijken voor het blote oog daardoor op vensters; elk venster is bij volwassen mannelijke ratten omgeven door vetweefsel.De mesenteriale vensters zijn van nature gevasculariseerd en vertonen geen meetbare fysiologische angiogenese. Ze bieden daarom een mogelijkheid om de novo angiogenese te bestuderen in van nature gevasculariseerd mammalisch weefsel van volwassen dieren. Met andere woorden: het initiëren van een volledige angiogene respons vanaf nul, waarbij de angiogenese-remmers worden overwonnen die endogeen actief zijn in het testweefsel zoals in alle normale weefsels bij muizen. In veel vensters ontbreken natuurlijke microvaten die als ouder-microvaten kunnen fungeren, wat de assay in de oorspronkelijke vorm bij muizen helaas onvoorspelbaar maakt.De mesenteriale vensters bij ratten bevatten normaal gesproken een relatief klein aantal kleine bloedvaten die zich aan de periferie bevinden bij volwassen ratten. Deze mesenteriale vensters zijn van nature slechts vijf tot 10 micrometers dik. Hierdoor kan intact weefsel op objectglazen worden uitgespreid en microscopisch worden waargenomen, waardoor alle vaten in elk venster kunnen worden geobserveerd en de vaten in feite een tweedimensionale uitbreiding krijgen.De methode biedt een ongeëvenaarde mogelijkheid om kwantitatieve metingen te verrichten van de ruimtelijke uitbreiding, dichtheid, patroonvorming en grootte van de bloedmicrovaten. De subcutane locatie is populair voor angiogenese-studies; echter, vanwege de heterogeniteit van endotheelcellen en weefselspecifieke eigenschappen, is het mogelijk dat de controle van angiogenese in subcutaan weefsel en subcutaan groeiende tumoren geen voorspelling geeft voor de controle van angiogenese en metastasering in viscerale organen zoals de longen, lever, botten en hersenen. Dit is opmerkelijk aangezien viscerale metastasen gewoonlijk uiteindelijk verantwoordelijk zijn voor de letaliteit van kanker.Het feit dat het mesenteriale venster visceraal is, zou in dit opzicht voordelig moeten zijn. Het doel van ons project is om aspecten van de novo angiogenese kwantitatief te bestuderen. Daarom injecteren we een gevestigde pro-angiogene factor of een testsubstantie intraperitoneaal.Normaal gesproken injecteren we vijf milliliter per keer bij volwassen, niet-genarceerde ratten. Een volume van deze omvang stelt het volledige mesenterium snel bloot aan de geïnjecteerde vloeistof. Elke oplossing die intraperitoneaal wordt geïnjecteerd, mits het volume niet te gering is, zou alle cellen in het testweefsel moeten beïnvloeden, vooral omdat de mesotheliale cellaag die het uiterst dunne mesenteriale venster bedekt zeer permeabel is voor opgeloste stoffen. Aangezien er geen chirurgische ingreep aan te pas komt, wordt de angiogenese die in het mesenteriale venster wordt bestudeerd niet beïnvloed door wondgenezings-geïnduceerde angiogenese; daarom wordt de angiogene behandeling toegediend in de vorm van intraperitoneale injecties.Om praktische redenen gebruiken we een behandelprotocol dat bestaat uit twee dagelijkse injecties gedurende een periode van vijf dagen, van maandagochtend tot vrijdagochtend, zoals gebruikelijk bij het bestuderen van de angiogene effecten van gedefinieerde eiwitten zoals VEGF 1 65, 1 64 en basic FGF. Meestal wordt Pharmacia infusieoplossing als vehikel gebruikt. Het aantal behandelingen lijkt wellicht hoog, maar het is aangetoond dat het niet altijd mogelijk is om statistisch significante angiogenese op te wekken, zelfs bij het gebruik van zulke potente pro-angiogene factoren als VEGF en basic FGF, wanneer deze in een enkele dosis of enkele verspreide doses op ongeveer fysiologische niveaus worden toegediend; men moet er rekening mee houden dat er potente endogene angiogeneseremmers in het weefsel actief zijn.De toediening van therapeutische modaliteiten die de angiogenese moduleren, bootst een klinische therapeutische situatie na. Eén of meer angiogenese-modulerende factoren kunnen systemisch, subcutaan, intraveneus of oraal worden toegediend. Bijvoorbeeld.Dit bootst een klinische behandelingssituatie na, aangezien niet alleen het effect van het moedermolecuul, maar ook dat van de metabolieten bestudeerd kan worden. Het systeem maakt een zekere mate van controle mogelijk over de toxische effecten van systemisch toegediende angiogenese-modulerende middelen. Omdat volwassen ratten fysiologisch groeien en tijdens een experiment van twee of drie weken in gewicht kunnen toenemen met ongeveer 40%, is het door het wegen van de dieren mogelijk om inzicht te krijgen in de mate waarin de behandeling de toename van het lichaamsgewicht heeft