Name: Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Leer de morfologie van Drosophila-larven dendritische arborisatieneuronen visualiseren met GFP-gelabelde genetische mozaïeken. Deze methode helpt onderzoekers genetische programma's te bestuderen die neurale identiteit en uitwendige bedrading reguleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken RIKEN voor financiering. We danken ook Cagri Yalgin, Caroline Delandre, en Jay Parrish voor discussies over genetische en immunohistochemie protocollen.

1.Preparation van reagentia <ol><li> Bereid Ca + +-vrij HL3.1 zoutoplossing 28. <ol><li> In mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sucrose, trehalose en 5, pH 7,2. Filter steriliseer en bewaar bij 4 ° C. Let op: Ca + +-vrije oplossing voorkomt dat spiercontractie tijdens de dissectie. </li></ol></li><li> Maak poly-L-lysine (PLL) dekglaasjes. <ol><li> Los 100mg PLL in 4.2ml water en vul aan 300μl porties in Eppendorf buizen en invriezen bij -20 ° C. </li><li> Voor het coaten dekglaasjes, eerste dooi een aliquot, breng het aan 10 ml in DDH 2 O en voeg 20μl van Kodak Photo-Flo, de uiteindelijke PLL concentratie 0,7 mg / ml. </li><li> Dompel coverslips voor 30 minuten in de PLL-oplossing, te verwijderen en droog, daarna even afspoelen met water en droog. Tweemaal herhalen. Behandelde coverslips duren ongeveer een maand. </li></ol></li></ol> 2. Genetische kruizen <ol><li> To genereren MARCM klonen. Hier is een voorbeeld kruis met behulp van een pan-DA driver 11,27: FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP; tub-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li> Voor het genereren van Flp-out klonen. Hier is een voorbeeld kruis met behulp van een klasse IV-specifieke driver 8: PPK-Gal4 x yw, hsFLP, UAS-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8:: GFP </li></ol> 3. Winnen van embryo&#39;s <ol><li> Houden Drosophila kruisen in een collectie fles bij 25 ° C en het verzamelen van embryo&#39;s op een appelsap agarplaat 29 verspreid dit met een dun laagje gist pasta 30,31. </li></ol> 4. Heat shock behandeling van embryo&#39;s <ol><li> Plaats een leeg bord in tegenstelling tot de appelsap agarplaat waarop de embryo&#39;s zijn gelegd. Afdichting rond deze twee platen met Parafilm (afb. 2). </li><li> Tijdens de heat shock, onderdompelen ee plaat in het waterbad en houd deze ingedrukt met behulp van een metalen gewicht. </li><li> Voor MARCM embryo&#39;s <ol><li> Verzamel embryo&#39;s voor 2h en incuberen in een 10 cm petrischaal omringd door vochtige weefsels bij 25 ° C voor een extra 2u. Let op: Aanpassen van de heat shock protocol verandert de frequentie waarmee klonen worden gegenereerd. </li><li> Voor een kleiner aantal klonen, met als doel voor enkele geïsoleerde neuronen, onderdompelen en heat shock in het water bad voor 1 uur bij 38 ° C. </li><li> Voor een groter aantal klonen, heat shock voor 45 min bij 38 ° C, weer terug bij RT 30 minuten, dan heat shock voor een extra 30 minuten. </li></ol></li><li> Verzamel Flp-out embryo&#39;s voor 24 uur, en heat shock voor 1 uur bij 38 ° C. </li></ol> 5. Screening voor het klonen <ol><li> Na de heat shock, verwijder het deksel van de waterdichte indeling en plaats de appelsap agarplaat in een 10 cm petrischaal, omringd door vochtige weefsels. Cultuur van de embryo&#39;s en de daaropvolgende larven bij 25 ° C tot dwalening 3 rd instar. Let op: kweekomstandigheden, in het bijzonder voeding, is aangetoond dat DA dendritische prieel morfologie 32,33 veranderen. Zorg ervoor dat de groeiende larven toegang tot de gist plakken te allen tijde, te controleren en aanvullen van de gist plakken als nodig is. </li><li> Vanaf dit punt in het protocol verder, manipuleren larven zachtjes met insect pincet. </li><li> Kort en voorzichtig spoel de larven in het leidingwater, en plaats vervolgens op een agarplaat. Opmerking: Deze stap reduceert achtergrondgeluiden auto-fluorescentie uit voedsel of vuil op de larvale oppervlak. </li><li> Onderzoek de larven onder een krachtige microscoop fluorescentie dissectie. Identificeer larven met GFP-positieve neuronen / cellen in het lichaam muur. </li></ol> 6. In vivo beeldvorming van dendrieten <ol><li> Plaats de larve in een depressie glijden glas met een kleine daling van 80% glycerol. Plaats een dekglaasje op dia om de larve te immobiliseren. Zorg ervoor dat er geen lucht blijft tussen de larve en de coverslip. </li><li> Duw de dekglaasje aan de larve rollen naar visualisatie van het neuron van belang mogelijk te maken. Het imago van de mCD8:: GFP-gelabelde dendritische prieel via confocale microscopie. </li></ol> 7. Larvale dissectie Let op voordat u begint: DA neuron dendrieten degraderen snel na de start van dissectie. Ontleden elke individuele larve in minder dan 5min om goede dendriet morfologie te verzekeren. <ol><li> Ontleden zwervende 3 e instar larven op een Sylgard plaat zoals eerder 34 beschreven met de volgende wijzigingen: <ol><li> Voor de beeldvorming van DA neuron axon termini, ervoor te zorgen dat het centrale zenuwstelsel intact is en de segmentale zenuwen zijn niet gebroken. Na het openen van de larven, eerst zorgvuldig knip de tracheale verbindingen met het lichaam muur en verwijder voorzichtig de gehele darm. </li><li> Als beeldvorming van de dendrieten alleen, verwijder de CNS om een ​​vlakkere montage. </li></ol></li></ol> 8. Fixation en het blokkeren van larvale filets <ol><li> Met de larve nog vastgemaakt aan de Sylgard