Name: Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat Format (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Leer antimicrobiële gevoeligheidstesten van Mycobacterium tuberculosis met microtiterplaatmethode voor 12 geneesmiddelen tegelijk. Deze procedure bepaalt MIC-waarden voor effectieve behandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag naar het laboratorium technologen van de Mayo Clinic Mycobacteriologie Laboratorium bedanken voor hun hulp tijdens de studie.

Elk laboratorium moet een risico-evaluatie in samenwerking met hun institutionele Biologische veiligheidsbeambte uit te voeren om de juiste bioveiligheidsniveau vast te stellen voor de voorbereiding van het inoculum en voor het pipetteren van het inoculum in de plaat. In ons laboratorium hebben we gebruik maken van bioveiligheidsniveau 3 laboratorium (BSL3) praktijken totdat de microtiterplaten zijn ingeënt, en verzegeld met een plastic zelfklevende afdichting. Deze platen worden dan geplaatst in een plastic zak, die warmte-ook verzegeld. Incubatie en de interpretatie lezing van de microtiterplaat wordt uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau twee laboratoria (BSL2). 1. Etikettering van materialen <ol><li> Label een bloed agar plaat, drie Middlebrook 7H10 platen, Middlebrook 7H9 bouillon, een zoute tussen glazen kraal buis en een microtiter AST plaat met de juiste kenmerken (zoals naam van de patiënt, medisch dossier nummer) in de BSL2. </li><li> Label het bloed agar en 7H10 vergulde als "zuiverheid check '. Periodieke kiemgetal van het inoculum wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat een geschikte concentratie van organismen wordt gebruikt in de test. Kolonie telt wanneer deze wordt uitgevoerd zal moeten twee van de 7H10 platen gemerkt met "1 / 1 kiemgetal" en "1 / 50 kiemgetal" hebben. </li></ol> 2. Technoloog voorbereidingen te gaan in de BSL3 <ol><li> De juiste persoonlijke beschermingsmiddelen is noodzakelijk om het werk in de BSL3 en omvat solid-front gewaad, het hoofd te dekken, handschoenen, schoenen covers, en een masker. Elke instelling moet opzetten van hun eigen ademhalingsbescherming plan in samenwerking met industriële hun instelling Hygiëne Officer. In ons laboratorium hebben wij diverse maskers beschikbaar, waaronder aangedreven luchtzuiverende ademhalingstoestellen (PAPRs) en voorzien van HEPA-gefilterd, N95 half-face maskers. </li></ol> 3. Voorbereiding van de biologische veiligheid kabinet <ol><li> In de BSL3, de voorbereiding van de biologische veiligheid kast (BSC) met het desinfecteren van de oppervlakte en het plaatsen van een papieren handdoek doorweekt met een ontsmettingsmiddel ongeveer 6 centimeter van de ontluchter paneel. </li><li> Plaats een afvalcontainer aan de linkerkant, en de kleine nephlometer en vortexer aan de rechterkant. </li><li> Entogen, pipetors en tips worden geplaatst naast de papieren handdoek. </li><li> Plaats een rek met het organisme (in bouillon of op vast medium) en de 0.5 McFarland standaard op de papieren handdoek. </li></ol> 4. Kalibratie van de nephelometer <ol><li> Plaats een zoutoplossing tussen glazen kraal buis in de nephelometer en zet het instrument op nul met behulp van het zoute tussen blank. </li><li> Plaats de McFarland 0,5 standaard in de nephelometer en kalibreren volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 5. Bereiding van het entmateriaal <ol><li> Werken in de BSC, schrapen kolonies van vast medium met een steriel oogje in het juiste label zoute tussen glazen kraal buis tot een ≥ 0,5 McFarland Standard is verkregen. </li><li> Inspecteer het monster, en te vergelijken met de McFarland standaard. </li><li> Vortex steekproef voor 30-60 seconden. </li><li> Laat het inoculum genoegen te nemen met 15 minuten (een timer instellen). </li></ol> 6. Enten van de microtiterplaat <ol><li> Stel het inoculum met een zoutoplossing tussen bouillon met behulp van de nephelometer gekalibreerd om de McFarland 0,5 in stappen 4.1 en 4.2. Dit moet worden voltooid binnen 30 minuten (per specificaties van de fabrikant). </li><li> Gebruik een 200 pi pipetter en een LONG spuitbus tegen pipet tip om 100 ul van inoculum uit de TOP 1 / 3 van de zoute kraal tussen buis. Inoculeren de Middlebrook 7H9 bouillon. Langzaam vortex de geïnoculeerde 7H9 bouillon gedurende 20 seconden. </li><li> Verwijder de AST microtiterplaat uit de verpakking van de fabrikant. Niet gebruiken als het droogmiddel blauw is of als de folie verpakking beschadigd is. </li><li> Bereid een 1:50 verdunning tube voor later gebruik bij de bereiding van de verdunning 1:50 eveneens 50 ul van steriel water in een steriele buis. </li><li> Giet de bouillon 7H9 inoculum in een trog. VERMIJDEN het genereren van aërosolen. </li><li> Plaats de AST microtiterplaat met het label naar u toe. </li><li> Gebruik een 12-kanaals pipetter tot 100 pi van het inoculum toe te voegen aan elk putje. </li><li> Bereid verdunningen voor kiemgetal: <ol type="a"><li> De 1 / 1 verdunning is bereid uit de positieve controle goed (H12) met strepen 1 ui lus op de 7H10 plaat het opschrift "1 / 1". </li><li> De 1 / 50 verdunning wordt bereid door het enten een 1 pi lus van de positieve controle goed (H12) en wervelende het in de buis met 50 ul van water buis boven voorbereid. Streak een pi van deze verdunning aan de plaat het label "1 / 50". </li></ol></li><li> Inoculeren de zuiverheid platen uit de trog eveneens 50 ul op een juiste wijze gelabeld bloed agar en 7H10 plaat en strook voor isolatie. </li><li> Plaatseen zelfklevende zegel op de AST microtiterplaat. Druk stevig op elk putje om voldoende afdichting te garanderen door gebruik te maken van de witte achterkant van het zegel. Te vermijden kreukels. </li><li> Ontsmet de microtiterplaat schoon met een papieren handdoek doordrenkt met een tuberculocide ontsmettingsmiddel en plaats microtiterplaat in een plastic zak en sluit met een warmte-zegel of tape. <ol type="a"><li> De plastic zak dient als een secundaire container om ervoor te zorgen dat alle bouillon is opgenomen moet er een lek of morsing van de primaire plaat. </li></ol></li></ol> 7. Desinfectie van materialen en biologische veiligheid kabinet <ol><li> Om te voorkomen dat de productie van spuitbussen, plaats een ander via op de top van de geïnoculeerde trog voordat u ze voorzichtig in de container gooi. </li><li> Desinfecteer alle materialen inclusief nephlometer, vortexer, platen, buizen, enz. door vegen beneden met een tuberculocide ontsmettingsmiddel en wacht het juiste moment om desinfectie verzekeren volgens de instructies van de fabrikant voordat u van de BSC. Bijvoorbeeld Prospray, de tuberculocide desinfectiemiddel die we gebruiken, vereist 15 minuten om te doden mycobacteriën. </li><li> Plaats