vertraagd, wat kan worden beschouwd als een uiting van toxische effecten.Dit maakt toxische doses van angiogenese-modulerende tests mogelijk, welke substanties vermeden moeten worden. Dit is een belangrijk voordeel, aangezien het onmogelijk kan zijn om de resultaten te interpreteren in termen van specifieke anti-angiogene effecten. Indien er sprake is van een toxisch effect, en aangezien volwassen ratten aanzienlijk sneller groeien dan volwassen muizen, zou het effect van toxische middelen op de toename van het lichaamsgewicht een gevoeliger indicator zijn voor algemene toxische effecten bij ratten dan bij muizen.We willen u nu laten zien hoe preparaten van mesenteriale vensters worden gemaakt. Deze dieren zijn gedood met CO2. De mesenteriale vensters worden één voor één, beginnend bij het distale deel van het mesenterium, uitgespreid op gewone objectglazen van drie bij één inch.Angiogenese kan niet met het blote oog worden waargenomen in het mesenteriale venster, beginnend bij de ileocecale klep en bewegend in retrograde richting. Er worden vier vensters gebruikt die zijn verzameld uit het meest distale deel van het mesenterium. Het preparaat op het objectglas wordt 20 minuten lang gedroogd bij kamertemperatuur.De darmstomp wordt afgesneden. De monsters worden vervolgens bewaard in een vriezer bij -20 °C. Op deze manier kunnen de monsters gedurende enkele maanden, mogelijk zelfs jaren, bewaard worden zonder dat er sprake is van een uitgesproken verslechtering van de kwaliteit.De kleuring wordt uitgevoerd met een monoklonaal antilichaam tegen ratenendotheel. Laat het preparaat aan de lucht drogen; monteer het niet met een dekglas. De kwantificering van het aantal bloedvaten in individuele mesenteriale vensters wordt gedaan via computerondersteunde morfometrische microscopie met een tekenmicroscoop met een totale optische vergroting tussen 14 en 34. Het gehele mesenteriale venster wordt gevisualiseerd.De vergroting wordt in vaste stappen gekozen zodat het gezichtsveld zoveel mogelijk door het preparaat wordt gevuld. Het volledige oppervlak van het venster is eenvoudig in kaart te brengen, aangezien de grens tussen het venster en het omringende vetweefsel duidelijk is. Alle gevasculariseerde delen worden vervolgens getekend volgens zorgvuldig gedefinieerde criteria.Zelfs de kleinste nieuwgevormde bloedvaten, waarvan de diameter bij hogere vergrotingen is vastgesteld op ongeveer 2,5 tot 3,0 micrometers, kunnen duidelijk worden onderscheiden. Het feit dat de gemiddelde diameter van de erytrocyt van de rat gelijk is aan of groter is dan 6,3 micrometers, laat zien hoe klein deze vaten zijn. Het oppervlak van alle gevasculariseerde delen in een venster als percentage van het oppervlak van het gehele venster staat bekend als het relatieve gevasculariseerde oppervlak va.Het is in feite een meting van de ruimtelijke uitbreiding van de vaten, aangezien deze in essentie een tweedimensionale uitbreiding hebben; de VA kan bijvoorbeeld eenvoudig worden gemeten met behulp van computerondersteunde telemetrie. De volgende stap omvat het registreren van de dichtheid van de microvaten en de patroonvorming binnen drie centrale delen van de gevasculariseerde gebieden van elk venster. Deze delen worden systematisch willekeurig gekozen bij een optische vergroting van 80.Elk vat wordt gevisualiseerd als een enkele lijn met behulp van een tekenmicroscoop. Het beeld van elk gezichtsveld wordt overgebracht naar een gedigitaliseerd beeld en een beeldanalyser, waarna elk vat in het gedigitaliseerde beeld wordt gereduceerd tot een dikte van één pixel. De machine meet vervolgens het aantal pixels dat de vaten representeert, wat wordt uitgedrukt als een fractie van alle pixels in het gezichtsveld.Dit percentage, de microvasculaire lengte of MVL, vertegenwoordigt de lengte van de microvaten per eenheid van het gevasculariseerde gebied en is een samengestelde meting van de dichtheid van de microvaten. Door het VA-gemiddelde van vier vensters per dier te vermenigvuldigen met de gemiddelde MVL voor de overeenkomstige behandelgroep, wordt de totale microvasculaire lengte per dier, de TMVL, berekend. Daarnaast hebben we technieken ontwikkeld voor gedetailleerde kwantitatieve analyse van de dichtheid en compositie van microvaten met behulp van beeldanalyse.Hiervan maken deel het meten van de feitelijke afstand tussen twee opeenvolgende microvaten, vertakkingspunten, IE, de lengte van individuele microvaten, segmenten LEMS, het aantal microvaten, segmenten per eenheid weefselvolume, NOMS, en het aantal vertakkingspunten van microvaten per eenheid weefselvolume, NOBP. De