Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat Format

Er zijn relatief weinig geneesmiddelen beschikbaar om mycobacterium tuberculosis te behandelen, dus resistentie tegen elk medicijn is een zorg. Dit videoartikel beschrijft een procedure voor het testen van de antibioticaresistentie van M. tuberculosis tegen 12 verschillende microbiële geneesmiddelen tegelijk. Dus, de mogelijkheid om snel de antimicrobiële resistentie van M. tuberculosis te detecteren is erg belangrijk in de inspanning om de toename van resistente stammen te beheersen Hier om de antibioticagevoeligheid te testen.

M. tuberculosis wordt eerst gekweekt op vast of in bouillonmedium, een bacteriesuspensie. Het inocculum wordt bereid en toegevoegd aan een microtiterplaat met verschillende concentraties van 12 geneesmiddelen, inclusief eerste lijn en tweede lijn geneesmiddelen. Na incubatie. De mate van groei in elke put wordt bepaald, hetzij handmatig met behulp van een spiegelbox of met behulp van een semi-geautomatiseerde platelezer.

De resulterende gegevens geven de minimale remmende concentratie voor elk getest geneesmiddel aan en laten zien tegen welke antibiotica de geteste TB-stam resistent is. Deze resultaten helpen bij het kiezen van het juiste medicijn voor de behandeling van tb. Hallo, mijn naam is Nancy Ek en ik ben directeur van het Myco Bacteriology Laboratorium in de Mayo Clinic in Rochester, Minnesota.

Vandaag gaan we een methode beschrijven voor het doen van antibioticagevoeligheidstesten voor mycobacterium tuberculosis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals macro bouillon verdunning is dat een MIC wordt bepaald voor elk geneesmiddel en 12 antibiotica worden gelijktijdig getest. De procedure wordt gedemonstreerd door Kurt Jude, een kwaliteitsspecialist in mijn laboratorium, werkzaam aan een laboratoriumbank.

Bereid u voor op deze procedure door een bloedagarplaat, drie Middlebrooks zeven H 10 platen, een zout-tween glaskralenbuisje en een microtiterplaat te labelen met de naam van de patiënt en het identificatienummer van het specimen. Label bovendien de bloedagar en zeven H 10 platen als zuiverheid. Controleer label een van deze zeven H 10 platen als één op één kolonietelling en de andere als één op 50 kolonietelling.

Plaats vervolgens de lade in de doorgang. Bereid u vervolgens voor om in de niveau drie bioveiligheid BSL drie faciliteit te werken door een solide voorschort, hoofdkap, handschoenen, schoenhoezen en een ademhalingsmasker aan te trekken. Hier wordt een pappa ademhalingsmasker gebruikt.

Haal vervolgens de lade uit de doorgang. Vervolgens in de BSL drie faciliteit, desinfecteer het oppervlak van de biologische veiligheidskast. Plaats vervolgens een papieren handdoek gedrenkt in ontsmettingsmiddel binnenin de kap, ongeveer zes centimeter van het luchtventilatiepaneel naast de papieren handdoek.

Plaats inocculatieslussen, pipetters en tips, een geschikte afvalcontainer, een nefi, TER en een vortex. Zodra de kap is voorbereid, plaatst u het organisme op de papieren handdoek samen met een rek met een McFarland 0,5 standaard Een zeven H negen bouillon met OADC en een zoutkralenbuisje. Deze opstelling is gedaan vanuit vast, medium.

Bereid het inocculum voor vanuit een vast medium kweek van een patiëntspecimen. Gebruik een steriele lus om de kolonies te schrapen en ze over te brengen naar het zout-tween glaskralenbuisje. Vortex de suspensie gedurende 30 tot 60 seconden.

Inspecteer het monster visueel, vergelijk het met de McFarland standaard. De overgedragen hoeveelheid moet gelijk aan of groter zijn dan de standaard. Zo niet, voeg meer van het bacteriemonster toe en vortex. Opnieuw.

Zodra de McFarland standaard is gekoppeld, laat het inocculum 15 minuten bezinken om grotere klonten bacteriën te laten bezinken. Gebruik vervolgens een nefi TER om de dichtheid van de gesuspendeerde bacteriën tot nul te meten. De nefi ter.

Plaats eerst een lege zoutkralen tween buis in de nefi ter. Druk op de knop kalibreren om het instrument op nul te stellen, plaats vervolgens de McFarland 0,5 standaard in de Nephi ter en druk opnieuw op de knop kalibreren. Zodra het instrument is gekalibreerd, verwijdert u de McFarland standaard en voegt u het inocculum toe.

De inocculum lezing moet gelijk zijn aan de McFarland standaard lezing. Als de lezing te laag is, verwijdert u de buis en brengt u meer bacteriën over van de plaat. Vortex vervolgens en lees het monster opnieuw.

Als de lezing te hoog is, voegt u zout tween toe aan de buis en vortex. Lees vervolgens het monster opnieuw. Ga door met het aanpassen van het inocculum zo nodig totdat de concentratie van de bacteriën overeenkomt met de McFarland standaard.

Gebruik vervolgens een 200 microliter pipetter en een lange aërosolbestendige pipettertip om 100 microliter inocculum te verwijderen uit de bovenste derde van de buis. Om eventuele klonten die zich op de bodem nestelen te vermijden, inoculeer de Middlebrook zeven H negen bouillon langzaam voor 20 seconden met vortex om het inocculum te plateren. Begin met het verwijderen van de microtiterplaat uit de verpakking van de fabrikant. Als de droogstof blauw is of als de folieverpakking beschadigd is, gebruik het dan niet.

De plaat bevat al de 12 te testen antimicrobiële middelen in elke put, inclusief de meest effectieve of eerste lijn geneesmiddelen en tweede lijn geneesmiddelen. Giet voorzichtig de zeven H negen bouillon inocculum in een trth zonder aërosol te genereren. Plaats vervolgens de micro titterplaat met de label naar buiten zoals hier getoond, en gebruik een 12-kanaals pipetter om 100 microliter van het inocculum toe te voegen aan elke put.

Bereid vervolgens platen voor om kolonietellingen uit te voeren. Bereid eerst een niet-verdunde plaat voor door een microliterlus monster van de positieve controleput over te brengen naar de zeven H 10 plaat gelabeld één op één. Gebruik vervolgens de lus om de plaat te strijken zoals hier getoond.

Vervolgens bereidt u een één op vijftig verdunning voor door een microliterlus van de positieve controleput over te brengen en deze in de buis met 50 microliter water te draaien. Streep één microliter van deze verdunning op de plaat gelabeld één