de container gooi in een biohazard zak en sluit voor de autoclaaf. </li></ol> 8. Incubatie <ol><li> De platen worden geïncubeerd met de media naar beneden en zorg moeten worden genomen om te voorkomen dat morsen of spatten een vloeistof. </li><li> Incubeer de AST microtiterplaat plaat, 7H10 en bloed agar platen in een 35-37 ° C incubator met 5-10% CO 2 met 5-10% CO 2 in de BSL2 laboratorium. <ol class="lalpha"><li> In ons laboratorium, is dit aanvaardbaar omdat de plaat is goed afgesloten en in een afgesloten plastic zak. </li></ol></li><li> Niet meer dan 2 microtiterplaten AST platen moeten worden gestapeld in de couveuse volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 9. Representatieve resultaten Interpretatie van de resultaten: Verzegelde AST microtiterplaten kan worden gelezen handmatig met een spiegel als een hulp of met een automatische plaat lezer, zoals de Vizion (TREK Diagnostics). De platen kunnen zo snel 7 dagen na inoculatie worden onderzocht. Onderzoekt de groei van controle putten in posities H11 en H12 om te bepalen of ze positief zijn (dwz, hebben een aanbetaling van cellen op de bodem van de put). Als de groei controle putten zijn niet positief, reincubate de plaat en op gezette tijden opnieuw te onderzoeken (bijvoorbeeld, dag 10, dag 14) tot de groei van controle putten zijn positief. <ol type="a"><li> Spiegel te lezen: <ol type="i"><li> Plaats verzegelde AST microtiterplaat op het platform; </li><li> Lees de groei controle putten na 7 dagen incubatie, indien deze negatief is, reincubate AST microtiterplaat; </li><li> Als de groei controles aanvaardbaar zijn, lees dan het medicijn-bevattende putten. Voor voor elk geneesmiddel, neem dan de eerste verdunning dat geen groei heeft door het vergelijken van de drug putten met de groei te controleren. </li><li> Groei verschijnt als troebelheid of als borg van cellen op de bodem van een waterput. </li></ol></li><li> Instrument Lees: volg de instructies van de fabrikant, de onderstaande instructies zijn een voorbeeld van hoe de lezing zou worden gedaan met de Vizion platform: <ol type="i"><li> In te loggen </li><li> Gebruik "MYCOTB" AST plaat software. </li><li> Plaats verzegeld plaatje met de barcode naar de gebruiker. Groei verschijnt als troebelheid of als borg van cellen op de bodem van een waterput. </li><li> Lees de groei controles; indien deze negatief is, reincubate AST microtiterplaat, als positief de plaat gelezen door het aanraken van het scherm met de eerste put van elk geneesmiddel dat niet tonen groei. </li></ol></li></ol> Lees zuiverheid platen. Het bloed agar plaat mogen geen groei na 48 uur en de 7H10 zuiverheid plaat moet samenvloeiing groei van een organisme type zijn. Indien verontreinigd, de AST microtiterplaten test moet worden herhaald vanuit een zuivere cultuur. Bereken kiemgetal van de positieve controle en met behulp van de onderstaande tabel: Kolonie Count Key <table border="1"><tbody><tr><td> # Kolonies geteld op het bord van het opschrift "1 / 1" </td><td> # Kolonies geteld op het bord van het label "1 / 50" </td><td> Inoculum Colony Count (cfu / ml) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 X 4 tot 01 oktober X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 x 10 5 tot 5 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> Er kunnen trailing met para-aminosalicylzuur in sommige stammen van Mycobacterium tuberculosissis. Dit kan worden geïnterpreteerd door te kijken naar alle putten die pellets hebben en het gebruik van de eerste put die dezelfde afmetingen heeft als pellet de volgende verdunning als het eindpunt. Weerstand is zeldzaam met dit geneesmiddel. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Representatieve resultaten met behulp van de MYCOTB plaat. <table border="1"><tbody><tr><td> Drugs afkorting </td><td> Drug </td><td> MIC μ / ml </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacine </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> moxifloxacine </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampicine </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td> amikacine </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> streptomycine </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutine </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> p-aminosalicylzuur </td><td> ≤ 0,5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> ethionamide </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> cycloserine </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazide </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> kanamycine </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> ethambutol </td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).</li>
<li>HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services+Centers+for+Disease+and+Preventions%22">U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions</a>. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).</li>
<li>Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MGIT+960+and+the+colorimetric-based+method+for+tuberculosis+drug+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).</li>
<li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+Evaluation+of+the+MB%2FBACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li>
<li>SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Product+Insert%22">Product Insert</a>. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Susceptiblity+Testing+of+Mycobacteria%2C+Nocardia%2C+and+Other+Aerobic+Actinomycetes%3B+Approved+Standard.+Document+M24-A%22">Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A</a>. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).</li>
<li>Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, San Diego, CA, , Abstract C-151 (2010).</li>
<li>VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Product+insert%22">Product insert</a>. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. 7115-7160 (2008).</li>
<li>Parrish, N. M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Clinical+Mycobacteriology+Laboratory+in+the+Diagnosis+and+Management+of+Tuberculosis+in+Low+Prevalance+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings.</a> J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+critical+concentrations+of+second-line+anti-tuberculosis+drugs+with+clinical+and+microbiological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tubercl+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance.</a> Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).</li>
<li>Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoods%2C+GL+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).</li>
<li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li>
</ol>

