Name: Immunohistochemie: Paraffinecoupes Met behulp van de Vectastain ABC Kit van Vector Labs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 38 s
Description: Leer immunohistochemie op paraffinecoupe met de Vectastain ABC Kit. Dit protocol omvat ontwaxen, hydrateren, antigeenretrieval en antilichaamincubatie voor betrouwbare weefselkleuring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kleuring van paraffine secties <ol><li> Dewax dia&#39;s met xyleen (Fisher X3 S -4) 3x gedurende 5 minuten elk (verandering xyleen elke maand afhankelijk van het gebruik, xyleen is giftig). Gebruik gerechten en covers voor 20 dia&#39;s van Fisher ref 08-812-1A en rekken gemaakt om deze gerechten te passen. 200 ml vloeistof per schotel. </li><li> Hydrate door alcohol gradiënt als volgt uit (wijzigingen gradiënt om de 2 weken): <ul><li> 2x in 100% ethanol (Fisher # A406-20) gedurende 2 minuten per </li><li> 2x in 95% ethanol gedurende 2 minuten per </li><li> 1x in 70% ethanol gedurende 2 minuten </li><li> 1x in 50% ethanol gedurende 2 minuten </li><li> 1x in 30% ethanol gedurende 2 minuten </li><li> 1x DDH 2 O gedurende 2 minuten </li></ul></li><li> Dompel onder in DPBS gedurende 5 minuten (DPBS = gewijzigd fosfaat Dulbecco&#39;s gebufferde zoutoplossing met Ca 2 + en Mg 2 +). </li></ol> Antigen herstel: <ol><li> Verwarm de Na-citraat buffer (10 mM, pH 6,5) in de magnetron. </li><li> Kook de dia&#39;s voor 15 min in de magnetron. De dia&#39;s mogen nooit droog dus check iedere minuut en voeg Na-Citraat wanneer dat nodig is. </li><li> Laat afkoelen op kamertemperatuur. </li><li> Block endogene peroxidase-activiteit met 1% H 2 O 2 in DPBS gedurende 20 min (1,5 ml van 30% aandelen Sigma H-1009 in 50 ml DPBS). </li><li> Dompel onder in DPBS 3 x 5 minuten. </li><li> Blokkeer niet-specifieke sites door incubatie overnacht bij +4 ° C in DPBS + 5% bovine serum albumine (BSA) + 0,1% Na Azide + 5% serum. Let op: Keuze van serum zal afhangen van de soorten waarbij antilichamen gebruikt voor het kleuren werden gemaakt. Blok met serum van de soorten waarbij de secundaire Ab (geconjugeerd aan biotine) werd gemaakt. Als dit niet beschikbaar is, gebruik serum van een andere soort dan van de een, waarin de primaire Ab werd gemaakt. </li><li> Blokkeer de biotine sites met de avidine / biotine blokkeren kit (Vector laboratoria catalogus # SP-2001): <ul><li> Incubeer met avidine D gedurende 15 minuten. Spoel kort met DPBS. </li><li> Incubeer met de biotine-oplossing gedurende 15 minuten. </li></ul></li><li> Incubeer in het primair Ab gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, in DPBS + 2% BSA + 0,1% NaAzide + 2% serum (dezelfde als voor het blokkeren van stap). </li><li> Soak in PBS 3 x 5 minuten. </li><li> Incubeer met de secundaire Ab geconjugeerd met biotine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in DPBS + 2% BSA + 0,1% Na Azide + 2% serum (zelfde als gebruikt voor het blokkeren stap). </li><li> Bereid ABC reagens op hetzelfde moment, omdat het te ontwikkelen voor ten minste 30 minuten voor gebruik! (Zie ook Materiaal) </li><li> Bereid in een 50 ml conische buis. In 15 ml DPBS (geen serum, geen azide) voeg 3 druppels reagens A, mix en voeg 3 druppels reagens B en meng. Vermijd knijpen de flessen, in plaats van wachten tot de druppels te vormen op hun eigen. ABC kit Vectastain PK-6100 van Vector Labs. </li><li> Dompel onder in DPBS 3 x 5 minuten. </li><li> Incubeer met ABC reagens voor 30-45 min bij kamertemperatuur. </li><li> Dompel onder in DPBS 3 x 5 minuten. </li><li> Bereid DAB peroxidase substraat (Vector Labs # SK-4100) in 5 ml DDH 2 O in een glazen flacon onmiddellijk vóór gebruik (zie ook Materiaal) <ul><li> 2 druppels buffervoorraad oplossing, mengen </li><li> 4 druppels van DAB, mix (zou moeten worden een beetje bruin) </li><li> 2 druppels H 2 O 2, mix </li></ul></li><li> Drop de DAB substraat op de top van de dia&#39;s en let op bruine vlekken. </li><li> Dompel dia&#39;s in ijs + leidingwater om de reactie te stoppen. </li><li> Afspoelen onder koud leidingwater gedurende 5 minuten. </li><li> Tegenkleuring met hematoxyline (20 sec; Fisher CS401-D) en spoelen in leidingwater totdat er water uit te wissen. </li><li> Uitdrogen door alcohol gradiënt te beginnen bij 30% ethanol tot 100% ethanol (2 min. elk). </li><li> Soak in xyleen 3 x 5 minuten. </li><li> Mount met Permount (Fisher # SP15-100): zet een aantal boven het gedeelte op de dia en druk op langzaam op de afdeling met een dekglaasje zonder luchtbellen. Beweeg niet het dekglaasje tot het volledig droog, dat duurt ~ 24 uur. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Vervang xyleen elke maand, afhankelijk van het gebruik. Xyleen is GIFTIG.</td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Gebruik voor het maken van een EtOH-gradiënt.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td></td><td></td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s gemodificeerde fosfaatgebufferde zoutoplossing MET Ca2+ en Mg2+</td></tr><tr><td>Na-citraatbuffer</td><td></td><td></td><td>10 mM, pH 6.5</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1009</td><td>30% voorraad =&amp;gt; Verdun tot 1% in DPBS</td></tr><tr><td>Blokkeeroplossing</td><td></td><td></td><td>DPBS + 5% runder-serumalbumine (BSA) + 0.1% Na-azide + 5% serum.</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumazide</td><td></td><td></td><td>NaAzide</td></tr><tr><td>avidin/biotine blokkeerkit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ab-buffer</td><td></td><td></td><td>DPBS + 2% BSA + 0.1% Na-azide + 2% serum (hetzelfde als gebruikt voor de blokkeerstap)</td></tr><tr><td>ABC-kit Vectastain PK-6100</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB-peroxidasubstraat</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-D</td><td>tegenkleuring</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Objectglazen en dekglasjes</td><td></td><td></td><td>glas</td></tr></tbody></table>

