Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio's voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling
13 november 2011
RNA-expressieprofilering van discrete muis-hersengebieden vereist een nauwkeurige en herhaalbare strategie voor weefselverzameling. Een protocol dat zowel coronaire hersseparering als door een weefselkernboor gesteunde microdissectie gebruikt, wordt hier beschreven. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters wordt verkregen, bevestigt de bruikbaarheid van de beschreven methode.
Het algemene doel van deze procedure is om totaal RNA te verzamelen van discrete hersenkernen op een herhaalbare, consistente, kosteneffectieve en RNA-vrije manier. Dit wordt bereikt door eerst een RNA-vrije werkomgeving voor te bereiden en het hele brein uit een onthoofde muis te verwijderen. Vervolgens wordt een micrometer-gestuurde weefselsnijder gebruikt om gelijkmatig gedimensioneerde seriële weefselsecties te snijden.
Vervolgens worden hersengebieden van belang microdissecteerd met behulp van een weefselkern met een vaste diameter, terwijl het weefsel in een RNA-vrije mediumomgeving wordt gehouden. Ten slotte wordt totaal RNA geïsoleerd uit de verwijderde hersenkernen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die voldoende totaal RNA-opbrengst en kwaliteit vertonen voor downstream cDNA-bibliotheekvoorbereiding en transcriptoomprofilering door middel van spectrafotometrische of fluorometrische assays.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals grove anatomische of laser capture microscopie-ondersteunde hersengebiedexcisie, is dat meerdere discrete hersengebieden van belang kunnen worden verzameld van een individueel muizenbrein op een herhaalbare en kosteneffectieve manier. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het neurowetenschappelijke veld, zoals of verschillende transcriptexpressieprofielen binnen hersengebieden die geen neuronale circuits bevatten, gecorreleerd kunnen worden met bepaalde gedragseigenschappen, omgevingsreacties en/of ziektetoestand. Om voorbereiding voor microdissectie te verrichten, supplementeert u 100 milliliter Earl's gebalanceerde zout oplossing of EBSS met 0,44 gram natriumbicarbonaat en 0,884 gram glucose.
Behandel de EBSS met 0,1 milliliter DEPC in een autoclaveerbare fles of kolf met een schroefdop gedurende minimaal 12 uur. Bij 37 graden Celsius. Plaats vijf en drie kwart inch glazen pipetten in een glazen beker van één liter en plaats kunstenaarsborstels met de borstels omhoog gericht in een glazen gradueercilinder van 100 milliliter.
Voeg voldoende DEPC-behandelde wateroplossing toe om de pipetten en borstels te bedekken. Bedek de beker en gradueercilinder met aluminiumfolie en incubeer gedurende minimaal 12 uur bij 37 graden Celsius. Na de 12 uur durende incubatie met DEPC, verhit alle DEPC-behandelde materialen tot een temperatuur hoger dan 100 graden Celsius gedurende minimaal 15 minuten. Koel af. De EBSS bij kamertemperatuur voordat u deze opslaat bij vier graden Celsius.
Giet het DD H2O uit de beker en gradueercilinder en blijf ze incuberen op een temperatuur hoger dan 100 graden Celsius tot de materialen droog zijn. Verwijder ze uit de incubator, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur en bewaar ze voor later gebruik. Op de dag van het experiment, behandel alle werkoppervlakken om RNA-besmetting te verwijderen. Plaats en onderhoud de EBSS in een waterbad ingesteld op 40 graden Celsius om te bufferen en te zuurstofverzadigen.
De EBSS infiltreer het met 5%CO2 en 95% zuurstof door gasslangen in een RNA-vrije weidepijp te plaatsen. En plaats de pijp in de EBSS en bedek de opening van de EBSS-container. Stel een weefselsnijder in voor seriële secties van het hersenweefsel.
Behandel de boven- en onderkant van de weefselsnijder. Om RNA-besmetting te verwijderen, bevestig een rechthoekig stuk watman Nummer vier, filterpapier aan het plexiglasoppervlak van de weefselsnijder. Bevestig een dubbelzijdig scheermesje aan de chopperarm.