Een voorbeeld van een AST microtiterplaat dat de positieve groei van de controles is weergegeven in figuur 1 en het eindpunt MIC (ug / ml) voor elk geneesmiddel is omcirkeld. Een studie uitgevoerd in ons laboratorium aangegeven dat de AST microtiterplaat methode is gelijkwaardig aan de gouden standaard agar aandeel methode voor het testen van de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis. Snellere rapportage van de resultaten werd verkregen met microtiter AST microtiterplaat in vergelijking met de traditionele agar methode verhouding met de uiteindelijke interpretatie van AST microtiterplaat en agar proportie methode op 14 en 21 dagen, op respectievelijk AST microtiterplaat heeft het voordeel van het testen van de eerste en tweede lijn drugs tegelijk die kunnen helpen bij het voorkomen buitensporige vertragingen met resistente stammen. De AST microtiterplaat is ook veel makkelijker in te stellen en te lezen dan de APM en zowel een handmatige spiegel en een semi-geautomatiseerd systeem, zoals de Vizion kunnen worden gebruikt om de platen te lezen. De beschikbaarheid van een MIC-waarde voor de tbc-resistentie testen kunnen waardevolle nieuwe informatie aan artsen ten opzichte van de traditionele kritische concentratie waarde, vooral voor degenen isolaten met een &quot;borderline&quot; gevoeligheid.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> AST microtiterplaten en zelfklevende zegel </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland Ohio </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> McFarland 0,5 standaard </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 platen </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Blood Agar Platen </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Steriel loops een pi </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Steriele loops 10 pi </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween glas kraal bouillon </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC Broth </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Lange Pipet Tips </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Steriel Troggen </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td></td></tr><tr><td> M. tuberculosis </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20μL </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Tips 1000, 20, 20 ui </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Multichannel Pipetter </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Incubator 5-10% CO 2 </td><td> Visser </td><td></td></tr><tr><td> Plastic zakken, klein, CO 2 doorlaatbare </td><td> Poly Plastic, Delano, PA </td><td></td></tr><tr><td> TB ontsmettingsmiddel (Zoals ProSpray C-60) </td><td> Certol International, Commerce City, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> Mirror Box Reader </td><td> Visser </td><td></td></tr></tbody></table>