immunohistochemie: paraffinecoupes met behulp van de vectastain abc kit van vector labs

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemie (IHC) is een waardevolle techniek gebruikt om te lokaliseren / eiwit expressie te visualiseren in een gemonteerde weefselsectie met behulp van specifieke antilichamen. Er zijn twee methoden: de directe en indirecte methode. In dit experiment zullen we alleen maar beschrijven het gebruik van indirecte IHC kleuring. Indirecte IHC kleuring maakt gebruik van zeer specifieke primaire en biotine-geconjugeerd secundair antilichamen. Primaire antilichamen worden gebruikt om discreet eiwitten van belang te identificeren door te binden aan een specifiek epitoop, terwijl de secundaire antilichamen af ​​te trekken voor niet-specifieke achtergrond kleuring en versterken het signaal door het vormen van complexen aan de primaire antilichaam. Dia&#39;s kunnen worden gegenereerd op basis van vriescoupes of paraffine ingebedde coupes gemonteerd op glasplaatjes. In dit protocol, bespreken we de voorbereiding van de paraffine ingebedde coupes door het verwijderen, hydratatie met behulp van een gradiënt van alcohol, warmte geïnduceerde antigen retrieval, en het blokkeren van endogene peroxidase activiteit en niet-specifieke bindingsplaatsen. Sommige delen worden vervolgens gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor T-cel marker CD8 en terwijl anderen zijn gekleurd voor tyrosine hydroxylase. De dia&#39;s worden vervolgens behandeld met de juiste secundaire antilichamen geconjugeerd aan biotine, ontwikkelde vervolgens gebruik te maken van avidine-geconjugeerd mierikswortelperoxidase (HRP) met Diaminiobenzidine (DAB) als substraat. Na ontwikkeling worden de dia&#39;s tegengekleurd voor contrast, en gemonteerd onder dekglaasjes met Permount. Na voldoende droging, zijn deze dia&#39;s zijn dan klaar voor de beeldvorming.

