Name: Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer geavanceerde fluorescentieconfocale microscopie om signaalgebeurtenissen tijdens chemotaxis te monitoren in Dictyostelium discoideum. Deze methode onthult ruimtelijk-temporele dynamica van GPCR-signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de intramurale fonds uit NIAID, NIH.

1. De voorbereiding van chemotactische competente cellen van Dictyostelium discoideum <ol><li> Voor het genereren van D. discoideum cellen die chemotactische aan de chemoattractant cAMP-, oogst-cellen groeien in D3-T rijke media van een trillende cultuur bij 22 ° C. </li><li> Twee keer wassen van de cellen in de niet-voedingsstoffen ontwikkeling buffer (DB buffer met 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgCl 2, en 0,1 mM CaCl 2). </li><li> Re-schorten cellen in DB buffer bij een dichtheid van 2x10 7 cellen / ml. </li><li> Schud 10 ml cellen in een 250 ml kolf bij 100 tpm bij 22 ° C gedurende een uur. </li><li> Lever 100 pi van 7,5 uM cAMP voorraad hebben voor de 10 ml cellen om de zes minuten over zes uur tot een uiteindelijke concentratie van 75 nM cAMP, een proces dat aangeduid als cAMP pulserende behandeling te realiseren. Na 5-6 uur van cAMP pulserende behandeling, D. discoideum cellen worden chemotactische bevoegde in de richting van cAMP verloop. </li><li> Verzamel cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 5 minuten en daarna resuspendeer cellen met DB buffer die 2,5 mM cafeïne, en schud bij 200 tpm bij 22 ° C gedurende 20 minuten aan cel basolate naar een chemotactische situatie. </li></ol> 2. Imaging chemotaxing cellen in een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattractant gradiënt <ol><li> Backfill een micropipet met een vers bereide 30 ul oplossing van 1 uM cAMP en Alexa 594 op 0.1μg/μl in DB buffer. </li><li> Bevestig de Femtotip om een ​​micropipet houder en sluit de slang aan op een druk leveren apparaat, Eppendorf FemtoJet systeem. </li><li> Bevestig de micropipet montage aan een micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) gemotoriseerde micromanipulator om een ​​constante druk te verstrekken om een ​​stabiele gradiënt vast te stellen. </li><li> Monteer een een-goed LabTek kamer gevuld met 6 ml van DB buffer meer dan een 40X olie lens op een confocale microscoop en gebruik van licht-field optiek, het centrum van de Femtotip in het gezichtsveld. </li><li> Schakel de druk van het aanbod en stel de vergoeding druk (Pc) voor 70 hPa tot een gradiënt van het cAMP / Alexa 594 mengsel vast te stellen. </li><li> Visualiseer cAMP gradiënt door het bewaken van het mengsel van de gewenste concentratie van cAMP en Alexa 594 fluorescentie excitatie met behulp van een 543 nm laser lijn. </li><li> Gebruik de auto-positionering functie van de micromanipulator om micropipet te maken aan de gewenste posities en ze in te stellen als positie 1, positie 2 en positie 3 tot en met het verloop om welke cel worden blootgesteld aan te manipuleren. </li></ol> 3. Immobiele ongepolariseerde cell imaging systeem vergemakkelijkt signalisatie gebeurtenissen die betrokken zijn bij cAMP gradiënt sensing <ol><li> Na de cafeïne de behandeling, het verwijderen van een hoeveelheid van cellen en centrifugeer bij 500g gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder de buffer en verdun cellen 5x10 5 cellen / ml met vers DB buffer met 2.5 mM cafeïne. </li><li> Breng 1 ml celsuspensie aan een single-kamer goed of 0,4 ml aan elke well van een vier-kamer goed. </li><li> Laat cellen om zich te houden gedurende 10 min, voorzichtig pipet uit de buffer om losse cellen te verwijderen en met hetzelfde volume te vervangen. </li><li> Zoek de gewenste cellen onder de microscoop en start beeldvorming. </li><li> Voor een experiment ontworpen om de dynamiek van signalering componenten in de cellen bloot te stellen aan een constante helling bewaken, te behandelen van de cellen met 5,0 uM (eindconcentratie) Latrunculin B gedurende 10 minuten voorafgaand aan de experimenten. </li></ol> 4. Gelijktijdige monitoring heterotrimere G-eiwit activering en PIP 3 productie <ol><li> cAMP pulserende ontwikkelen van cellen die co-expressie GαCFP en YFPGβ (G-cellen) en de cellen die PIP 3 indicator