antimicrobiële gevoeligheid testen van mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat format

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

De snelle detectie van antimicrobiële resistentie is het belangrijk in het streven om de toename van resistente Mycobacterium tuberculosis (MTB) te controleren. Antimicrobiële gevoeligheid (AST) van de MTB is van oudsher uitgevoerd door de agar-methode van aandeel of door macrobroth testen op een instrument, zoals de BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) of BacT / ALERT (bioMerieux, Hazelwood, MO). De agar aandeel methode, terwijl beschouwd als de &quot;gouden&quot; standaard van AST, is arbeidsintensief en vereist de berekening van de weerstand door het uitvoeren van kolonie rekent op geneesmiddel-bevattende agar in vergelijking met drug-free agar. Als er ≥ 1% groei van de drug-bevattend medium in vergelijking met de drugs-vrij medium, wordt het organisme beschouwd als resistent tegen deze medicijnen. De macrobroth methoden vereisen instrumentatie en test break point (&quot;kritische&quot;) concentraties van het geneesmiddel voor de eerste lijn geneesmiddelen (isoniazide, ethambutol, rifampicine en pyrazinamide). De hier beschreven methode is commercieel beschikbaar in een 96 wells microtiterplaat formaat [MYCOTB (TREK Diagnostics)] en bevat toenemende concentraties van 12 antibiotica voor de behandeling van tuberculose, waaronder zowel de eerste (isoniazide, rifampicine, ethambutol) en tweede lijn drugs (amikacine, cycloserine, ethionamide, kanamycine, moxifloxacine, ofloxacine, para-aminosalicylzuur, rifabutine, en streptomycine). Pyrazinamide, is een eerste lijn drugs en niet opgenomen in de microtiterplaat vanwege de noodzaak voor zure testomstandigheden. Voordelen van het systeem microtiter zowel het gemak van de set-up en een snellere doorlooptijd (14 dagen) in vergelijking met de traditionele agar deel (21 dagen). Daarnaast kan de plaat worden opgezet vanuit inoculum bereid met behulp van bouillon of vast medium. Sinds de microtiterplaat formaat is nieuw en sinds Mtb biedt unieke veiligheid uitdagingen in het laboratorium, dit protocol wordt beschreven hoe op een veilige manier instellen, broeden en lees de microtiterplaat.

Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis is een uitdaging, maar essentieel voor de patiëntenzorg. Dit microtiterplaat formaat biedt het testen van 12 antimycobacteriële drugs en zorgt voor minimale remmende concentratie (MIC) waarden, die zal helpen bij een passende behandeling.

Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat Format

De snelle detectie van antimicrobiële resistentie is van groot belang in de inspanningen om de toename van resistente Mycobacterium tuberculosis (Mtb) te beheersen. ...

Er zijn relatief weinig geneesmiddelen beschikbaar voor de behandeling van Mycobacterium tuberculosis, waardoor resistentie tegen elk middel een punt van zorg is. Dit videoartikel beschrijft een procedure voor het gelijktijdig testen van de antibioticaresistentie van M. tuberculosis tegen 12 verschillende microbiële geneesmiddelen. De mogelijkheid om antimicrobiële resistentie van M. tuberculosis snel te detecteren is daarom zeer belangrijk in de inspanning om de toename van resistente stammen te beheersen; hier wordt de antibioticasusceptibiliteit getest.M tuberculosis wordt eerst gekweekt op vaste media of in bouillonmedia, resulterend in een bacteriële suspensie. Het inoculum wordt klaargemaakt en toegevoegd aan een microtiterplaat met verschillende concentraties van 12 geneesmiddelen, waaronder eerstelijns- en tweedelijnsmedicatie. Na incubatie wordt de mate van groei in elke put handmatig bepaald met behulp van een spiegelkast of met een semi-automatische plaatlezer.De resulterende gegevens geven de minimale inhiberende concentratie voor elk getest geneesmiddel aan en laten zien tegen welke antibiotica de geteste TB-stam resistent is. Deze resultaten helpen bij het kiezen van het juiste geneesmiddel voor de behandeling van tb. Hallo, mijn naam is Nancy Ek en ik ben directeur van het Myco Bacteriology Laboratory aan de Mayo Clinic in Rochester, Minnesota.Vandaag beschrijven we een methode voor het uitvoeren van antibioticagevoeligheidstesten voor Mycobacterium tuberculosis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals macro-bouillonverdunning, is dat er voor elk geneesmiddel een MIC wordt bepaald en dat er 12 antibiotica gelijktijdig worden getest. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kurt Jude, een kwaliteitspecialist in mijn laboratorium, werkend aan een laboratoriumbank.Bereid deze procedure voor door een bloedagarplaat, drie Middlebrooks 7H10-platen, een buis met saline tween-glasparels en een microtiterplaat te labelen met de naam van de patiënt en het identificatienummer van het monster. Label daarnaast de bloedagar- en 7H10-platen als zuiverheid. Label één van deze 7H10-platen als 1:1 kolonietelling en de andere als 1:50 kolonietelling.Plaats vervolgens het dienblad in de doorgeefsluiz. Bereid u daarna voor om te werken in de biosafety level 3 (BSL-3) faciliteit door een jas met gesloten voorkant, een hoofdkap, handschoenen, schoenhoezen en een ademhalingsbeschermingsmiddel aan te trekken. Hier wordt een PAPR-ademhalingsapparaat gebruikt.Haal vervolgens de lade uit de sluis. Desinfecteer daarna, in de BSL-3 faciliteit, het oppervlak van de biologische veiligheidskast. Plaats vervolgens een met desinfectiemiddel doordrenkt papieren handdoekje in de kast, ongeveer zes inch van het luchtventilatiepaneel naast het papieren handdoekje.Zet inoculatiehaken, pipetteerders en tips, een geschikte afvalcontainer, een nephi, TER en een vortex klaar. Zodra de zuurkast is voorbereid, plaatst u het organisme op het papieren handdoekje samen met een rek met een McFarland 0.5 standaard, een seven H nine bouillon met OADC en een buisje met zoutoplossing-beads. Deze opstelling wordt uitgevoerd vanuit een vast medium.Bereid een inoculum voor vanuit een cultuur op een vast medium van een patiëntmonster. Gebruik een steriele lus om de kolonies af te schrapen en breng deze over in de glaskraalbuis met saline tween. Vortex de suspensie gedurende 30 tot 60 seconden.Inspecteer het monster visueel door het te vergelijken met de McFarland-standaard. De overgedragen hoeveelheid moet gelijk aan of groter dan de standaard zijn. Zo niet, voeg dan meer van het bacteriële monster toe en vortex opnieuw.Zodra de McFarland-standaard is bereikt, laat u het inoculum 15 minuten bezinken zodat grotere klonten bacteriën naar beneden zakken. Gebruik