Immunohistochemie: Paraffinecoupes Met behulp van de Vectastain ABC Kit van Vector Labs

Immunohistochemie (IHC) is een waardevolle techniek die wordt gebruikt om eiwitexpressie in een gemonteerde weefselcoupe te lokaliseren/visualiseren met behulp van specifieke ...

Hallo, ik ben Victor Chi en ik ben een promovendus in het Chandy Lab van de afdeling Fysiologie en Biofysica aan de University of California Irvine. Vandaag ga ik demonstreren hoe u paraffine-ingebedde coupes kunt kleuren met behulp van de A b, C kit van Vector Laboratories. Deze procedure omvat het ontparaffineren en hydrateren van paraffine-ingebedde coupes, het uitvoeren van hitte-geïnduceerde antigeen-retrieval om antigenen vrij te maken, het blokkeren van peroxidase en aspecifieke eiwitbinding, het incuberen met CD four en tyrosinehydroxylase en secundaire antilichamen, en het ontwikkelen en monteren van de objectglas.Laten we beginnen. Omdat de coupes in paraffine zijn ingebed, is de eerste stap het ontwaxen van de slides. Dit gebeurt gewoonlijk in een zuurkast met drie potten xyleen, waarbij drie wasbeurten van elk vijf minuten worden uitgevoerd.De coupes worden vervolgens in honderd procent ethanol geplaatst. U zult merken dat de was op de coupes is verdwenen, maar wees voorzichtig en hanteer de coupes niet met handschoenen, omdat het xyleen het rubber van de handschoenen oplost. Vervolgens brengt u de coupes in de honderd procent ethanol terug naar het laboratorium, waar ze een hydratatiegradiënt zullen ondergaan.Ik zal u nu informeren over de hydratatiegradiënt waar we de coupes doorheen zullen brengen. Dit begint eerst met twee baden van 100% ethanol. Vervolgens brengen we de coupes over naar twee baden bestaande uit 95% ethanol.Vervolgens brengen we de preparaten over naar een bad met 70% ethanol, en van daaruit brengen we de preparaten over naar een bad met 50% ethanol. Daarna brengen we de preparaten over naar 30% ethanol, en twee minuten later brengen we de preparaten over naar dubbel gedestilleerd water. Na de behandeling met dubbel gedestilleerd water laten we de preparaten in PBS rusten.Ik ga u nu laten zien hoe u de objectglazen in de houders van het ene bad naar het volgende verplaatst. De eerste stap is om de objectglazen met de houder te verwijderen en ze voorzichtig af te schrapen om overtollige vloeistof te verwijderen, zodat u niet te veel vloeistof meeneemt naar het volgende bad. Dompel ze daarna onder en wacht twee minuten tot de volgende gradiëntwijziging.Vaak raakt het antigeen gemaskeerd wanneer weefsels worden gefixeerd, waardoor het antilichaam er niet meer aan kan binden. Daarom zal ik u nu een methode laten zien voor hitte-geïnduceerde antigeenherstel met behulp van natriumcitraat. We staan nu bij de magnetron, waar ik mijn CD8-antigeen zal ontmaskeren, dat ik vervolgens via immunohistochemie zal proberen aan te tonen.Vervolgens voeg ik mijn oplossing toe en verhit ik deze 15 minuten in de magnetron. We koken het natriumcitraat samen met onze coupes gedurende 15 minuten om te voorkomen dat de coupes uitdrogen. We houden de coupes in de gaten, zodat we bij overkoken opnieuw natriumcitraat kunnen bijvullen om te garanderen dat de coupes gehydrateerd blijven.Voordat ik mijn objectglaasjes in het natriumcitraat plaats, heb ik mijn oplossing al 45 seconden voorverwarmd. Vervolgens heb ik de objectglaasjes in het natriumcitraat geplaatst en nu verhit ik het natriumcitraat gedurende 15 minuten. Terwijl de objectglaasjes erin zitten, zal de oplossing meestal na ongeveer twee tot twee en een halve minuut van het kookproces beginnen over te koken.Op dat punt stop ik en vervang ik het verloren gegane natriumcitraat door vers natriumcitraat. Nadat het natriumcitraat 15 minuten heeft gekookt, willen we de coupes en de oplossing verwijderen en afkoelen. De beste