plaat, fix it in 4% PFA in PBS gedurende 20 minuten bij KT op een licht draaiende shaker. </li><li> Verwijder de sporen van de larvale weefsels (vet lichaam, luchtpijp, etc.) na fixatie. </li><li> Was in PBST (PBS met 0,1% Triton X-100) 3x 10 minuten op de Sylgard plaat en shaker. Als het onderzoek axon termini, houdt u de filet op de Sylgard plaat. (Als vlekken dendrieten is het mogelijk om de larvale filets over te dragen aan een 0.5 ml buis bij deze stap 34) </li><li> Blokkeer de larven voor 20 minuten bij RT in 5% normaal serum ezel (NDS) in PBST op een shaker. </li></ol> 9. Kleuring van larvale filets <ol><li> Verwijder de blokkering oplossing en incubeer in het primair antilichaam (in 5% NDS / PBST) overnacht bij 4 ° C in een klein Tupperware container, omringd door vochtige weefsels. </li><li> Haal de buizen van 4 ° C en incubeer een extra uur bij RT. </li><li> Was 6x 10 minuten in PBST. Voeg de secundaire ANTIBODY (in 5% NDS / PBST), en de dekking fluorofoor foto-34 bleken te voorkomen. </li><li> Incubeer hetzij bij RT gedurende twee uur, of overnacht bij 4 ° C, gevolgd door een uur bij RT. </li><li> Was de larven 6x 10 minuten in PBST en ga verder met montage. </li></ol> 10. Montage van larven filets voor het onderzoek van de dendriet prieel <ol><li> Mount elke larvale filet zo plat mogelijk met behulp van het ontleden van een schaar of een scalpel af te snijden van het hoofd (inclusief de mond haken), en de achterste (inclusief de siphonen) 34. </li><li> Plaats de larvale filet op de dia nagelriem naar beneden, de berg in 80% glycerol, en verzegelen de zijkanten van het dekglaasje met nagellak voor een &#39;snelle&#39; mount 34. </li><li> Voor een permanente montage en een duidelijker beeld <ol><li> Plaats de ontleed larvale filet spier-kant naar beneden op een daling van PBS op een PLL dekglaasje, zal het snel houden aan de dekglaasje aan. </li><li> Verwijder zoveel vloeistof als mogelijk na de montage, however niet laat het dan volledig opdrogen. </li><li> Neem de dekglaasje (met aangesloten larven filet), door middel van een ethanol-reeks: 35% ethanol, gevolgd door 50%, 70%, 95%, en tot slot 2x 100% ethanol elk gedurende 10 minuten (de 2e 100% EtOH-oplossing vaak moet worden gewijzigd ) en ten slotte, was 2-3x 10 minuten in xyleen. </li><li> Doe een druppel DPX inbedmiddel (Distyrene weekmakers Xyleen) op een schoon objectglas en zorgvuldig leg de dekglaasje filet-side-down op de top. Houden in het donker, en wacht een dag voor de DPX te stellen voor beeldvorming. </li></ol></li></ol> 11. Montage van larven filets voor het onderzoek van de axon eindpunten <ol><li> Houd de segmentale zenuwen lopen tussen de PNS en de CNS intact tijdens de dissectie, fixatie en kleuring om de tracering van de axonen van de perifere sensorische neuron cellichaam naar de VNC. </li><li> Mount elke filet larvale cuticula-kant naar beneden in 80% glycerol in een depressie glijden. Trace van de axonen van de DA cellichaam naar deVNC onder de confocale microscoop. Let op: PNS neuronen in elk lichaam muur segment project om de cognate segment van de VNC. </li></ol> 12. Representatieve resultaten: Representatieve resultaten worden getoond in figuren 3-5. Fig. 3 toont de gehele prieel van een klasse IV da neuron, gevangen in vivo onder de confocale microscoop. Fig. 4 toont een close-up van een deel van de dendriet prieel van een immunohistochemisch label klasse III neuron dat correct is bevestigd aan de morfologie behouden. De bijbehorende inzet toont de degradatie die kan optreden na een mislukte dissectie en fixatie (beide gekleurd met anti-GFP antilichaam). Fig. 5 toont een enkele klasse IV axon eindpunt in het centraal zenuwstelsel (anti-GFP, groen), alle klasse IV termini zijn co-gekleurd met anti-CD2 (magenta). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg" /> Figuur 1 Protocol overzicht. a) dan verzamelen en hitte-shock embryo&#39;s. b)<html> Selecteer een larve met een GFP-positieve DA neuron kloon, en vervolgens het imago van de GFP-gelabelde dendrietmorfologie prieel in de live larve. c) ontleden de larve, en dan immunohistochemisch vlekken op de filet. d) Monteer de gekleurde filet, en vervolgens het imago van de dendritische prieel en de axonale projecties van de DA neuron klonen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg" /> Figuur 2 Opstelling van het appelsap agarplaat voor warmte-shock. Neem de plaat (witte pijl, ab), voeg een tweede petrischaal op de top (rode pijl b), en afdichting rond met Parafilm (blauwe pijl, b). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg" /> Figuur 3 in vivo beeld van de dendriet prieel van een mCD8:: GFP-gelabelde MARCM kloon (genotype als in punt 2.1) die een klasse IV (v&#39;ada) neuron van een 3 e instar larve. Schaal bar is 50μm. d/3111/3111fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4 mCD8:: GFP-gelabelde MARCM kloon van een klasse III neuron (ddaA) gekleurd met anti-GFP antilichaam, met een goede morfologie na succesvolle dissectie en fixatie (groen). De inzet toont dendriet degradatie (witte pijlen) die na mislukte dissectie en fixatie (magenta). Schaal bar is 25μm. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg" /> Figuur 5 De 3 e larvestadium larvale VNC. Een Flp-out kloon van een enkele klasse VI (VDAB) axon terminus (genotype als in 2.2) wordt gedetecteerd met behulp van anti-GFP antilichaam (groen). Anti-CD2 labels alle klasse IV termini (magenta). Schaal bar is 25μm.

