Rat mesenterium Angiogenese Assay

Welkom bij de afdeling Pathologie van het GaN University Hospital in Guttenburg, Zweden. Ik ben Dr. Klaus Norby, en de methode die u nu gaat zien is ontwikkeld in mijn laboratorium. Klinisch relevante angiogenese, die optreedt in verband met hypoxie, solide tumoren of elke andere angiogenese-gerelateerde aandoening, vindt bijna uitsluitend plaats in van nature gevasculariseerd weefsel. Bij volwassen kleine knaagdieren bevat het mesenterium, dat de dunne darm met de achterwand van het lichaam verbindt, een aantal dunne vliezige delen. Bij ratten zijn er ongeveer 40 tot 50 van deze mesenteriale vensters. Ze zijn vrijwel transparant en lijken voor het blote oog daardoor op vensters; elk venster is bij volwassen mannelijke ratten omgeven door vetweefsel.

De mesenteriale vensters zijn van nature gevasculariseerd en vertonen geen meetbare fysiologische angiogenese. Ze bieden daarom een mogelijkheid om de novo angiogenese te bestuderen in van nature gevasculariseerd mammalisch weefsel van volwassen dieren. Met andere woorden: het initiëren van een volledige angiogene respons vanaf nul, waarbij de angiogenese-remmers worden overwonnen die endogeen actief zijn in het testweefsel zoals in alle normale weefsels bij muizen. In veel vensters ontbreken natuurlijke microvaten die als ouder-microvaten kunnen fungeren, wat de assay in de oorspronkelijke vorm bij muizen helaas onvoorspelbaar maakt.

De mesenteriale vensters bij ratten bevatten normaal gesproken een relatief klein aantal kleine bloedvaten die zich aan de periferie bevinden bij volwassen ratten. Deze mesenteriale vensters zijn van nature slechts vijf tot 10 micrometers dik. Hierdoor kan intact weefsel op objectglazen worden uitgespreid en microscopisch worden waargenomen, waardoor alle vaten in elk venster kunnen worden geobserveerd en de vaten in feite een tweedimensionale uitbreiding krijgen.

De methode biedt een ongeëvenaarde mogelijkheid om kwantitatieve metingen te verrichten van de ruimtelijke uitbreiding, dichtheid, patroonvorming en grootte van de bloedmicrovaten. De subcutane locatie is populair voor angiogenese-studies; echter, vanwege de heterogeniteit van endotheelcellen en weefselspecifieke eigenschappen, is het mogelijk dat de controle van angiogenese in subcutaan weefsel en subcutaan groeiende tumoren geen voorspelling geeft voor de controle van angiogenese en metastasering in viscerale organen zoals de longen, lever, botten en hersenen. Dit is opmerkelijk aangezien viscerale metastasen gewoonlijk uiteindelijk verantwoordelijk zijn voor de letaliteit van kanker.

Het feit dat het mesenteriale venster visceraal is, zou in dit opzicht voordelig moeten zijn. Het doel van ons project is om aspecten van de novo angiogenese kwantitatief te bestuderen. Daarom injecteren we een gevestigde pro-angiogene factor of een testsubstantie intraperitoneaal.

Normaal gesproken injecteren we vijf milliliter per keer bij volwassen, niet-genarceerde ratten. Een volume van deze omvang stelt het volledige mesenterium snel bloot aan de geïnjecteerde vloeistof. Elke oplossing die intraperitoneaal wordt geïnjecteerd, mits het volume niet te gering is, zou alle cellen in het testweefsel moeten beïnvloeden, vooral omdat de mesotheliale cellaag die het uiterst dunne mesenteriale venster bedekt zeer permeabel is voor opgeloste stoffen. Aangezien er geen chirurgische ingreep aan te pas komt, wordt de angiogenese die in het mesenteriale venster wordt bestudeerd niet beïnvloed door wondgenezings-geïnduceerde angiogenese; daarom wordt de angiogene behandeling toegediend in de vorm van intraperitoneale injecties.

Om praktische redenen gebruiken we een behandelprotocol dat bestaat uit twee dagelijkse injecties gedurende een periode van vijf dagen, van maandagochtend tot vrijdagochtend, zoals gebruikelijk bij het bestuderen van de angiogene effecten van gedefinieerde eiwitten zoals VEGF 1 65, 1 64 en basic FGF. Meestal wordt Pharmacia infusieoplossing als vehikel gebruikt. Het aantal behandelingen lijkt wellicht hoog, maar het is aangetoond dat het niet altijd mogelijk is om statistisch significante angiogenese op te wekken, zelfs bij het gebruik van zulke potente pro-angiogene factoren als VEGF en basic FGF, wanneer deze in een enkele dosis of enkele verspreide doses op ongeveer fysiologische niveaus worden toegediend; men moet er rekening mee houden dat er potente endogene angiogeneseremmers in het weefsel actief zijn.

De toediening van therapeutische modaliteiten die de angiogenese moduleren, bootst een klinische therapeutische situatie na. Eén of meer angiogenese-modulerende factoren kunnen systemisch, subcutaan, intraveneus of oraal worden toegediend. Bijvoorbeeld.