Stel de micrometer op nul en pas de minimale hoogte van de chopperarm aan om de scheermesjes te laten snijden door het filterpapier, maar niet door de plexiglasplaat. Verzamel alle aanvullende materialen die nodig zijn voor de microdissectie, inclusief RNA-vrije 60 bij 15 millimeter celcultuur schotels, weefsel cos 200 microliter RNA-vrije micropipetpunten, gebogen schaar, droog ijs en buizen voor weefselcollectie. Plaats de buizen op droog ijs nadat u een muis hebt onthoofd met behulp van een knaagdier guillotine en het hele brein met zowel de achterhersenen als de optische zenuwen intact verwijderd.
Plaats het brein op de bovenkant van een 60 bij 15 millimeter RNA-vrije celcultuur schotel. Breng het vervolgens over naar het weefselmonsteroppervlak. Gebruik een RNA-vrije pijp om het filterpapier aan de weefselsnijder bevochtigd met EBSS conservatief te bevochtigen.
Bevochtig het hersenweefsel met EBSS. Breng het brein over naar de weefselsnijder en positioneer het met de ventrale oppervlakte rustend op het filterpapier. De middellijn loodrecht op de chopperblad en de rostrale rand van het brein tegen het blad.
Gebruik een A-D-E-P-C-behandelde kunstenaarsborstel om het brein stationair te houden door lichte druk uit te oefenen op het dorsale oppervlak van het brein terwijl het brein stationair wordt gehouden. Til de bladhouderhendel ongeveer vier tot vijf centimeter boven het dorsale weefseloppervlak en houd deze in deze positie. Verwijder de borstel van het breinoppervlak en draai naar 750 micrometer.
Gebruik de micrometer. Laat de hendel zakken om het weefsel te snijden en een 750 micrometer coronale sectie te maken terwijl het chopperblad stationair blijft. Gebruik een rollende beweging met de kunstenaarsborstel om voorzichtig de weefselsectie weg te vegen van het bladoppervlak.
Plaats onmiddellijk de weefselsectie in het zuurstofverzadigde EBSS in de petrischaal. Deze snede is nu klaar voor microdissectie. Herhaal de snijproceduur totdat seriële hersensecties zijn verkregen over de hele rostrale codale vlak om microdissectie uit te voeren.
Controleer eerst de verlichting om ervoor te zorgen dat de belichting van het monster niet wordt belemmerd. Pas de positie en stroming van het O2 CO2-mengsel aan om een gebufferd gezuurstoffrijk milieu voor het weefsel te behouden. Tijdens de procedure, identificeer de coronale hersensectie die het gebied van belang omvat en richt deze met behulp van een kunstenaarsborstel vlak op de bodem van de petrischaal.
Selecteer de weef
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor RNA-expressieprofilering in specifieke hersenregio's van muizen, met de nadruk op een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. De methode combineert coronale hersensecties met microdissectie met behulp van een weefselstanser om totaal RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Moleculaire biologie
- RNA-profilering
Achtergrond
- RNA-expressieprofilering is cruciaal voor het begrijpen van de hersenfunctie.
- Discrete hersenkernen vereisen een zorgvuldige dissectie voor een nauwkeurige analyse.
- Het handhaven van een RNase-vrije omgeving is essentieel voor de integriteit van het RNA.
- Eerdere methoden verdienden het aan consistentie en reproduceerbaarheid.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol vast te stellen voor RNA-extractie uit hersengebieden van muizen.
- Om een hoog rendement en een hoge kwaliteit van RNA te waarborgen voor downstream applicaties.
- Om transcriptoomprofilering te faciliteren door verbeterde methoden voor weefselcollectie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een RNase-vrije werkomgeving.
- Decapitatie en verwijdering van de gehele hersenen van de muis.
- Uniform snijden van hersenweefsel met een micrometer-gestuurde weefselsnijder.
- Microdissectie van doelgerichte hersengebieden met gebruik van een weefselkern in een RNA-vrij medium.
Belangrijkste resultaten
- Een hoge opbrengst aan totaal RNA werd verkregen uit de gedissecteerde hersenkerne.
- De kwaliteit van het RNA werd bevestigd als geschikt voor de preparatie van een cDNA-bibliotheek.
- De resultaten ondersteunen de bruikbaarheid van de methode voor transcriptoomprofilering.
- Analyses toonden aan dat de RNA-kwaliteit voldoende was voor downstream toepassingen.
Conclusies
- Het beschreven protocol biedt een betrouwbare aanpak voor RNA-extractie.
- Het verbetert de consistentie en kwaliteit van RNA-monsters uit hersengebieden van muizen.