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315, 232-242 (2008).</li>
<li>Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Knot%2FCollier%2C+a+transcriptional+regulator+of+the+EBF%2FOlf-1+family%2C+endows+the+Drosophila+sensory+system+with+neuronal+class-specific+elaborated+dendritic+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns.</a> Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43, 809-822 (2004).</li>
<li>Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BTB%2FPOZ-zinc+finger+protein+abrupt+suppresses+dendritic+branching+in+a+neuronal+subtype-specific+and+dosage-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent.</a> 43, 823-834 (2004).</li>
<li>Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+specification+of+axonal+arbors%3A+atonal+regulates+robo3+to+position+terminal+branches+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system.</a> Neuron. 37, 41-51 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrites+of+distinct+classes+of+Drosophila+sensory+neurons+show+different+capacities+for+homotypic+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion.</a> Curr Biol. 13, 618-626 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112, 805-818 (2003).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li>
<li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).</li>
<li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington%27s+Disease-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Larval+CNS+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Merritt, D. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+sensory+neurons+in+the+Drosophila+embryo+correlate+with+sensory+modality%2C+soma+position%2C+and+proneural+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function.</a> J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+representation+of+the+glomerular+map+in+the+Drosophila+protocerebrum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum.</a> Cell. 109, 229-241 (2002).</li>
<li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen%3A+origins%2C+dendritic+morphology%2C+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural Dev. 4, 37-37 (2009).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+Embryonic+Nervous+System+in+Whole-mount+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li>
<li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De Drosophila larven DA neuron model biedt een uitstekend genetisch systeem om mechanismen te onderzoeken die de controle neuron morfologie en circuit vorming. MARCM wordt meestal gebruikt voor de etikettering en voor het genereren van mutant DA neuron klonen. Voor MARCM we gebruik van zowel een pan-neurale (bijv. Gal4 C155) of DA neuron-specifieke driver. Met behulp van een pan-neuraal driver is het mogelijk om direct gebruik maken van verschillende bestanden op grote schaal beschik...