Dit bootst een klinische behandelingssituatie na, aangezien niet alleen het effect van het moedermolecuul, maar ook dat van de metabolieten bestudeerd kan worden. Het systeem maakt een zekere mate van controle mogelijk over de toxische effecten van systemisch toegediende angiogenese-modulerende middelen. Omdat volwassen ratten fysiologisch groeien en tijdens een experiment van twee of drie weken in gewicht kunnen toenemen met ongeveer 40%, is het door het wegen van de dieren mogelijk om inzicht te krijgen in de mate waarin de behandeling de toename van het lichaamsgewicht heeft vertraagd, wat kan worden beschouwd als een uiting van toxische effecten.

Dit maakt toxische doses van angiogenese-modulerende tests mogelijk, welke substanties vermeden moeten worden. Dit is een belangrijk voordeel, aangezien het onmogelijk kan zijn om de resultaten te interpreteren in termen van specifieke anti-angiogene effecten. Indien er sprake is van een toxisch effect, en aangezien volwassen ratten aanzienlijk sneller groeien dan volwassen muizen, zou het effect van toxische middelen op de toename van het lichaamsgewicht een gevoeliger indicator zijn voor algemene toxische effecten bij ratten dan bij muizen.

We willen u nu laten zien hoe preparaten van mesenteriale vensters worden gemaakt. Deze dieren zijn gedood met CO2. De mesenteriale vensters worden één voor één, beginnend bij het distale deel van het mesenterium, uitgespreid op gewone objectglazen van drie bij één inch.

Angiogenese kan niet met het blote oog worden waargenomen in het mesenteriale venster, beginnend bij de ileocecale klep en bewegend in retrograde richting. Er worden vier vensters gebruikt die zijn verzameld uit het meest distale deel van het mesenterium. Het preparaat op het objectglas wordt 20 minuten lang gedroogd bij kamertemperatuur.

De darmstomp wordt afgesneden. De monsters worden vervolgens bewaard in een vriezer bij -20 °C. Op deze manier kunnen de monsters gedurende enkele maanden, mogelijk zelfs jaren, bewaard worden zonder dat er sprake is van een uitgesproken verslechtering van de kwaliteit.

De kleuring wordt uitgevoerd met een monoklonaal antilichaam tegen ratenendotheel. Laat het preparaat aan de lucht drogen; monteer het niet met een dekglas. De kwantificering van het aantal bloedvaten in individuele mesenteriale vensters wordt gedaan via computerondersteunde morfometrische microscopie met een tekenmicroscoop met een totale optische vergroting tussen 14 en 34. Het gehele mesenteriale venster wordt gevisualiseerd.

De vergroting wordt in vaste stappen gekozen zodat het gezichtsveld zoveel mogelijk door het preparaat wordt gevuld. Het volledige oppervlak van het venster is eenvoudig in kaart te brengen, aangezien de grens tussen het venster en het omringende vetweefsel duidelijk is. Alle gevasculariseerde delen worden vervolgens getekend volgens zorgvuldig gedefinieerde criteria.

Zelfs de kleinste nieuwgevormde bloedvaten, waarvan de diameter bij hogere vergrotingen is vastgesteld op ongeveer 2,5 tot 3,0 micrometers, kunnen duidelijk worden onderscheiden. Het feit dat de gemiddelde diameter van de erytrocyt van de rat gelijk is aan of groter is dan 6,3 micrometers, laat zien hoe klein deze vaten zijn. Het oppervlak van alle gevasculariseerde delen in een venster als percentage van het oppervlak van het gehele venster staat bekend als het relatieve gevasculariseerde oppervlak va.

Het is in feite een meting van de ruimtelijke uitbreiding van de vaten, aangezien deze in essentie een tweedimensionale uitbreiding hebben; de VA kan bijvoorbeeld eenvoudig worden gemeten met behulp van computerondersteunde telemetrie. De volgende stap omvat het registreren van de dichtheid van de microvaten en de patroonvorming binnen drie centrale delen van de gevasculariseerde gebieden van elk venster. Deze delen worden systematisch willekeurig gekozen bij een optische vergroting van 80.

Elk vat wordt gevisualiseerd als een enkele lijn met behulp van een tekenmicroscoop. Het beeld van elk gezichtsveld wordt overgebracht naar een gedigitaliseerd beeld en een beeldanalyser, waarna elk vat in het gedigitaliseerde beeld wordt gereduceerd tot een dikte van één pixel. De machine meet vervolgens het aantal pixels dat de vaten representeert, wat wordt uitgedrukt als een fractie van alle pixels in het gezichtsveld.

Dit percentage, de microvasculaire lengte of MVL, vertegenwoordigt de lengte van de microvaten per eenheid van het gevasculariseerde gebied en is een samengestelde meting van de dichtheid van de microvaten. Door het VA-gemiddelde van vier vensters per dier te vermenigvuldigen met de gemiddelde MVL voor de overeenkomstige behandelgroep, wordt de totale microvasculaire lengte per dier, de TMVL, berekend. Daarnaast hebben we technieken ontwikkeld voor gedetailleerde kwantitatieve analyse van de dichtheid en compositie van microvaten met behulp van beeldanalyse.

