Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

Het algemene doel van deze procedure is om de gedetailleerde morfologie van dendritische arborisatie-neuronen in drosophila-larven te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen, deze te laten rijpen en GFP-gelabelde genetische klonen te genereren via hitte-shock-geïnduceerde lipase-expressie. De tweede stap bestaat uit het selecteren van larven met fluorescerende neuronale klonen en het maken van een afbeelding van hun dendritische ABA's.

Na het in beeld brengen van de lava worden ze gedisseceerd, gefixeerd en immunogekleurd, zodat ze gemonteerd kunnen worden en hun dendritische havens en axonale terminale morfologieën kunnen worden gevisualiseerd via confocale immunofluorescentiemicroscopie. Vandaag demonstreer ik een protocol voor morfologische analyse van sula lagere perifere sensor OID's en exonen met behulp van genetische mos. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neuro-ontwikkeling, zoals wat de genetische programma's zijn die de neurale identiteit, dendritische orale vorm en externe bedrading controleren?

Begin dit protocol door embryo's te verzamelen op appelsapagarplaten. De hittestress wordt toegediend in een waterbad van 38 °C, waarbij de duur varieert afhankelijk van de genetica van het embryo en de gewenste grootte van de klonen. Genereer voor dit protocol markum-klonen uit embryo's met een pand dendritische arborisatie-neuron driver. Bewaar de marker-embryo's voor de hittestress gedurende twee uur bij 25 °C, omringd door vochtige weefsels.

Bereid de verzamelplaten voor op de hittebehandeling door ze onderdompelbaar te maken met behulp van lege platen en parafilm. Voer vervolgens een hittebehandeling van een uur uit op de marker-embryo's om kleine klonen of labeling van enkele neuronen te genereren. Om het aantal klonen te vergroten, kan een verlengde hittebehandeling worden gebruikt door 45 minuten in het bad te incuberen, gevolgd door 30 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens nogmaals 30 minuten in het bad.

Om flipout-klonen te genereren, worden embryo's gedurende 24 opeenvolgende uren verzameld. Dit protocol maakt gebruik van een klasse vier specifieke driver. Onderwerp de flipout-embryo's aan een hitteshock gedurende een uur na de hitteshock.

Plaats de opvangplaten in een Petrischaal van 10 centimeter, omringd door vochtige weefsels en kweekmedium. Houd de embryo's tijdens de embryonale kweek op 25 degrees Celsius, monitor deze en vul de gistpasta aan indien nodig, aangezien voeding een kritieke invloed heeft op de neuronale ontwikkeling.

Houd de cultuur in stand totdat de dwalende derde instar-larven kunnen worden verzameld. Spoel de derde instar-larven kort en voorzichtig af met kraanwater en breng ze over naar een agarplaat. Onderzoek de larven vervolgens met een krachtige fluorescentie-dissectiemicroscoop en insectpincetten. Identificeer de larven met GFP-positieve neuronen in de lichaamswand en breng deze over naar een plaatglas met een kuipje met een druppel 80% glycerol.

Plaats een dekglas op het preparaatglas om de larve te immobiliseren. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven tussen de larve en het dekglas. Gebruik standaard confocale microscopie om de neuronen van belang door de cuticula van de larve te visualiseren.

Om de positie van de lava te wijzigen voor een betere kijkhoek, kan er voorzichtig op het dekglas worden gedrukt om de lava te laten rollen. Begin dit protocol door een lava met een insectpincet over te brengen naar de SIL-beveiligingsplaat. Zet deze vervolgens vast met spelden aan de anterieure en posterieure uiteinden.

Voeg vervolgens calciumvrije HL 3.1 buffer toe. Snijd nu halverwege beide uiteinden van de lava loodrecht op de anterieur-posterieure as. Snijd daarna langs de middellijn tussen de twee tracheae.

Snijd voorzichtig elke individuele trachea-verbinding met de lichaamswand door voordat u het darmkanaal voorzichtig verwijdert. Zo blijven de segmentale zenuwen tussen het PNS en het CNS intact. Terwijl de larve nog op de cell guard-plaat is vastgepind, wordt deze 20 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd in 4% paraformaldehyde in PBS op een langzaam roterende shaker; voer elke dissectie uit in minder dan vijf minuten.