<table border="1"><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> SZX16 fluorescentie microscoop dissectie (met GFPHQ filter) </td><td> Olympus </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> Live-Insect Forceps </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm x 76mm depressie slide glas </td><td> Toshinriko Co </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (of Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P-1524 </td><td> Dit product heeft bewezen het meest effectief </td></tr><tr><td> DPX afdekmedium </td><td> Sigma </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> Konijn anti-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> Verdunning 1:500 </td></tr><tr><td> Rat anti-CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td> Verdunning 1:200 </td></tr><tr><td> Muizen anti-CD2 </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA443R </td><td> Verdunning 1:700 </td></tr><tr><td> Muizen anti-Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> Verdunning 1:10 </td></tr></table>

morfologische analyse van de drosophila larvale perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische mozaïeken

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Ontwikkeling van het zenuwstelsel vereist de juiste specificatie van neuron positie en identiteit, gevolgd door nauwkeurige neuron class-specifieke dendritische ontwikkeling en axonale bedrading. Onlangs heeft de dendritische arborization (DA) sensorische neuronen van de Drosophila larven perifere zenuwstelsel (PNS) zijn geworden krachtige genetische modellen waarin zowel het algemene als klasse-specifieke mechanismen van neuron differentiatie toe te lichten. Er zijn vier belangrijke DA neuron klassen (I-IV) 1. Ze zijn genoemd in volgorde van toenemende complexiteit dendriet prieel, en hebben klasse-specifieke verschillen in de genetische controle van hun differentiatie 2-10. De DA sensorische systeem is een praktisch model om de moleculaire mechanismen achter de beheersing van de dendritische morfologie 11-13 te onderzoeken omdat: 1) het kan profiteren van de krachtige genetische tools beschikbaar in de fruitvlieg, 2) de DA neuron dendriet prieel spreidt zich uit in slechts twee dimensies onder een optisch cleAR larvale cuticula waardoor het gemakkelijk is om te visualiseren met een hoge resolutie in vivo, 3) de klasse-specifieke verschillen in dendritische morfologie maakt een vergelijkende analyse te vinden belangrijke elementen regelen van de vorming van eenvoudige versus sterk vertakte dendritische bomen, en 4) dendritische prieel stereotype vormen van de verschillende DA neuronen te vergemakkelijken morfometrische statistische analyses. DA neuron activiteit wijzigt de output van een schaal voor het voortbewegen centrale patroon generator 14-16. De verschillende DA neuron klassen hebben verschillende zintuiglijke modaliteiten, en hun activering ontlokt verschillende gedragsreacties 14,16-20. Verder verschillende klassen sturen axonale projecties stereotiep in de Drosophila larven centrale zenuwstelsel in het ventrale zenuw kabel (VNC) 21. Deze projecties beëindigen met topografische voorstellingen van zowel de DA neuron sensorische modaliteit en de positie in het lichaam wand van de dendritische veld 7,22, 23. Vandaar dat onderzoek van de DA axonale projecties kunnen worden gebruikt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan topografische kaarten 7,22,23, evenals de bedrading van een eenvoudige schakeling modulerende larvale motoriek 14-17 toe te lichten. We presenteren hier een praktische gids voor het genereren en analyseren van genetische mozaïeken 24 markering DA neuronen via MARCM (Mosaic-analyse met een Repressible Cell Marker) 1,10,25 en Flp-out 22,26,27 technieken (samengevat in Fig. 1).

