Immunohistochemie: Paraffinecoupes Met behulp van de Vectastain ABC Kit van Vector Labs

Hallo, ik ben Victor Chi en ik ben een promovendus in het Chandy Lab van de afdeling Fysiologie en Biofysica aan de University of California Irvine. Vandaag ga ik demonstreren hoe u paraffine-ingebedde coupes kunt kleuren met behulp van de A b, C kit van Vector Laboratories. Deze procedure omvat het ontparaffineren en hydrateren van paraffine-ingebedde coupes, het uitvoeren van hitte-geïnduceerde antigeen-retrieval om antigenen vrij te maken, het blokkeren van peroxidase en aspecifieke eiwitbinding, het incuberen met CD four en tyrosinehydroxylase en secundaire antilichamen, en het ontwikkelen en monteren van de objectglas.

Laten we beginnen. Omdat de coupes in paraffine zijn ingebed, is de eerste stap het ontwaxen van de slides. Dit gebeurt gewoonlijk in een zuurkast met drie potten xyleen, waarbij drie wasbeurten van elk vijf minuten worden uitgevoerd.

De coupes worden vervolgens in honderd procent ethanol geplaatst. U zult merken dat de was op de coupes is verdwenen, maar wees voorzichtig en hanteer de coupes niet met handschoenen, omdat het xyleen het rubber van de handschoenen oplost. Vervolgens brengt u de coupes in de honderd procent ethanol terug naar het laboratorium, waar ze een hydratatiegradiënt zullen ondergaan.

Ik zal u nu informeren over de hydratatiegradiënt waar we de coupes doorheen zullen brengen. Dit begint eerst met twee baden van 100% ethanol. Vervolgens brengen we de coupes over naar twee baden bestaande uit 95% ethanol.

Vervolgens brengen we de preparaten over naar een bad met 70% ethanol, en van daaruit brengen we de preparaten over naar een bad met 50% ethanol. Daarna brengen we de preparaten over naar 30% ethanol, en twee minuten later brengen we de preparaten over naar dubbel gedestilleerd water. Na de behandeling met dubbel gedestilleerd water laten we de preparaten in PBS rusten.

Ik ga u nu laten zien hoe u de objectglazen in de houders van het ene bad naar het volgende verplaatst. De eerste stap is om de objectglazen met de houder te verwijderen en ze voorzichtig af te schrapen om overtollige vloeistof te verwijderen, zodat u niet te veel vloeistof meeneemt naar het volgende bad. Dompel ze daarna onder en wacht twee minuten tot de volgende gradiëntwijziging.

Vaak raakt het antigeen gemaskeerd wanneer weefsels worden gefixeerd, waardoor het antilichaam er niet meer aan kan binden. Daarom zal ik u nu een methode laten zien voor hitte-geïnduceerde antigeenherstel met behulp van natriumcitraat. We staan nu bij de magnetron, waar ik mijn CD8-antigeen zal ontmaskeren, dat ik vervolgens via immunohistochemie zal proberen aan te tonen.

Vervolgens voeg ik mijn oplossing toe en verhit ik deze 15 minuten in de magnetron. We koken het natriumcitraat samen met onze coupes gedurende 15 minuten om te voorkomen dat de coupes uitdrogen. We houden de coupes in de gaten, zodat we bij overkoken opnieuw natriumcitraat kunnen bijvullen om te garanderen dat de coupes gehydrateerd blijven.

Voordat ik mijn objectglaasjes in het natriumcitraat plaats, heb ik mijn oplossing al 45 seconden voorverwarmd. Vervolgens heb ik de objectglaasjes in het natriumcitraat geplaatst en nu verhit ik het natriumcitraat gedurende 15 minuten. Terwijl de objectglaasjes erin zitten, zal de oplossing meestal na ongeveer twee tot twee en een halve minuut van het kookproces beginnen over te koken.

Op dat punt stop ik en vervang ik het verloren gegane natriumcitraat door vers natriumcitraat. Nadat het natriumcitraat 15 minuten heeft gekookt, willen we de coupes en de oplossing verwijderen en afkoelen. De beste manier om dit te doen is door de coupeshouder af te sluiten, het overtollige vloeistof af te gieten en het geheel onder een straal koud water te houden totdat de oplossing in de pot is afgekoeld tot kamertemperatuur.