vervolgens een nefi TER om de dichtheid van de gesuspendeerde bacteriën naar nul te meten. De nephi ter.Plaats eerst een blanco zoutoplossing-kralenbuis in de nephi ter. Druk op de kalibratieknop om het instrument op nul te stellen, plaats vervolgens de McFarland 0,5-standaard in de Nephi ter en druk opnieuw op de kalibratieknop. Zodra het instrument is gekalibreerd, verwijdert u de McFarland-standaard en plaatst u het inoculum.De aflezing van het inoculum moet gelijk zijn aan de aflezing van de McFarland-standaard. Als de aflezing te laag is, haal dan de buis eruit en breng meer bacteriën van de plaat over. Vortex vervolgens en lees het monster opnieuw af.Als de aflezing te hoog is, voeg dan saline tween toe aan de buis en vortex deze. Lees het monster vervolgens opnieuw af. Blijf het inoculum naar behoefte aanpassen totdat de bacteriële concentratie overeenkomt met de McFarland-standaard.Gebruik vervolgens een 200 µL pipet en een lange aerosolbestendige pipetpunt om 100 µL inoculum uit het bovenste derde deel van de buis te verwijderen. Om te voorkomen dat klontjes naar de bodem van het Middlebrook 7H9-bouillon zakken, wordt het geïnoculeerde bouillon langzaam 20 seconden gevortext om het inoculum uit te platen. Begin met het uitpakken van de microtiterplaat uit de verpakking van de fabrikant. Als het droogmiddel blauw is of als de folieverpakking beschadigd is, mag deze niet worden gebruikt.De plaat bevat al de 12 antimicrobiële middelen die in elke put getest moeten worden, inclusief de meest effectieve of eerstelijnsmiddelen en tweedelijnsmiddelen. Giet het inoculum van de H nine-bouillon voorzichtig in een buis, waarbij u er op let dat er geen aerosolen ontstaan. Plaats vervolgens de microtiterplaat met het label naar buiten, zoals hier getoond, en gebruik een 12-kanaals pipetteerder om 100 µL van het inoculum aan elke put toe te voegen.Bereid vervolgens de platen voor om kolonietellingen uit te voeren. Bereid eerst een onverdunde plaat voor door een ene microliter loop monster van de positieve controleput over te brengen naar de 7 H 10-plaat met het label één op één. Gebruik daarna de loop om de plaat uit te strijken zoals hier wordt getoond.Bereid vervolgens een verdunning van 1:50 door een loop van 1 µL vanuit de put van de positieve controle over te brengen en deze te mengen in de buis met 50 µL water. Streken vervolgens 1 µL van deze verdunning uit op de plaat met het label 1:50. Inoculeer de zuiverheidsplaten door 50 µL van het inoculum uit het bouillon over te brengen op correct gelabelde bloedagar- en 7H10-platen en streken deze uit voor isolatie.Stapel vervolgens een andere trth bovenop de geïnoculeerde trth en plaats deze voorzichtig in de afvalbak. Breng een klevende afdichting aan op de microtiterplaat. Druk vervolgens, met behulp van de witte achterzijde, stevig op elke well om een adequate afdichting te garanderen, waarbij u erop let dat er geen kreukels ontstaan.Desinfecteer de microtiterplaat door deze af te nemen met een papieren handdoek gedrenkt in een tuberculocidaal desinfectiemiddel. Plaats de microtiterplaat vervolgens in een plastic zak en sluit deze af met een hittezegeling. Desinfecteer tot slot alle materialen, inclusief de pipetspunt-filters, vortex, platen en buizen, door ze af te nemen met een tuberculocidaal desinfectiemiddel.Hier wordt pro spray gebruikt nadat er voldoende tijd is verstreken om desinfectie te garanderen. 15 minuten voor pro spray. De platen worden afgeplakt met plakband, in plastic zakken geplaatst, en de verzegelde benodigdheden worden uit de biologische veiligheidskast gehaald en in de sluis geplaatst.De rode afvalzak wordt op dit punt gesloten en afgesloten met een twist-tie, waarna de jas, overschoenen en handschoenen worden uitgetrokken. Ga vervolgens naar de sluis en was de handen; verwijder daarna het ademhalingsapparaat, desinfecteer dit en berg het op. Was de handen opnieuw, trek een schone jas aan en verlaat de BSL-3 suite. Vervolgens wordt de afvalcontainer geautoclaveerd.Incubeer vervolgens de microtiterplaat en de zeven H 10- en bloedagarplaten rechtop in de incubator bij 35 tot 37 °C met 5 tot 10% CO2 in het BSL-2 laboratorium. Dit is acceptabel omdat de plaat goed is afgesloten en zich in een plastic zak bevindt. De generatietijd van Mycobacterium tuberculosis is ongeveer 12 tot 24 uur, dus