PH-GFP (PH-cellen) 7. </li><li> Vermeng deze twee soorten cellen met 1:1-verhouding en de plaat ze in een goed-of 4-kamers goed. </li><li> Maken en opslaan van de emissie-vingerafdruk referentiecurve CFP, GFP en YFP gebruik van Lambda Stack Overname mode binnen het spectrale bereik 464 tot 624 nm met een 10 nm breed. </li><li> Tegelijkertijd afbeelding G-eiwit activering in G-cellen en PIP 3 productie in PH cellen met behulp van met dezelfde Lambda Stack Overname mode binnen het spectrale bereik 464 tot 544 nm met een 10 nm stappen. </li><li> Van toepassing Lineair unmixing functie van Zeiss 510META software met behulp van opgeslagen CFPand YFP en emissie-vingerafdrukken wiskundig berekenen van de bijdrage van elke fluorofoor in de Lambda Stack voor het gemeenschappelijk visserijbeleid en YFP intensiteit in afzonderlijke kanalen in G. aparte </li><li> Met dezelfde strategie toe te passen Lineair unmixing functie met behulp van GFP zijn opgeslagen en de achtergrond emissie vingerafdrukken wiskundig berekenen GFP-intensiteit in PH-cellen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: <ol><li> Een uitstekend modelsysteem van D. discoideum voor GPCR gemedieerde chemotaxis. Een sociale amoebe, D. discoideum vertoont een opvallende chemotaxis gedurende de levenscyclus. Door zijn genetische en biochemische voordelen, D. d biedt een krachtige enystem naar chemotaxis te bestuderen. </li><li> Chemotaxis van de cellen onder een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattract velden. Hier hebben we eerst laten zien een eenvoudige methodologie om een lineair verband tussen cAMP concentratie en de intensiteit van een fluorescente kleurstof Alexa 594 door een verdunningsreeks van 2 uM cAMP gemengd met 10 ug / ml te verkrijgen Alexa 594 (Fig. 2A). Vervolgens bieden wij een eenvoudige manier om de gradiënt bovendien visualiseren,, om een ​​kwantitatieve meting van cAMP concentratie van een gradiënt vast te stellen door de intensiteit van de Alexa 594 (Fig. Fig. 2B). </li><li> Celbeweeglijkheid is ontkoppeld met cel polarisatie en directionele sensing. Een actine polymerisatieremmer elimineert reeds bestaande morfologische polariteit en voorkomt ook celbeweging met behoud van de cellen 'capaciteit van directionele sensing (Fig. 3A). Werkgelegenheid van zichtbare en manipuleerbaar cAMP stimulatie garandeert de ingang, bijvoorbeeld uniforme wijze wordt toegepast stimulaties of een verloop. Deze methode laat een kwantitatieve analyse van cAMP-geïnduceerde herverdeling van belangrijke signalering componenten in het verloop sensing machines. Gemeten spatiotemporele dynamiek van deze signaleringscomponenten ons in staat stellen te begrijpen hoe het signaleringsnetwerk aanpassing bereikt om een ​​uniforme prikkels, terwijl het genereren van gepolariseerd biochemische reacties op hellingen (Fig. 3B). </li><li> Systemische metingen van de kinetiek van chemosensing signaleringsnetwerk bij blootstelling aan een constante helling. Het is van cruciaal belang voor de dynamiek / kinetiek meten van directionele-sensing signaleringscomponenten om te begrijpen hoe elk onderdeel bijdraagt ​​aan de totstandkoming van intracellulaire polarisatie wanneer de cellen ervaren eerste gradiënt. Toepassing van live cell imaging met een hoge tempo-ruimtelijke resolutie, hebben we eerst tonen een bifasisch PIP 3 productie van de cel die is blootgesteld aan een constante cAMP gradiënt (Fig. 4A-C). Het toepassen van live-cell imaging, hebben we systematisch gemeten dynamiek van directionele-sensing specifieke signalering netwerk van cAMP stimuleren tot de productie PIP 3 (fig. 4D, E). </li><li> Gelijktijdige monitoring heterotrimere G-eiwit activering en PIP 3 productie op uniforme wijze worden toegepast cAMP stimulatie. Förster resonance energy transfer (FRET afgekort) biedt een efficiënte aanpak van heterotrimere G-eiwit activering (dissociatie) monitor bij de cAMP stimulatie. Hier beschreven we een handige easy-vast te stellen voor een gelijktijdige meting van heterotrimere G-eiwit activering en PIP 3 productie door het toezicht op de FRET verandering en membraan translocatie van PIP 3 sonde, PH-GFP in G en de PH-cellen, respectievelijk (Fig. 5 ). Een uniforme wijze wordt toegepast cAMP stimulatie veroorzaakt een aanhoudende G-eiwit activering, terwijl die leidt tot een voorbijgaande PIP 3 productie. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Een uitstekend modelsysteem van D. discoideum voor GPCR gemedieerde chemotaxis. A. Schema toont een korte signaalweg van directionele sensing. B. cAMP gradient induceert een snelle chemotaxis van D. discoideum cellen. Cellen brengen PIP 3 sonde, PH-GFP (groen). Gradiënt (rood) wordt gevisualiseerd door Alexa 594. Schaalbalk = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: chemotaxis van cellen onder een zichtbaar en manipuleerbaar chemoattract velden. A. grafiek toont een lineair verband tussen cAMP concentratie en de intensiteit van een fluorescente kleurstof Alexa 594 door een verdunningsreeks van 2 uM cAMP gemengd met 10 ug / mL Alexa 594. B. Kwantitatieve meting van cAMP concentratie van een gradiënt door de lineaire relatie van cAMP concentratie en de intensiteit van de fluorescente kleurstof Alexa 594 in A. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: Cell motiliteit is ontkoppeld met cel polarisatie en directionele sensing. A. Image blijkt dat onbeweeglijk cellen door de behandeling van actine polymerisatieremmer Latrunculin B behouden de mogelijkheid van directionele sensing. Cellen brengen PIP 3 sonde, PH-GFP (groen). Gradiënt (rood) wordt gevisualiseerd door Alexa 594. B. manipuleerbaar cAMP stimuleren en onbeweeglijk cel systeem maakt het mogelijk aan te pakken belangrijke vragen van directionele sensing. Schaalbalk = 10μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: Systemische metingen van de kinetiek van chemosensing signaleringsnetwerk bij blootstelling aan een constante gradiënt. A. Montage vertoont een bifasische PIP 3 productie (groen) van de cel die is blootgesteld aan een constante cAMP gradiënt (rood). B. Image geeft de regio's van de belangen (ROI) voor het meten van de kinetiek van PIP 3 de productie die in C. C . Kinetics of PIP 3 productie in de cellen blootgesteld aan een constante helling. D. schema toont het signaleringsnetwerk van directionele sensing van cAMP stimulatie om PIP 3 productie. Hun kinetiek bij blootstelling aan een constante gradiënt wordt gepresenteerd in dezelfde kleur vaste lijnen in E. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5: Gelijktijdige bewaking multi-gebeurtenissen van GPCR signalering netwerken. A. Schema toont gelijktijdige meting van heterotrimere G-eiwit activering en PIP 3 productie door het toezicht op de FRET verandering en membraan translocatie van PIP 3 sonde, PH-GFP in G en de PH-cellen, respectievelijk. B. Montage van de regenboog beelden van G-en PH-cellen shows dat een uniforme wijze wordt toegepast cAMP stimulatie veroorzaakt een aanhoudende G-eiwit geactiveerd op de mobiele randapparatuur, terwijl die jongeren een tijdelijke PIP 3 productie. De tijdstippen zijn voor (0s) en na stimulatie voor 4.9s, 10.2s en 20.4s. C. Kinetiek van de G-eiwit activering en PIP 3 de productie op een uniforme wijze worden toegepast cAMP stimulatie.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
<li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li>
<li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li>
<li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li>
<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li>
<li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li>
<li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+3%27+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De processen van het bereiken van chemotactische bevoegde stadium van de cellen Voor wild-type D. discoideum cellen, het duurt ongeveer 5 ~ 6 uur pulserende ontwikkeling bij kamertemperatuur om ze te bewegen tot een goed chemotactische bevoegde fase waarin cellen weer een goed gepolariseerd cellulaire morfologie en de snelle celmigratie (afb. 1). Verschillende factoren, zoals de cAMP concentratie voor pulserende, temperatuur, en verschillende genetische achtergronden, van invloed kunne...