manier om dit te doen is door de coupeshouder af te sluiten, het overtollige vloeistof af te gieten en het geheel onder een straal koud water te houden totdat de oplossing in de pot is afgekoeld tot kamertemperatuur.Dit duurt gewoonlijk ongeveer 10 tot 15 minuten. Nadat we de coupes uit het bad hebben gehaald, moeten we de endogene peroxidase-activiteit in de weefsels blokkeren. Hiervoor maken we een waterstofperoxide-oplossing door 30% waterstofperoxide te gebruiken om een 1% waterstofperoxide-oplossing te bereiden.Vanaf dit punt breng ik de objectglazen direct over naar de waterstofperoxide-oplossing. We laten de objectglazen nu 20 minuten incuberen in de waterstofperoxide. Nadat er 20 minuten zijn verstreken en de endogene peroxidase is geblokkeerd, zal ik de waterstofperoxide van de objectglazen afwassen met spoelingen van PBS.Ik zal nu de objectglazen naar de houder overbrengen en deze wassen met drie wasbeurten van elk vijf minuten. Deze objectglazen zijn rug-aan-rug geplaatst om contact met andere objectglazen te vermijden, wat het weefsel zou kunnen beschadigen. Ik schuif de objectglazen simpelweg weg en rangschik ze zodanig dat het weefsel geen mogelijkheid heeft om het glas te raken.Vervolgens brengen we de coupes over naar PBS. Na het wassen van de coupes met PBS, ga ik de coupes nu blokkeren tegen aspecifieke binding van eiwitten met een oplossing van 5% BSA, 5% geiten serum en 0,1% natriumazide. Indien u werkt met geitenantilichamen, dient u het geitenserum te vervangen door dat van een andere soort.Ik ga nu de objectglazen in onze houder plaatsen en deze vullen met onze oplossing. Normaal gesproken vul ik de houder tot de helft, zodat het volume van de objectglazen ervoor zorgt dat de weefsels volledig ondergedompeld zijn. Let er bij het plaatsen van de objectglazen in de houder op dat het weefsel de wanden van de houder niet raakt.Draai de laatste coupes dus naar binnen zodat het weefsel de container niet raakt. Nu de coupes een nacht zijn geblokkeerd, spoel ik het overtollige blokkeringsmedium weg met drie wasbeurten van vijf minuten in PBS. Op dit punt tekenen we met een vloeibare blocker een cirkel rond ons weefsel om de hoeveelheid te gebruiken antilichaam te minimaliseren.Als u zich geen zorgen maakt over het besparen van antilichamen, kunt u de objectglazen altijd incuberen in dezelfde bakjes waarin de blokkeringsstap is uitgevoerd. Vanaf dit punt laat ik u zien hoe we met vloeibare blokker rondom ons weefsel tekenen. Eerst verwijderen we het overtollige bloed en de vloeistof, waarbij we er voorzichtig op letten het weefsel niet aan te raken.Veeg vervolgens rond de hoeken om overtollige vloeistof te verwijderen. Wees hierbij opnieuw zeer voorzichtig om het weefsel niet aan te raken. Neem de blokkeerpin voor de vloeistof, druk deze voorzichtig in om de stroom op gang te brengen, en omcirkel vanaf dat punt het weefsel met uw pen.Laat de vloeibare blokker ongeveer 15 seconden drogen. Op dit punt voegen we het primaire antilichaam toe. Gebruik een pipette om het weefsel volledig te bedekken met het primaire antilichaam en plaats het vervolgens in de vochtgecontroleerde bewaardoos.Hiervoor gebruiken we een Kim wipe, bevochtigd met wat gedestilleerd water in deze bak om te voorkomen dat het objectglas uitdroogt terwijl het wordt geïncubeerd met het primaire antilichaam. Nu het primaire antilichaam een uur heeft geïncubeerd, halen we de objectglazen eruit en wassen we het overtollige antilichaam af met PBS.Laat de vloeistof dus opnieuw simpelweg weglopen en plaats het monster in de PBS-wasoplossing. Was opnieuw drie keer gedurende vijf minuten. Na deze drie wasbeurten van vijf minuten voegen we de secundaire antilichamen toe aan het weefsel op dezelfde manier als we de primaire antilichamen hebben toegevoegd.Voeg uw secundaire