Het genereren en onderhouden van astrosferen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen

Begin met een ECM-gecoate plaat en zaai clusters van humane pluripotente stamcellen in een groeimedium dat Rho-kinaseremmers bevat.

ECM verbetert de celaanhechting, terwijl de remmers Rho-kinasen blokkeren, apoptotice celafsterving voorkomen en celapovervloed en -proliferatie bevorderen.

Introduceer een neuraaal differentiatiemedium om differentiatie van stamcellen in neurale stamcellen te induceren.

Behandel met een losmaakmiddel; de enzymen in deze oplossing degraderen de ECM en celaanraking, waardoor de cellen worden losgemaakt.

Breng ze over naar een niet-gecoate fles met Rho-kinaseremmers.

De remmers vergemakkelijken celapovervloed en spontane aggregatie in driedimensionale structuren of sferoïden.

Voeg de sferoïden een groeifactorrijk neuraaal differentiatiemedium toe, waardoor neurale stamcellen kunnen differentiëren in astrocytenvoorlopercellen en astrosferen kunnen vormen.

Voeg regelmatig een losmaakmiddel toe om de astrosferen in kleinere clusters te dissociëren. Dit zorgt ervoor dat voedingsstoffen de binnencellen van de sfeer bereiken en hun levensvatbaarheid behouden.

Houd de astrosferen in een vers medium voor de voorlopercellen om uit te groeien tot astrocyten.

Begin met het zaaien van clusters van hPSC's in 2 milliliter hPSC-medium met de Rho-kinaseremmer Y-27632 in elke put van een ECM-gecoate zes-putsplaat. Houd de stamcellen in stand tot ze ongeveer 50% confluërend zijn. Verander dan het medium in neuraaal medium met SP-431542 en DMH1 om neurale inductie te bevorderen.

Wanneer de cellen ongeveer 95% confluërend zijn, verdeel elke put 1-op-6 in nieuwe ECM-gecoate putten. Op dag 14, dissocieer de cellen met losmaakmiddel, en breng de inhoud van elke put over naar een niet-gecoate T-25 fles met medium dat Y-27632 bevat om de vorming van aggregaten te bevorderen.

Om astrocytenvoorlopercellen en astrocyten in spontaan gevormde 3D-aggregaten te genereren, schakel over naar neuraaal medium met EGF en FGF2 en voer elke drie tot vier dagen totdat de astrocytenidentiteit op vier tot zes maanden is bevestigd.

Standaard produceert dit protocol dorsale corticale astrocyten. Astrocytensubtypen kunnen echter regionaal worden gespecificeerd door de toevoeging van patroonvormende morfogenen indien gewenst.

Eenmaal per week, wanneer donkere centra verschijnen, verzamel de sferen door centrifugatie, en dissocieer vervolgens voorzichtig de H-astro-aggregaten met losmaakmiddel. Plaats alleen die sferen terug die niet spontaan hechten om het passeren van niet-CNS en niet-neurale cellen te voorkomen.