Anders zullen de neurieten van de dendritische autorisatie-neuronen beginnen te degraderen. Verwijder na de fixatie overtollig larvenweefsel. Was de filets vervolgens drie keer met PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt.

Incubeer de larven na het wassen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in blokkeringsoplossing onder zachte schudding. Vervang na voltooiing van de blokkering de blokkeringsoplossing door de primaire antilichaamoplossing. Plaats het monster in de kleine plastic container omringd door vochtige tissues en incubeer dit een nacht bij vier graden Celsius. Zet de incubatie de volgende dag voort gedurende nog een uur bij kamertemperatuur.

Was daarna het lava-fillet zes keer in PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt. Voeg nu het secundaire antilichaam toe en plaats de fillets in een donkere container om fotobleking van de Fluor te voorkomen. Incubeer de fillets gedurende enkele uren bij kamertemperatuur of overnight bij vier graden Celsius, gevolgd door één uur bij kamertemperatuur.

Was de filets tot slot zes keer in PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt. De weefsels zijn vervolgens klaar om gemonteerd te worden. Om de axonterminalen te visualiseren, monteert u de larvale filet simpelweg met de cuticulazijde naar beneden in 80% glycerol op een holpreparaat.

Om duidelijkere beelden van dendrieten te verkrijgen, wordt een permanent preparaat gemaakt met PLL-gecoate dekglasjes. Om de dekglasjes te coaten, wordt een aliquot PLL gebruikt. Vul dit aan tot 10 milliliters dubbel gedestilleerd water en voeg 20 microliters Kodak photo flow toe.

Dompel de dekglasjes gedurende 30 minuten onder in de PLL-oplossing en laat ze na verwijdering aan de lucht drogen. Spoel ze vervolgens kort af met water en lucht. Droog ze opnieuw.

Herhaal dit proces twee keer. Beginnend bij het PLL-bad, blijven de behandelde dekglasjes ongeveer een maand houdbaar. Monteer nu een gedissecteerde larvale fillet met de spierzijde naar beneden in een druppel PBS op een PLL-dekglasje.

De fillet zal snel aan het dekglas hechten met behulp van een stukje vloeipapier. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof, maar laat het preparaat niet volledig uitdrogen. Dehydrateer vervolgens de larvale fillets in een reeks ethanolbaden van 10 minuten, beginnend met 35% ethanol, gevolgd door 50%, daarna 70%, vervolgens 95%, dan 100% en tot slot een tweede ethanolbad van 100%.

Volg de ethanolbaden met twee of drie baden van 10 minuten in xyleen. Plaats vervolgens een druppel DPX op een schoon objectglas en zet het dekglas voorzichtig in de DPX door het met de zijde die in contact komt eerst te plaatsen. Bewaar het objectglas in het donker en wacht één dag tot de DPX is uitgehard.

Voordat het weefsel wordt afgebeeld met in vivo- en focale microscopie, is het mogelijk om beelden zoals deze vast te leggen. De volledige arborisatie van een dendritisch neuron van klasse vier. Dit is een close-up van een dendritische arborisatie van een met IHC gelabeld neuron van klasse drie dat correct is gefixeerd om de morfologie te behouden.

De inzet toont de degradatie die kan optreden na een mislukte dissectie en fixatie. Deze overlay toont een enkele axonterminus van klasse vier in het CZS. Het axon is gelabeld met anti-GFP in het groen en alle axontermini van klasse vier zijn gecokleurd met anti-CD2 in magenta.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat monsters snel gedisseceerd en gefixeerd moeten worden door axonen van de periferie naar het CZS te volgen. Het is nuttig om in gedachten te houden dat PNS-neuronen in elk lichaam segmentaal projecteren naar het cognitieve segment van de ventrale zenuwcode. Bovendien, als u alleen dendrieten wilt visualiseren, verwijdert u de CNA's tijdens de dissectie; de kleuring kan dan in buisjes worden uitgevoerd in plaats van op plaatjes.

Bij het monteren van deze filets voor dendrietbeeldvorming dient u eerst de kop af te snijden met mondhaken en het posterieure deel met sparkles. Voor een plezierpreparatie.