het zal minstens een week duren voordat groei zichtbaar is als de vorming van een celpellet onderin de controleput. Voer op dag 10 een handmatige MIRERA-uitlezing uit door de afgesloten AST-microtiterplaat op het platform van de MIRERA-box te plaatsen.Gebruik een bureaulamp om de visualisatie van de groei te ondersteunen en pas deze naar behoefte aan om het beste contrast te verkrijgen. Controleer de groeicontroleputjes, in dit geval H 11 en H 12, door in de spiegel te kijken. Als er sprake is van groei, zal het putje troebel lijken of sediment vertonen, zoals hier wordt getoond.Als er geen groei is, zoals in dit voorbeeld, zal de well er helder uitzien. Plaats de plaat in dat geval terug in de incubator en zet de incubatie voort voor maximaal 21 dagen. Vergelijk voor elke conditie de groei met de controle.Vervolgens is voor elk geneesmiddelrecord de eerste verdunning zonder groei de minimale inhiberende concentratie of MIC van het geneesmiddel. Om de resultaten met een geautomatiseerde platenlezer zoals de Vision te onderzoeken, begint u met het openen van de MycoTB AST-platensoftware en het inloggen; plaats de verzegelde plaat met de barcode naar buiten gericht. Zoals hier getoond, verschijnt groei als troebeling of als een neerslag van cellen op de bodem van een putje op het computerscherm.Controleer eerst de groeicontroles. Zoals voorheen. Als er geen groei is waargenomen, plaats de plaat dan opnieuw in de incubator voor maximaal 21 dagen.Als dit positief is, worden de resultaten geregistreerd door voor elk geneesmiddel op het scherm de eerste put aan te raken die geen groei vertoont. In sommige gevallen precipiteren bacteriën, sediment of geneesmiddelen naar de bodem van de put. Dit fenomeen, bekend als trailing, wordt gekenmerkt door meerdere putten met een pellet van dezelfde grootte en wordt niet beschouwd als daadwerkelijke positieve groei.Vervolgens worden de zeven H 10- en bloedagarplaten onderzocht om de bacteriële concentraties te bepalen en de zuiverheid te beoordelen. De bloedagarplaat mag na 48 uur geen groei vertonen. Groei op de bloedagarplaat duidt op contaminatie met snelgroeiende bacteriën.Indien er groei is, moet de microtiter-test worden herhaald. De plaat met H 10 zuiverheid zou groei van één organisme moeten vertonen. Type EM tuberculosis moet beige van kleur, rimpelig en ruw verschijnen. Bij contaminatie moet de microtiter-test worden herhaald vanaf een zuivere cultuur.Om de bacteriële concentratie te beoordelen, telt u de kolonies op de H 10-plaat van zeven. Bereken vervolgens de koloniegetallen met behulp van de tabel in het bijbehorende geschreven document. Mycobacterium tuberculosis is gekweekt uit een patiëntensample en de antibioticaresistentie is beoordeeld zoals beschreven in deze video; op de hier getoonde plaat zijn 12 verschillende geneesmiddelen aanwezig in toenemende concentraties, met de hoogste concentraties bovenaan en de laagste concentraties onderaan.De minimale inhiberende concentratie, of MIC van het geneesmiddel, werd aangegeven door de laagste concentratie van het middel die geen groei vertoonde en is omcirkeld in de hier getoonde afbeelding aan de hand van gestandaardiseerde breekpunten vastgesteld door het Clinical and Laboratory Standards Institute. De hier getoonde gegevens suggereren dat deze TB-stam resistent zal zijn tegen Isid en Rifampine. In vitro suggereren de hoge MIC-waarden waargenomen bij verschillende andere geneesmiddelen, waaronder oin, moxifloxacine, streptomycine en rifabutine, de resistentie van de EM-tuberculosestam tegen deze middelen.De MIC-resultaten dienen te worden gebruikt door een infectieziektespecialist met ervaring in de behandeling van tuberculose om een individueel behandelplan op te stellen. Wanneer de techniek onder de knie is, duurt het opzetten van één isolaat ongeveer 40 minuten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat dit een respiratoire pathogeen is en dat er aerosolen kunnen ontstaan. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het opzetten van antimicrobiële gevoeligheidstesten voor Mycobacterium tuberculosis met behulp van de micro-bouillonverdunningsmethode. Vergeet niet dat werken met Mycobacterium tuberculosis extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals ademhalingsbescherming, altijd moeten worden genomen waar dat vereist is.