graad van tortuositeit in de microvaten MVT wordt bepaald door het verschil tussen de kortste afstand en de feitelijke afstand tussen twee opeenvolgende vertakkingspunten, het voorkomen van kruisende microvaten, de intersectie-index INIS, en de vorming van onderling verbonden lussen. De lussvormingsindex INLF kan eveneens nauwkeurig worden gemeten met vergelijkbare technieken aan de periferie van het netwerk van microvaten.We zijn ook in staat om overeenkomstige variabelen voor uitlopers te kwantificeren, waaronder de lengte van de uitlopers, LESP, en het aantal uitlopers per eenheid weefselvolume, NOSP, door proeven zo te ontwerpen dat er rekening wordt gehouden met de aanzienlijke verschillen die kunnen optreden tussen dieren in dezelfde behandelgroep en zelfs tussen mesenteriale vensters in één en hetzelfde dier. We hebben vastgesteld dat het volgende ontwerp praktisch kan blijken: het aantal dieren per behandelgroep tijdens de observatieperiode, acht tot 12; het aantal vensters per dier dat wordt geanalyseerd op VA; het aantal gezichtsvelden voor elk venster dat wordt geanalyseerd op microvasculaire lengte, MVL; de lengte van microvasculaire segmenten, LEMS; het aantal microvasculaire segmenten, NOMS; het aantal microvasculaire vertakkingspunten, NOBP; de tortuositeit van microvaten, MVT; de intersectie-index, I; de index van lusvorming, INF. Drie dieren die met een vehikel zijn behandeld, dienen als controles. De assay voor angiogenese in het mesenteriale venster is zeer geschikt voor dosis-effectstudies en voor kinetische analyses van angiogenese.Dit kan worden gedaan door groepen dieren te behandelen met verschillende doses van een pro-angiogene factor en deze dieren op verschillende tijdstippen tijdens de angiogene respons te offeren. De expansieve fase, het hoogtepunt en de daaropvolgende angioregressieve fase kunnen hiermee in kwantitatieve termen worden onderscheiden. Studies van dit type hebben aangetoond dat de de novo angiogene respons op elke geteste groeifactor-cytokine specifiek dosisafhankelijk is wat betreft snelheid, potentie en duur.Bovendien is het patroon van de nieuwe vaten, wat betreft de ruimtelijke uitbreiding en veranderingen in de dichtheid van de microvaten, vaak duidelijk dosis- en tijdsafhankelijk in vergelijking met angiogenese die wordt gemedieerd door VEGF of basic FGF bij ongeveer fysiologische doses. Mastcel-gemedieerde angiogenese, MCMA, geïnduceerd via selectieve activering van mastcellen in situ, kenmerkt zich door een aanzienlijk hogere potentie en een merkbaar langere duur. In feite werd mastcel-gemedieerde angiogenese voor het eerst beschreven met behulp van deze assay vanwege de mogelijkheid om objectieve angiogenesevariabelen te kwantificeren, de hoge mate van biologische relevantie van het systeem en de mogelijkheid om te controleren op toxische behandeling.De methodologie is bij uitstek geschikt voor structure-activiteit- en dosis-responsanalyses. De rat-MWAA biedt een model voor het bestuderen van angiogenese in een adult, natuurlijk gevasculariseerd visceraal weefsel dat geen fysiologische angiogenese vertoont en dat niet wordt beïnvloed door chirurgie, waardoor elke invloed van door wondgenezing geïnduceerde angiogenese wordt uitgesloten. De assay is echt kwantitatief en beoordeelt nauwkeurig een aantal biologisch relevante objectieve variabelen die de ruimtelijke uitgebreidheid, dichtheid en patroonvorming van microvaten beschrijven.De assay is zeer geschikt voor het bestuderen van de systemische effecten van angiogenese, modulerende factoren, en voor structure-activiteit- en dosis-responsstudies. De hier beschreven methodologie is ontwikkeld in het laboratorium van Dr.Kloss Carl Norby bij de afdeling Pathologie van het Reka University Hospital, jute Borg University Gothenburg in Zweden. De Swedish Medical Research Council, projectnummer 5 9 4 2, heeft alle studies in dit project ondersteund.De bekwame technische assistentie van mevrouw Gun Effer, die vanaf het begin van het project betrokken was, mevrouw Monica Anderson, niet aanwezig, en mevrouw Ann Nemar Lindgren wordt dankbaar erkend.Ik hoop dat deze korte presentatie u een idee heeft gegeven van het potentieel van de assay. Mocht u deze assay in uw laboratorium gebruiken, dan help ik u graag verder indien u tegen technische problemen aanloopt. Bovendien zou ik elke suggestie die u heeft zeer op prijs stellen.Dank u wel.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont een model om de ontwikkeling van intima hyperplasie studeren na stent met behulp van een menselijk vat (IMA) in een immunodeficiënte rat model.