Dit duurt gewoonlijk ongeveer 10 tot 15 minuten. Nadat we de coupes uit het bad hebben gehaald, moeten we de endogene peroxidase-activiteit in de weefsels blokkeren. Hiervoor maken we een waterstofperoxide-oplossing door 30% waterstofperoxide te gebruiken om een 1% waterstofperoxide-oplossing te bereiden.

Vanaf dit punt breng ik de objectglazen direct over naar de waterstofperoxide-oplossing. We laten de objectglazen nu 20 minuten incuberen in de waterstofperoxide. Nadat er 20 minuten zijn verstreken en de endogene peroxidase is geblokkeerd, zal ik de waterstofperoxide van de objectglazen afwassen met spoelingen van PBS.

Ik zal nu de objectglazen naar de houder overbrengen en deze wassen met drie wasbeurten van elk vijf minuten. Deze objectglazen zijn rug-aan-rug geplaatst om contact met andere objectglazen te vermijden, wat het weefsel zou kunnen beschadigen. Ik schuif de objectglazen simpelweg weg en rangschik ze zodanig dat het weefsel geen mogelijkheid heeft om het glas te raken.

Vervolgens brengen we de coupes over naar PBS. Na het wassen van de coupes met PBS, ga ik de coupes nu blokkeren tegen aspecifieke binding van eiwitten met een oplossing van 5% BSA, 5% geiten serum en 0,1% natriumazide. Indien u werkt met geitenantilichamen, dient u het geitenserum te vervangen door dat van een andere soort.

Ik ga nu de objectglazen in onze houder plaatsen en deze vullen met onze oplossing. Normaal gesproken vul ik de houder tot de helft, zodat het volume van de objectglazen ervoor zorgt dat de weefsels volledig ondergedompeld zijn. Let er bij het plaatsen van de objectglazen in de houder op dat het weefsel de wanden van de houder niet raakt.

Draai de laatste coupes dus naar binnen zodat het weefsel de container niet raakt. Nu de coupes een nacht zijn geblokkeerd, spoel ik het overtollige blokkeringsmedium weg met drie wasbeurten van vijf minuten in PBS. Op dit punt tekenen we met een vloeibare blocker een cirkel rond ons weefsel om de hoeveelheid te gebruiken antilichaam te minimaliseren.

Als u zich geen zorgen maakt over het besparen van antilichamen, kunt u de objectglazen altijd incuberen in dezelfde bakjes waarin de blokkeringsstap is uitgevoerd. Vanaf dit punt laat ik u zien hoe we met vloeibare blokker rondom ons weefsel tekenen. Eerst verwijderen we het overtollige bloed en de vloeistof, waarbij we er voorzichtig op letten het weefsel niet aan te raken.

Veeg vervolgens rond de hoeken om overtollige vloeistof te verwijderen. Wees hierbij opnieuw zeer voorzichtig om het weefsel niet aan te raken. Neem de blokkeerpin voor de vloeistof, druk deze voorzichtig in om de stroom op gang te brengen, en omcirkel vanaf dat punt het weefsel met uw pen.

Laat de vloeibare blokker ongeveer 15 seconden drogen. Op dit punt voegen we het primaire antilichaam toe. Gebruik een pipette om het weefsel volledig te bedekken met het primaire antilichaam en plaats het vervolgens in de vochtgecontroleerde bewaardoos.

Hiervoor gebruiken we een Kim wipe, bevochtigd met wat gedestilleerd water in deze bak om te voorkomen dat het objectglas uitdroogt terwijl het wordt geïncubeerd met het primaire antilichaam. Nu het primaire antilichaam een uur heeft geïncubeerd, halen we de objectglazen eruit en wassen we het overtollige antilichaam af met PBS.

Laat de vloeistof dus opnieuw simpelweg weglopen en plaats het monster in de PBS-wasoplossing. Was opnieuw drie keer gedurende vijf minuten. Na deze drie wasbeurten van vijf minuten voegen we de secundaire antilichamen toe aan het weefsel op dezelfde manier als we de primaire antilichamen hebben toegevoegd.