antilichaam toe — in dit geval gebruiken we geit anti-konijn — met een volume dat voldoende is om de weefsels te bedekken, en plaats de slide terug in de kamer met gecontroleerde vochtigheid. We gebruiken een secundair antilichaam, namelijk gebiotinyleerd geit anti-konijn, wat essentieel is bij het gebruik van de ABC-methode. We plaatsen de slide in de kamer met gecontroleerde vochtigheid en laten deze één uur incuberen.Terwijl het secundaire antilichaam incorporeert, moeten we het ABC-reagens klaarmaken. We gebruiken hiervoor het ABC-reagens van Vector Laboratories uit de VectorStain-kit. Neem reagens A, ontlucht het en laat er drie druppels in 15 milliliter PBS vallen; wees voorzichtig en knijp niet in de buis, omdat de druppels nauwkeurig gedoseerd en van een specifieke grootte moeten zijn.Nadat het secundaire antilichaam ongeveer een uur heeft geïncubeerd, neemt u de objectglazen en wast u deze opnieuw met PBS, op dezelfde wijze als u deed bij het primaire antilichaam. Na drie wasbeurten van elk vijf minuten brengt u de objectglazen over naar deze container waarin u het ABC-reagens toevoegt, dat u 30 tot 45 minuten van tevoren heeft klaargezet. Voeg het ABC-reagens hieraan toe, zorg dat de objectglazen volledig bedekt zijn en laat dit nog eens 30 tot 45 minuten incuberen.Nadat de coupes ongeveer 3 tot 5 minuten in de ABC-oplossing hebben gezeten, willen we het overschot aan ABC-oplossing wegwassen. Verwijder hiervoor de coupes en breng ze over in de PBS-oplossing. Herhaal deze wasprocedure drie keer in PBS, met een wasduur van 5 minuten per keer.Terwijl de coupes worden gewassen, bereid ik het DAB-peroxidasubstraat van Vector Laboratories voor. Ik neem de pH 7.5 buffer en voeg hiervan twee druppels toe. Na de pH 7.5 buffer neem ik het DAB-substraatreactiemiddel en voeg ik daarvan twee druppels toe.Nogmaals, de druppelgrootte is cruciaal, dus knijp niet in de fles en laat de druppels gewoon vallen. Twee druppels voor buffer pH 7.5. Voeg vervolgens vier druppels van het DAB-substraatreagens toe, waarbij u deze ook laat vallen.Voeg tot slot twee druppels van het waterstofperoxide-substraatreagens toe. Zo moet het DAB-substraatreagensmengsel eruitzien. Het is nu klaar om op de coupes aan te brengen; haal de coupes eruit en laat het PBS simpelweg van de coupes aflopen.Na verloop van tijd wordt het DAB-reagens bruiner. Daarom voegen we het op dit punt toe aan de coupes. Neem een voldoende volume om de weefsels te bedekken en voeg dit direct toe aan de weefselmonsters.Neem simpelweg het juiste volume en voeg dit direct toe bovenop uw weefselmonsters, en laat de oplossing reageren; uw weefselmonsters zouden na verloop van tijd bruiner moeten worden. Na het toevoegen van uw DAB-oplossing kunt u in deze hersendoorsnede zien dat het weefsel hier en hier bruin kleurt. De bruine DAB-kleuring onthult de regio die de dopaminerge neuronen van de middenhersenen bevat.Nadat u de coupes tussen de twee en 10 minuten heeft ontwikkeld, voegt u de coupes toe aan ijswater om de reactie te stoppen. Laat de oplossing simpelweg aflopen en plaats de coupes direct in het ijswater. Nadat u de coupes in het ijswater heeft ondergedompeld, brengt u het bad naar de gootsteen en laat u er gedurende ongeveer vijf minuten koud water doorheen lopen om er zeker van te zijn dat alle DAB-oplossing uit dit bad is weggespoeld.Wees dus voorzichtig wanneer u ze in de spoelbak plaatst; zorg dat de waterstraal het weefsel niet raakt, maar laat het water tegen een van de hoeken kletsen en overstromen, zodat uw weefsels niet worden verstoord door de stroming van het water. Nadat u de coupes uit het wasbad heeft gehaald, voert u een tegenkleuring uit. Waarom zou u een tegenkleuring willen gebruiken?Een reden hiervoor is dat u wellicht de structuur van uw weefsel wilt zien. Een andere reden