- Deze methode is nuttig voor toekomstig neurowetenschappelijk onderzoek waarbij RNA-analyse betrokken is.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze microdissectieaanpak maakt een reproduceerbare isolatie van totaal RNA met een hoog rendement mogelijk uit specifieke hersengebieden van muizen, waardoor een belangrijk knelpunt bij de validatie van targets in de neurowetenschappen wordt weggenomen, waar lage RNA-opbrengsten uit laser capture microscopy transcriptoomprofilering belemmeren. Door een consistente RNA-kwaliteit te leveren die geschikt is voor next-generation sequencing, ondersteunt de methode het mechanische de-risking van CNS-targets en verbetert ze het voorspellende vertrouwen in vroege discovery-workflows. Het positioneert zich als een schaalbaar, kostenefficiënt alternatief voor genexpressiestudies in specifieke hersengebieden bij preklinische targetbeoordeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door RNA te isoleren uit specifieke hersenkernen, om zo transcriptexpressie te correleren met de functie van neuronale circuits en gedragstypische fenotypes.
- Operationele waarde: Maakt herhaalbare en kostenefficiënte monsterafname mogelijk uit meerdere afzonderlijke regio's per muis, waardoor het aantal gebruikte dieren wordt verminderd en de doorvoer voor risicoreductie van targets wordt verhoogd.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert totaal RNA met voldoende opbrengst en zuiverheid voor downstream RNA-Seq en qRT-PCR, wat een betrouwbare assay-ontwikkeling mogelijk maakt voor genexpressie-screening in hersenweefselmodellen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van RNA-isolatie met magnetische beads die compatibel is met high-throughput workflows, wat standaardisatie over screeningcampagnes heen ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert ziekterelevante transcriptomische profilering in muismodellen, wat aansluit bij translationele inspanningen voor de ontdekking van biomarkers bij neuropsychiatrische en neurodegeneratieve aandoeningen.
- Operationele waarde: Waarborgt de RNA-integriteit door RNase-vrije protocollen, waardoor de reproduceerbaarheid in longitudinale preklinische studies en de vergelijkbaarheid van gegevens tussen laboratoria wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypothesen tot aan de identificatie van lead-verbindingen, waarbij nauwkeurige RNA-profilering van hersengebieden de selectie en prioritering van doelwitten ondersteunt voorafgaand aan de preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalroutes en biologische risicoreductie door transcriptomische vergelijkingen mogelijk te maken tussen verschillende hersengebieden die gekoppeld zijn aan specifieke neurale circuits.
- Screening: Levert gestandaardiseerde RNA-inputs die geschikt zijn voor kwantitatieve screening van genexpressie, wat de reproduceerbaarheid in target engagement-assays verbetert.
- Analytics: Genereert hoogwaardig RNA voor spectrofotometrische en fluorometrische kwantificering, waardoor nauwkeurige input-normalisatie mogelijk wordt voor sequencing en PCR-gebaseerde toepassingen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt expressieprofilering in de ontdekkingsfase met preklinische continuïteit door ziekterelevante transcriptomische gegevens te leveren uit gedefinieerde hersengebieden.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor weefselcollectie en RNA-isolatie dat toepasbaar is op meerdere neurowetenschappelijke projecten en target-klassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit te verminderen via nauwkeurige expressiegegevens die specifiek zijn voor hersengebieden.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via RNase-vrije workflows en minimale handmatige verwerkingstijd (8–10 minuten per monster).
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van meerdere regionale monsters uit één dier, waardoor de kosten verbonden aan methoden met een lage opbrengst die amplificatie vereisen, worden verlaagd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde targetprioritering door betrouwbare transcriptoomgegevens te leveren voor go/no-go-beslissingen bij het ontdekken van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel (CNS).
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neuroanatomie en RNase-vrije technieken om de integriteit van de monsters tijdens dissectie en RNA-extractie te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot een micrometer-gestuurde weefselhakker, weefselponsjes met een vaste diameter en RNA-isolatiekits op basis van magnetische beads.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor een RNase-vrije omgeving binnen teams om consistentie in de RNA-kwaliteit tussen verschillende studies te garanderen.
- Aanpassing naar andere hersengebieden of soorten kan optimalisatie van de diameter van de weefselponsjes en de doorsnedeparameters vereisen.
- Praktische beperking: Handmatig weefselponsen kan de ultra-high-throughput toepassingen beperken in vergelijking met geautomatiseerde laser capture-systemen, hoewel het een superieure RNA-opbrengst biedt.