De dendritische arborization sensorische neuronen van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale perifere zenuwstelsel zijn bruikbare modellen zowel het algemene als neuron klasse-specifieke mechanismen van neuron differentiatie toe te lichten. We presenteren een praktische gids voor het genereren en analyseren van dendritische arborization neuron genetische mozaïeken.

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

De ontwikkeling van het zenuwstelsel vereist de correcte specificatie van de positie en identiteit van neuronen, gevolgd door nauwkeurige, neuronklasse-specifieke dendritische...

Het algemene doel van deze procedure is om de gedetailleerde morfologie van dendritische arborisatie-neuronen in drosophila-larven te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen, deze te laten rijpen en GFP-gelabelde genetische klonen te genereren via hitte-shock-geïnduceerde lipase-expressie. De tweede stap bestaat uit het selecteren van larven met fluorescerende neuronale klonen en het maken van een afbeelding van hun dendritische ABA's.Na het in beeld brengen van de lava worden ze gedisseceerd, gefixeerd en immunogekleurd, zodat ze gemonteerd kunnen worden en hun dendritische havens en axonale terminale morfologieën kunnen worden gevisualiseerd via confocale immunofluorescentiemicroscopie. Vandaag demonstreer ik een protocol voor morfologische analyse van sula lagere perifere sensor OID's en exonen met behulp van genetische mos. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neuro-ontwikkeling, zoals wat de genetische programma's zijn die de neurale identiteit, dendritische orale vorm en externe bedrading controleren?Begin dit protocol door embryo's te verzamelen op appelsapagarplaten. De hittestress wordt toegediend in een w

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Source: Ting, C., et al., Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure of preparing a Drosophila brain, capturing horizontal and frontal image stacks of GFP-labeled medulla dendrites under a confocal microscope, and creating a 3D reconstruction to analyze their morphology across layers and columns.

Analyzing Dendritic Morphology Across Drosophila Medulla Layers and Columns

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)...

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.

Verwijdering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Spier Weefsel van Larvale Filets voor Immunofluorescentie Analyse van sensorische neuronen en opperhuidcellen

Twee beeldanalyse algoritmen, "Drosophila NMJ Morfologie" en "Drosophila NMJ Bouton Morfologie" zijn gemaakt, automatisch kwantificeren negen morfologische kenmerken van de Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ).

Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromusculaire Junction morfologie

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Dit protocol is gericht op kwantitatieve analyse van complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila, die kan worden gebruikt voor studies van dendritische morfogenese.

Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila

Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren de axonale richt met een TL proteïne in volwassen benen van Drosophila door fixatie, montage, imaging en na imaging stappen.

Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

Hier bieden we protocollen om drie eenvoudige door verwondingen veroorzaakte axondegeneratie (axondood) tests in Drosophila melanogaster uit te voeren om het morfologische en functionele behoud van afgehakte axonen en hun synapsen te evalueren.

Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster

Leer de morfologie van Drosophila-larven dendritische arborisatieneuronen visualiseren met GFP-gelabelde genetische mozaïeken. Deze methode helpt onderzoekers genetische programma's te bestuderen die neurale identiteit en uitwendige bedrading reguleren.

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken (Video) | JoVE Journal

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

Meer video's verkennen