Hiervan maken deel het meten van de feitelijke afstand tussen twee opeenvolgende microvaten, vertakkingspunten, IE, de lengte van individuele microvaten, segmenten LEMS, het aantal microvaten, segmenten per eenheid weefselvolume, NOMS, en het aantal vertakkingspunten van microvaten per eenheid weefselvolume, NOBP. De graad van tortuositeit in de microvaten MVT wordt bepaald door het verschil tussen de kortste afstand en de feitelijke afstand tussen twee opeenvolgende vertakkingspunten, het voorkomen van kruisende microvaten, de intersectie-index INIS, en de vorming van onderling verbonden lussen. De lussvormingsindex INLF kan eveneens nauwkeurig worden gemeten met vergelijkbare technieken aan de periferie van het netwerk van microvaten.

We zijn ook in staat om overeenkomstige variabelen voor uitlopers te kwantificeren, waaronder de lengte van de uitlopers, LESP, en het aantal uitlopers per eenheid weefselvolume, NOSP, door proeven zo te ontwerpen dat er rekening wordt gehouden met de aanzienlijke verschillen die kunnen optreden tussen dieren in dezelfde behandelgroep en zelfs tussen mesenteriale vensters in één en hetzelfde dier. We hebben vastgesteld dat het volgende ontwerp praktisch kan blijken: het aantal dieren per behandelgroep tijdens de observatieperiode, acht tot 12; het aantal vensters per dier dat wordt geanalyseerd op VA; het aantal gezichtsvelden voor elk venster dat wordt geanalyseerd op microvasculaire lengte, MVL; de lengte van microvasculaire segmenten, LEMS; het aantal microvasculaire segmenten, NOMS; het aantal microvasculaire vertakkingspunten, NOBP; de tortuositeit van microvaten, MVT; de intersectie-index, I; de index van lusvorming, INF. Drie dieren die met een vehikel zijn behandeld, dienen als controles. De assay voor angiogenese in het mesenteriale venster is zeer geschikt voor dosis-effectstudies en voor kinetische analyses van angiogenese.

Dit kan worden gedaan door groepen dieren te behandelen met verschillende doses van een pro-angiogene factor en deze dieren op verschillende tijdstippen tijdens de angiogene respons te offeren. De expansieve fase, het hoogtepunt en de daaropvolgende angioregressieve fase kunnen hiermee in kwantitatieve termen worden onderscheiden. Studies van dit type hebben aangetoond dat de de novo angiogene respons op elke geteste groeifactor-cytokine specifiek dosisafhankelijk is wat betreft snelheid, potentie en duur.

Bovendien is het patroon van de nieuwe vaten, wat betreft de ruimtelijke uitbreiding en veranderingen in de dichtheid van de microvaten, vaak duidelijk dosis- en tijdsafhankelijk in vergelijking met angiogenese die wordt gemedieerd door VEGF of basic FGF bij ongeveer fysiologische doses. Mastcel-gemedieerde angiogenese, MCMA, geïnduceerd via selectieve activering van mastcellen in situ, kenmerkt zich door een aanzienlijk hogere potentie en een merkbaar langere duur. In feite werd mastcel-gemedieerde angiogenese voor het eerst beschreven met behulp van deze assay vanwege de mogelijkheid om objectieve angiogenesevariabelen te kwantificeren, de hoge mate van biologische relevantie van het systeem en de mogelijkheid om te controleren op toxische behandeling.

De methodologie is bij uitstek geschikt voor structure-activiteit- en dosis-responsanalyses. De rat-MWAA biedt een model voor het bestuderen van angiogenese in een adult, natuurlijk gevasculariseerd visceraal weefsel dat geen fysiologische angiogenese vertoont en dat niet wordt beïnvloed door chirurgie, waardoor elke invloed van door wondgenezing geïnduceerde angiogenese wordt uitgesloten. De assay is echt kwantitatief en beoordeelt nauwkeurig een aantal biologisch relevante objectieve variabelen die de ruimtelijke uitgebreidheid, dichtheid en patroonvorming van microvaten beschrijven.

De assay is zeer geschikt voor het bestuderen van de systemische effecten van angiogenese, modulerende factoren, en voor structure-activiteit- en dosis-responsstudies. De hier beschreven methodologie is ontwikkeld in het laboratorium van Dr.Kloss Carl Norby bij de afdeling Pathologie van het Reka University Hospital, jute Borg University Gothenburg in Zweden. De Swedish Medical Research Council, projectnummer 5 9 4 2, heeft alle studies in dit project ondersteund.

De bekwame technische assistentie van mevrouw Gun Effer, die vanaf het begin van het project betrokken was, mevrouw Monica Anderson, niet aanwezig, en mevrouw Ann Nemar Lindgren wordt dankbaar erkend.

Ik hoop dat deze korte presentatie u een idee heeft gegeven van het potentieel van de assay. Mocht u deze assay in uw laboratorium gebruiken, dan help ik u graag verder indien u tegen technische problemen aanloopt. Bovendien zou ik elke suggestie die u heeft zeer op prijs stellen.

Dank u wel.