Voeg uw secundaire antilichaam toe — in dit geval gebruiken we geit anti-konijn — met een volume dat voldoende is om de weefsels te bedekken, en plaats de slide terug in de kamer met gecontroleerde vochtigheid. We gebruiken een secundair antilichaam, namelijk gebiotinyleerd geit anti-konijn, wat essentieel is bij het gebruik van de ABC-methode. We plaatsen de slide in de kamer met gecontroleerde vochtigheid en laten deze één uur incuberen.

Terwijl het secundaire antilichaam incorporeert, moeten we het ABC-reagens klaarmaken. We gebruiken hiervoor het ABC-reagens van Vector Laboratories uit de VectorStain-kit. Neem reagens A, ontlucht het en laat er drie druppels in 15 milliliter PBS vallen; wees voorzichtig en knijp niet in de buis, omdat de druppels nauwkeurig gedoseerd en van een specifieke grootte moeten zijn.

Nadat het secundaire antilichaam ongeveer een uur heeft geïncubeerd, neemt u de objectglazen en wast u deze opnieuw met PBS, op dezelfde wijze als u deed bij het primaire antilichaam. Na drie wasbeurten van elk vijf minuten brengt u de objectglazen over naar deze container waarin u het ABC-reagens toevoegt, dat u 30 tot 45 minuten van tevoren heeft klaargezet. Voeg het ABC-reagens hieraan toe, zorg dat de objectglazen volledig bedekt zijn en laat dit nog eens 30 tot 45 minuten incuberen.

Nadat de coupes ongeveer 3 tot 5 minuten in de ABC-oplossing hebben gezeten, willen we het overschot aan ABC-oplossing wegwassen. Verwijder hiervoor de coupes en breng ze over in de PBS-oplossing. Herhaal deze wasprocedure drie keer in PBS, met een wasduur van 5 minuten per keer.

Terwijl de coupes worden gewassen, bereid ik het DAB-peroxidasubstraat van Vector Laboratories voor. Ik neem de pH 7.5 buffer en voeg hiervan twee druppels toe. Na de pH 7.5 buffer neem ik het DAB-substraatreactiemiddel en voeg ik daarvan twee druppels toe.

Nogmaals, de druppelgrootte is cruciaal, dus knijp niet in de fles en laat de druppels gewoon vallen. Twee druppels voor buffer pH 7.5. Voeg vervolgens vier druppels van het DAB-substraatreagens toe, waarbij u deze ook laat vallen.

Voeg tot slot twee druppels van het waterstofperoxide-substraatreagens toe. Zo moet het DAB-substraatreagensmengsel eruitzien. Het is nu klaar om op de coupes aan te brengen; haal de coupes eruit en laat het PBS simpelweg van de coupes aflopen.

Na verloop van tijd wordt het DAB-reagens bruiner. Daarom voegen we het op dit punt toe aan de coupes. Neem een voldoende volume om de weefsels te bedekken en voeg dit direct toe aan de weefselmonsters.

Neem simpelweg het juiste volume en voeg dit direct toe bovenop uw weefselmonsters, en laat de oplossing reageren; uw weefselmonsters zouden na verloop van tijd bruiner moeten worden. Na het toevoegen van uw DAB-oplossing kunt u in deze hersendoorsnede zien dat het weefsel hier en hier bruin kleurt. De bruine DAB-kleuring onthult de regio die de dopaminerge neuronen van de middenhersenen bevat.

Nadat u de coupes tussen de twee en 10 minuten heeft ontwikkeld, voegt u de coupes toe aan ijswater om de reactie te stoppen. Laat de oplossing simpelweg aflopen en plaats de coupes direct in het ijswater. Nadat u de coupes in het ijswater heeft ondergedompeld, brengt u het bad naar de gootsteen en laat u er gedurende ongeveer vijf minuten koud water doorheen lopen om er zeker van te zijn dat alle DAB-oplossing uit dit bad is weggespoeld.

Wees dus voorzichtig wanneer u ze in de spoelbak plaatst; zorg dat de waterstraal het weefsel niet raakt, maar laat het water tegen een van de hoeken kletsen en overstromen, zodat uw weefsels niet worden verstoord door de stroming van het water. Nadat u de coupes uit het wasbad heeft gehaald, voert u een tegenkleuring uit. Waarom zou u een tegenkleuring willen gebruiken?

