Selectie van Plasmodium falciparum Parasieten voor Cytoadhesion Human Brain endotheelcellen

Het algemene doel van deze procedure is het selecteren van Plasmodium falciparum-parasieten op basis van hun binding aan humane cerebrale endotheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst een cultuur van Plasmodium falciparum-parasieten, bestaande uit een mengsel van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde rode bloedcellen, te incuberen met een laag humane cerebrale endotheelcellen. De volgende stap is het uitwassen van niet-geïnfecteerde en niet-gebonden rode bloedcellen door meerdere malen te wassen met cultuurmedium. Vervolgens worden verse rode bloedcellen toegevoegd om verdere groei van de parasietenpopulatie mogelijk te maken.

De laatste stap, enkele weken later, is het herhalen van de algemene selectie zodra een voldoende aantal parasieten is bereikt. Ten slotte wordt microscopie gebruikt om aan te tonen dat een grote hoeveelheid parasieten gebonden is aan HBE five i. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van cerebrale malaria, zoals de identificatie van parasietliganden of gastheerreceptormoleculen die betrokken zijn bij het cyto-endurantieproces.

Bereid menselijke rode bloedcellen voor uit groep O positief volbloed door de rode bloedcellen van de witte bloedcellen te scheiden middels passage door een leukocytenfilter. Centrifugeer de cellen bij 1000 G gedurende 10 minuten en resuspendeer het pellet in PMI Incomplete medium.

Herhaal deze wasstap nogmaals en resuspendeer vervolgens het pellet. In ons PMI-onvolledige medium bij 50% hematocriet worden rode bloedcellen een week lang bewaard bij vier graden Celsius. Kweek Odium Valspar-geïnfecteerde rode bloedcellen.

Vul aan met RPMI-volledig medium bij een hematocriet van 2% en incubeer dagelijks bij 37 °C met 3% koolstofdioxide, 1% zuurstof en 96% stikstof. Maak een Giemsa-uitstrijkje om het ontwikkelingsstadium van de parasieten te beoordelen. Verschoon het medium dagelijks door de cultuur vijf minuten te centrifugeren bij 500 G.

Het supernatant wordt ongeveer eens per week afgezogen en vervangen door vers compleet RPMI-medium. Synchroniseer de parasieten door behandeling met een waterige oplossing van 5% sorbitol. De selectie-assay kan de dag na een ringstadiumcultuur met een minimale parasitemie van 5% tot 10% worden uitgevoerd.

Daarnaast is per 60 millimeter schaal met hbe five eye-cellen voldoende parasietcultuur nodig om een P-celvolume van 30 microliter te vormen. Bereid een 60 millimeter weefselkweekschaal voor om de humane cerebrovasculaire endotheelcellijn of H back fivei te ontvangen door twee microgram per centimeter squared fibronectine en steriele zoutoplossing aan de schaal toe te voegen.

Incubeer de schaal bij 37 °C gedurende vijf tot 20 minuten en aspireer vervolgens de fibronectine-oplossing. Oogst daarna de HBE five I-cellen uit een weefkolf van 25 cm² door ionisatie en centrifugatie, en resuspendeer de celpellet in 10 ml DMEM, compleet medium. Voeg vervolgens 1,5 ml van deze celsuspensie toe aan de met fibronectine behandelde weefkweekschaal en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende twee tot drie dagen, totdat de cultuur een confluentie van 50 tot 100% bereikt; op de dag van de assay zijn de parasietculturen klaar voor cyto aian.

De HBE 5-cultuur moet een confluentie van 50 tot 100% hebben. De parasietencultuur moet zich in het stadium van gepigmenteerde trofozoïeten bevinden, met ten minste 5 tot 10% parasieten en 2% hematocriet. Pipetteer eerst 1,5 milliliter van de parasietencultuur uit de kweekfles en breng dit over naar een centrifugebuis van 15 milliliter.

Centrifugeer de cultuur bij 500 G gedurende vijf minuten en resuspendeer in 10 milliliters vers bereid warm incompleet DMEM-medium. Herhaal deze wasstap een tweede keer nadat de laatste centrifugatie is voltooid.

Resuspendeer het pellet van 30 µL in 1,5 mL DMEM onvolledig medium, aangevuld met 1% BSA. Haal vervolgens de 60 mm schaal met hvac.Five op.