is om alle cellen te visualiseren. Voor onze doeleinden gaan we daarom tegenkleuren met hematoxyline, wat dient om de celkernen aan te tonen.We nemen nu de objectglazen, verwijderen het overtollige vloeistof en dompelen ze één keer in de Hemat Hematin-oplossing. Haal ze er vervolgens uit en plaats ze direct in het water. Nadat u de objectglazen in het kraanwater heeft geplaatst, spoelt u de objectglazen af onder stromend water, op dezelfde wijze als u dat eerder deed met het ijskoude waterbad.Laat de glazen bij de hematoxyline-wasstap simpelweg onder stromend water spoelen totdat het water in het potje helder wordt. Nadat we de tegengekleurde coupes uit het water hebben gehaald, willen we deze opnieuw dehydrateren. Daarom halen we ze opnieuw door de ethanolgradiënt, maar in omgekeerde volgorde.Dit houdt in: één keer wassen met gedeïoniseerd water, één keer wassen met 30% ethanol, één keer wassen met 50% ethanol, één keer wassen met 70% ethanol, twee keer wassen met 95% ethanol en twee keer wassen met 100% ethanol, waarbij elke stap twee minuten duurt. Neem de objectglazen uit, veeg het overtollige vloeistof eraf, plaats ze direct in de 30% ethanol en laat ze twee minuten staan. Na de laatste wasbeurt met 100% ethanol plaatsen we de objectglazen terug in het xyleen.Neem de objectglazen opnieuw, schraap het overtollige vloeistof eraf, en plaats de objectglazen gedurende vijf minuten in het eerste xyleen. Dit resulteert in drie opeenvolgende xyleenwasbeurten van elk vijf minuten. We kunnen nu de objectglazen monteren.Wat ik gewoonlijk doe, is dat ik één minuut voordat de glaasjes klaar zijn, met mijn Pasteurpipet de permount-montagevloeistof opzuig en dit ongeveer een minuut laat staan voordat de glaasjes uit de vloeistof kunnen worden gehaald. Na de laatste wasbeurt met xyleen haalt u de glaasjes met een pincet tevoorschijn, waarbij u voorzichtig bent dat u uw handschoenen niet onderdompelt of nat maakt met xyleen en goed let op aan welke zijde het weefsel zich bevindt. Veeg het overtollige xyleen voorzichtig af met een Kimwipe, waarbij u er op let dat u het weefsel niet aanraakt; veeg alleen voorzichtig bij de hoeken en de randen, zodat het grootste deel van het xyleen kan verdampen. U kunt waarschijnlijk aan twee glaasjes werken voordat het eerste opdroogt.Zodra u klaar bent met het drogen van één objectglas, zou het andere objectglas klaar moeten zijn voor gebruik. U moet nu verder gaan voordat ze volledig uitdrogen. Breng vervolgens met de Perimount een dunne lijn aan naast uw weefsel, waarbij u er goed op let dat u het weefsel niet aanraakt.Verwijder het perimount door het dekglas op te tillen. Plaats het dekglas in een hoek van 45 graden en laat het langzaam zakken. Schuif vervolgens het dekglas verder, waarbij u erop let dat het perimount alle weefsels volledig bedekt.Leg het vervolgens neer en druk voorzichtig in het midden om alle overtollige luchtbellen te verwijderen. Laat het drogen terwijl u aan uw tweede weefsel werkt; het is nu nog niet tijd om naar de coupes te kijken. De perma mount moet namelijk een nacht drogen voordat de coupes kunnen worden bestudeerd.Anders zal het perma mount onder het licht van de microscoop bellen vormen, waardoor uw monster wordt beschadigd. Hier is een weergave van onze hersensecties na kleuring met chemicaliën en een konijnen polyklonaal antilichaam gericht tegen tyrosine hydroxylase. Opnieuw laat de bruine DAB-kleuring de locatie van dopaminerge neuronen in de midbrain zien.De hematine-tegenkleuring kleurt alle kernen in dit weefsel blauw. Ik heb u hiermee laten zien hoe u paraffine-ingebedde coupes kleurt met gebruik van de ABC-kit van Vector Laboratories. U dient nu de condities aan te passen op basis van de weefseltypen die u kleurt en de antilichamen die u gebruikt.Veel succes met uw experimenten.