antimicrobial-susceptibility-testing-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De microscopische observatie-drug-gevoeligheid (MODS) test is een low-cost, low-tech tool voor high-performance detectie van tuberculose (TB) en multiresistente tuberculose (MDRTB). Deze video beschrijft de MODS vloeistof mediacultuur methode.

De MODS methode voor de diagnose van tuberculose en multidrug-resistente tuberculose

Mycobacterium tuberculosis vormt drug tolerant biofilms wanneer gekweekt in bepaalde omstandigheden. Hier beschrijven werkwijzen voor het kweken M. tuberculose biofilms en het bepalen van de frequentie van de drug tolerante persisters. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor verdere studies naar de mechanismen van tolerantie in M. tuberculose.

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Source: Koeth, L. M., et. al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the broth microdilution method for determining the minimum inhibitory concentration (MIC) of a lipoglycopeptide antibiotic against Gram-positive bacteria. It covers bacterial colony isolation, dilution, inoculation of microplate wells with varying antibiotic concentrations, and verification of culture...

A Broth Microdilution Method for Antibiotic Susceptibility Testing of Gram-Positive Bacteria

This video demonstrates an assay to evaluate the efficacy of drugs against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. An in vitro infection model containing Mtb/macrophage aggregates is generated that mimics in vivo infection. Upon introducing suitable antibiotics, their efficacy is tested via resuzarin assay to monitor the survival of bacteria with increasing drug concentrations.

An Assay to Evaluate Drug Efficacy against a Mycobacterium tuberculosis Infection Model

This video demonstrates an in-broth assay to determine antibiotic efficacy against Mycobacterium tuberculosis. The bacterial culture is incubated with different concentrations of a bactericidal antibiotic. The bactericidal efficacy is measured by assessing the presence of viable bacteria using a resazurin assay.

Evaluating the Effectiveness of a Test Compound against Mycobacteria in Broth

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose

Hier presenteren we een protocol om potentiële anti-tuberculose-geneesmiddelkandidaten te identificeren via fenotypische screening, waaronder de chemische synthese van een 4-aminoquinolineverbinding, het bepalen van de minimale remmende concentratie tegen Mycobacterium tuberculosis en de beoordeling van de cytotoxiciteit in zoogdiercellijnen.

Identificatie van potentiële anti-TB-kandidaten: Een stapsgewijze gids voor synthese, MIC-bepaling en cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellen

Leer antimicrobiële gevoeligheidstesten van Mycobacterium tuberculosis met microtiterplaatmethode voor 12 geneesmiddelen tegelijk. Deze procedure bepaalt MIC-waarden voor effectieve behandeling.

Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat Format (Video) | JoVE Journal

Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat Format

Meer video's verkennen