Aspireer het kweekmedium van de oogcellen en was deze tweemaal met drie milliliter DMEM onvolledig medium. Voeg de parasietenoplossing toe aan de schaal met HPE5-oogcellen en incubeer in de weefselkweekincubator gedurende in totaal 75 minuten.

Resuspend de parasieten tweemaal tijdens de incubatie door de schaal na de incubatie voorzichtig te wiegen en te draaien. Was de schaal vijf keer door het medium af te zuigen met een plastic pasteurpipet en drie milliliter warm onvolledig DMEM-medium toe te voegen; wieg de plaat na de laatste wasbeurt vervolgens voorzichtig en onderzoek de schaal onder een omgekeerde microscoop. Indien er nog veel niet-geïnfecteerde rode bloedcellen zichtbaar zijn, herhaal dan de bovenstaande wasprocedure om deze te verwijderen.

Nadat het medium uit de schaal is geaspireerd, wordt 40 µL gepakt celvolume van verse rode bloedcellen gesuspendeerd in voorverwarmd compleet RPMI-medium en wordt de celsuspensie aan de schaal toegevoegd. Plaats de schaal in een luchtdichte incubatiekamer. Gas vervolgens de schaal gedurende drie minuten met 3% koolstofdioxide, 1% zuurstof en 96% stikstof.

Plaats de kamer vervolgens gedurende de nacht in een incubator bij 37 °C. Tijdens deze incubatie knappen de schizont-stadia van de parasieten open en infecteren merozoïten de rode bloedcellen. Oogst de volgende dag de ringstadia van de parasieten door middel van wassing.

Met RPMI onvolledig medium op een soortgelijke wijze als voorheen, maar met krachtiger pipetteren van het medium en schudden van de plaat. Bewaar al het gebruikte medium, dat resuspenderde rode bloedcellen bevat, in een conische buis van 15 milliliter. Controleer de plaat onder een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat alle rode bloedcellen uit de centrifugeplaat zijn verwijderd.

Gooi het supernatant weg uit de buis met het medium van de gewassen plaat om de parasieten te pelletteren. Resuspendeer in vijf milliliters RPMI compleet medium en plaats het mengsel in een vierkante kolf van 25 centimeter voor cultivatie. De parasieten worden twee tot vier weken gekultiveerd totdat er voldoende materiaal is verkregen en een nieuwe selectieronde kan worden uitgevoerd.

Niet-geselecteerde HB three-parasieten vertonen een geringe mate van binding aan hbe five-endotheelcellen. Deze afbeelding toont hbe five-endotheelcellen gefixeerd met 2% glutaraldehyde en gekleurd met giemsa, gevisualiseerd onder de microscoop bij een 1000-voudige vergroting; de opnames zijn gemaakt nadat niet-geïnfecteerde rode bloedcellen en unbound geïnfecteerde rode bloedcellen waren weggewassen. Na elke selectieronde binden steeds meer parasieten aan de endotheelcellen en de selecties kunnen na vijf selectierondes in kortere tijdsintervallen worden herhaald.

Parasietpopulaties met een hoge bindingscapaciteit worden verkregen zoals hier wordt getoond met HB three HBE-parasieten. Deze tabel geeft een overzicht van de plasmodium alspar-stammen die succesvol zijn geselecteerd voor binding aan HE five. Ik merk op dat HB three ook werd geselecteerd op TNF-geactiveerde HE five I na vijf selectierondes.

De DD twee-stam vertoonde geen toename in binding aan HBE vijf I in vergelijking met niet-geselecteerde DD twee. Deze afbeelding bij een 400-voudige vergroting toont de binding van plasmodium alspar HB drie-parasieten aan HD MEK dermale endotheliale cellen vóór selectie. Hier wordt de binding van plasmodium alspar HB drie-parasieten aan dezelfde dermale endotheliale cellijn getoond na vier selectierondes.

Deze figuur toont de binding van Plasmodium spar HB3-parasieten aan HP ME-pulmonale endotheelcellen vóór selectie. De binding van Plasmodium spar HB3-parasieten aan de H HP ME-cellen is nu toegenomen na vier ronden van selectie. Hoewel het cultuurmedium voor hd e, C en H HP EC enigszins verschilt, was het gebruikte selectieprotocol identiek aan dat voor hbe 5 I. Na deze procedure kunnen methoden zoals RT-PCR of micro-analyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het karakteriseren van de transcriptie van variant surface antigen in niet-geselecteerde en geselecteerde parasieten.