Een reden hiervoor is dat u wellicht de structuur van uw weefsel wilt zien. Een andere reden is om alle cellen te visualiseren. Voor onze doeleinden gaan we daarom tegenkleuren met hematoxyline, wat dient om de celkernen aan te tonen.

We nemen nu de objectglazen, verwijderen het overtollige vloeistof en dompelen ze één keer in de Hemat Hematin-oplossing. Haal ze er vervolgens uit en plaats ze direct in het water. Nadat u de objectglazen in het kraanwater heeft geplaatst, spoelt u de objectglazen af onder stromend water, op dezelfde wijze als u dat eerder deed met het ijskoude waterbad.

Laat de glazen bij de hematoxyline-wasstap simpelweg onder stromend water spoelen totdat het water in het potje helder wordt. Nadat we de tegengekleurde coupes uit het water hebben gehaald, willen we deze opnieuw dehydrateren. Daarom halen we ze opnieuw door de ethanolgradiënt, maar in omgekeerde volgorde.

Dit houdt in: één keer wassen met gedeïoniseerd water, één keer wassen met 30% ethanol, één keer wassen met 50% ethanol, één keer wassen met 70% ethanol, twee keer wassen met 95% ethanol en twee keer wassen met 100% ethanol, waarbij elke stap twee minuten duurt. Neem de objectglazen uit, veeg het overtollige vloeistof eraf, plaats ze direct in de 30% ethanol en laat ze twee minuten staan. Na de laatste wasbeurt met 100% ethanol plaatsen we de objectglazen terug in het xyleen.

Neem de objectglazen opnieuw, schraap het overtollige vloeistof eraf, en plaats de objectglazen gedurende vijf minuten in het eerste xyleen. Dit resulteert in drie opeenvolgende xyleenwasbeurten van elk vijf minuten. We kunnen nu de objectglazen monteren.

Wat ik gewoonlijk doe, is dat ik één minuut voordat de glaasjes klaar zijn, met mijn Pasteurpipet de permount-montagevloeistof opzuig en dit ongeveer een minuut laat staan voordat de glaasjes uit de vloeistof kunnen worden gehaald. Na de laatste wasbeurt met xyleen haalt u de glaasjes met een pincet tevoorschijn, waarbij u voorzichtig bent dat u uw handschoenen niet onderdompelt of nat maakt met xyleen en goed let op aan welke zijde het weefsel zich bevindt. Veeg het overtollige xyleen voorzichtig af met een Kimwipe, waarbij u er op let dat u het weefsel niet aanraakt; veeg alleen voorzichtig bij de hoeken en de randen, zodat het grootste deel van het xyleen kan verdampen. U kunt waarschijnlijk aan twee glaasjes werken voordat het eerste opdroogt.

Zodra u klaar bent met het drogen van één objectglas, zou het andere objectglas klaar moeten zijn voor gebruik. U moet nu verder gaan voordat ze volledig uitdrogen. Breng vervolgens met de Perimount een dunne lijn aan naast uw weefsel, waarbij u er goed op let dat u het weefsel niet aanraakt.

Verwijder het perimount door het dekglas op te tillen. Plaats het dekglas in een hoek van 45 graden en laat het langzaam zakken. Schuif vervolgens het dekglas verder, waarbij u erop let dat het perimount alle weefsels volledig bedekt.

Leg het vervolgens neer en druk voorzichtig in het midden om alle overtollige luchtbellen te verwijderen. Laat het drogen terwijl u aan uw tweede weefsel werkt; het is nu nog niet tijd om naar de coupes te kijken. De perma mount moet namelijk een nacht drogen voordat de coupes kunnen worden bestudeerd.

Anders zal het perma mount onder het licht van de microscoop bellen vormen, waardoor uw monster wordt beschadigd. Hier is een weergave van onze hersensecties na kleuring met chemicaliën en een konijnen polyklonaal antilichaam gericht tegen tyrosine hydroxylase. Opnieuw laat de bruine DAB-kleuring de locatie van dopaminerge neuronen in de midbrain zien.

De hematine-tegenkleuring kleurt alle kernen in dit weefsel blauw. Ik heb u hiermee laten zien hoe u paraffine-ingebedde coupes kleurt met gebruik van de ABC-kit van Vector Laboratories. U dient nu de condities aan te passen op basis van de weefseltypen die u kleurt en de antilichamen die u gebruikt.

Veel succes met uw experimenten.