Human Interne borstslagader (IMA) Transplantatie en stenting: een humaan model aan de ontwikkeling van in-stent restenose Studie

Dit artikel beschrijft een eenvoudig model voor het stimuleren angiogenese in de rat mesenterium. Het model produceert dramatische toename in capillaire kiemen, vasculaire gebied en vasculaire dichtheid over een relatief korte tijd cursus in een weefsel die het mogelijk maakt en face visualisatie van hele microvasculaire netwerken tot in de enkele cel niveau.

Rat mesenterium uittreding: een model voor het onderzoeken van de Cellular Dynamics betrokken bij het Angiogenese

De gemodificeerde Landis-techniek maakt gepaarde meting mogelijk van de hydraulische geleidbaarheid van individuele microvaten in de mesenterium van normale en genetisch gemodificeerde ratten onder controle- en testomstandigheden met behulp van microperfusietechnieken. Het biedt een handige methode om mechanismen te evalueren die de doorlaatbaarheid van microvaten en transvasculair uitwisseling onder fysiologische omstandigheden reguleren.

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Dit manuscript beschrijft een buisvormingstest om de effecten van een bepaalde verbinding of omstandigheid op angiogenesis te kwantificeren door gebruik te maken van de vorming van endotheelcellen in een gecontroleerde omgeving.

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Angiogenese omvat interacties tussen meerdere cellen en systemen die onderzocht moeten worden in een fysiologisch relevante omgeving. Het doel van deze studie is om de capaciteit van het kweekmodel van de rat mesenterium te demonstreren om tijdsverloopvergelijkingen van intacte microvasculaire netwerken tijdens angiogenesis te maken.

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Hier presenteren we een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring waar prelabelled mesenchymale cellen zijn mede gekweekte met rat aorta afkomstige endothelial netwerken. Deze nieuwe methode kunt visualisatie van mesenchymale stromale cellen (MSCs) homing en integratie met endothelial netwerken, kwantificering van netwerkeigenschappen en evaluatie van MSC immunophenotypes en gen-expressie.

De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro

miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.

Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese

We beschrijven twee methoden voor het beoordelen van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit geassocieerd met tumor micro omgeving van metastasen (tmem) deuropening functie en kankercel intravasatie met behulp van intraveneuze injectie van hoog-moleculair gewicht (155 kDa) dextran bij muizen. De methoden omvatten intravital beeldvorming in levende dieren en vaste weefsel analyse met behulp van immunofluorescentie.

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

Hier tonen we therapeutisch potentieel van Anti-angiogene tumor-geassocieerde neutrofielen na hun overdracht in tumor-dragende muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de neutrofiele activiteit ex vivo te manipuleren en vervolgens hun functionaliteit in vivo te evalueren bij het ontwikkelen van tumoren. Het is een geschikt model voor het bestuderen van potentiële op neutrofielen gebaseerde immunotherapieën.

Overdracht van gemanipuleerde tumor-geassocieerde neutrofielen in tumor-dragende muizen om hun angiogene potentiaal in vivo te bestuderen

De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.

Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies

Het huidige protocol maakt het herstel mogelijk van buisachtige structuren die zijn gevormd in de klassieke in vitro angiogenese-buisvormingstest waarbij cellen, zoals trofoblastcellen, zich organiseren in capillaire structuren over een laag extracellulaire basaalmembraanmatrix. De teruggevonden structuren worden gebruikt voor RNA- en eiwitisolatie voor verschillende biochemische analyses.

Trofoblastcelherstel van angiogenese-buisvormingstest voor analyse van differentiatiemarkerexpressie

Leer hoe u de novo angiogenese kwantitatief bestudeert in rattenmesenteriumvensters. Deze methode maakt nauwkeurige metingen van bloedvatdichtheid en patroonvorming mogelijk voor kankeronderzoek.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

Meer video's verkennen