immunohistochemistry-paraffin-sections-using-vectastain-abc-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een techniek combineert in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) maakt visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke nabijheid van virus-specifieke CD8 + T-cellen om hun virus-geïnfecteerde targets, en de bepaling van de kwantitatieve relaties tussen deze immuun-effectoren en doelstellingen voor infecties resultaten.

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ</em

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

Hier beschrijven we een methode om moleculaire heterogeniteit kwantificeren in histologische secties van tumor materiaal met behulp van kwantitatieve immunofluorescentie, beeldanalyse, en een statistische maatstaf voor heterogeniteit. De methode is bedoeld voor gebruik in klinische biomarker ontwikkeling en analyse.

Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

This video describes the immunohistochemical staining technique to identify dendritic cells from endobronchial biopsies.

Immunohistochemical Staining: A Method for Obtaining Spatial Information from Thin Tissue Sections

De indirecte immunofluorescentie protocol beschreven in dit artikel laat de detectie en de lokalisatie van eiwitten in de muis borstklier. Een complete methode wordt gegeven voor te bereiden borstklier monsters, om immunohistochemie uit te voeren, om de afbeelding van het weefsel secties met behulp van fluorescentie microscopie, en om beelden te reconstrueren.

Indirecte Immunofluorescentie op Bevroren Secties van Muis borstklier

Dit protocol is een kosteneffectief alternatief voor expressie van naakt plasmide DNA in muizenhuid. Het algemene doel van het protocol is immuun-gerelateerde genen in huidweefsel aan de functionele rol van een specifiek gen in huidontsteking bakenen.

Ontwikkeling van een Economische DNA Delivery System door &quot;Acufection&quot; en de toepassing ervan op Skin Research

Hier beschrijven we een methode die in situ MHC-tetrameer kleuring combineert met immunohistochemistry lokalisatie, fenotype, en hoeveelheid van antigeen-specifieke T-cellen in weefsels te bepalen. Dit protocol wordt gebruikt om te bepalen van de ruimtelijke en fenotypische kenmerken van antigeen-specifieke CD8 T-cellen ten opzichte van andere celtype en structuren in de weefsels.

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

Momenteel is de methode van keuze voor gehaltebepaling eiwit expressie immunefluorescentie kleuring op vaste cellen wanneer morfologische ook noodzakelijk is. Dit protocol gepresenteerd hierin voorziet in een alternatieve methode van immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken.

Bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken

De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Dit experimentele protocol beschrijft en optimaliseert een multiplex immunohistochemie (IHC) kleuringsmethode, voornamelijk door de incubatieomstandigheden van eenkanaals antilichamen te optimaliseren en de instellingen van antilichamen en kanalen aan te passen om de problemen van autofluorescentie en kanaaloverspraak in longkankerweefsels van klinische oorsprong op te lossen.

Multiplex immunohistochemiekleuring voor in paraffine ingebed longkankerweefsel

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Leer immunohistochemie op paraffinecoupe met de Vectastain ABC Kit. Dit protocol omvat ontwaxen, hydrateren, antigeenretrieval en antilichaamincubatie voor betrouwbare weefselkleuring.

Immunohistochemie: Paraffinecoupes Met behulp van de Vectastain ABC Kit van Vector Labs

Meer video's verkennen