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> D3-T Growth Media </td><td> KD Medische </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cafeïne </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alexa 594 </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cAMP </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT programmeerbare timer </td><td> ChronTrol Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 slangenpomp </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Platform rondschudapparaat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet microcapillaire druk aanbod </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Single-en vier-en Lab-Tek II dekglaasje kamers </td><td> Nalge Nunc International </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META of gelijkwaardig fluorescentiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td></td><td> een 40X 1.3 NA of 60X 1.4 NA olie DIC Plan-Neofluar objectief </td></tr><tr><td> Olympus x81 of gelijkwaardig </td><td> Olympus </td><td></td><td> Vereist een 100X 1,47 NA TIRF objectief </td></tr></tbody></table>

imaging g-eiwit gekoppelde receptor (gpcr)-gemedieerde signaling gebeurtenissen die controle chemotaxis van dictyostelium discoideum</em

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Veel eukaryote cellen kan detecteren hellingen van de chemische signalen in hun omgeving en migreren dienovereenkomstig 1. Deze begeleide cel migratie wordt genoemd als chemotaxis, die essentieel is voor de verschillende cellen om de uitvoering van hun functies, zoals handel in immuuncellen en patroonvorming van neuronale cellen 2, 3. Een grote familie van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s) detecteert variabele kleine peptiden, bekend als chemokines, naar cel migratie direct in vivo 4. Het uiteindelijke doel van chemotaxis onderzoek is om te begrijpen hoe een GPCR machines zintuigen chemokine gradiënten en controles gebeurtenissen die leiden tot chemotaxis signalering. Daartoe hebben we beeldvormende technieken te gebruiken, in real time, spatiotemporele concentraties van chemoattractants, cel-beweging in een helling van chemoattractant, GPCR gemedieerde activering van heterotrimere G-eiwit, en intracellulaire signalisatie gebeurtenissen die betrokken zijn bij chemotaxis van eukaryote cellen 5-8 . De eenvoudige eukaryotische organisme, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic gedragingen die vergelijkbaar zijn met die van de leukocyten, en D. discoideum is een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen van eukaryote chemotaxis. Als vrij levende amoeben, D. discoideum cellen delen in rijk medium. Bij de honger, cellen binnen te dringen een ontwikkelingsstoornis programma waarin ze totaal door cAMP gemedieerde chemotaxis naar multicullular structuren te vormen. Veel onderdelen die betrokken zijn bij chemotaxis naar het kamp zijn geïdentificeerd in D. discoideum. De binding van cAMP aan een GPCR (car1) induceert dissociatie van heterotrimere G-eiwitten in Gγ en Gβγ subeenheden 7, 9, 10. Gβγ subeenheden activeren Ras, die op hun beurt activeert PI3K, PIP 2 omzetting in PIP 3 op het celmembraan 11-13. PIP 3 dienen als bindingsplaatsen voor eiwitten met pleckstrin Homologie (PH) domeinen, waardoor werven deze eiwitten aan het membraan 14, 15. Activering van car1 receptoren controleert ook het membraan verenigingen van PTEN, die PIP 3 dephosphorylates aan PIP 2 16, 17. De moleculaire mechanismen zijn evolutionair geconserveerd in chemokine GPCR-gemedieerde chemotaxis van menselijke cellen zoals neutrofielen 18. Wij presenteren volgende methoden voor het bestuderen van chemotaxis van D. discoideum cellen. 1. Voorbereiding van chemotactische component cellen. 2. Imaging chemotaxis van cellen in een cAMP verloop. 3. Het bewaken van een GPCR geïnduceerde activatie van heterotrimere G-eiwit in een levende cellen. 4. Imaging chemoaantrekkende-triggered dynamische PIP 3 antwoorden in enkele levende cellen in real time. Onze ontwikkelde beeldvormende technieken kunnen worden toegepast op chemotaxis van menselijke leukocyten te bestuderen.

We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

Veel eukaryote cellen kunnen gradiënten van chemische signalen in hun omgeving detecteren en migreren dienovereenkomstig 1. Deze gestuurde celmigratie wordt aangeduid als ...

Het algemene doel van deze procedure is om geavanceerde fluorescentie-confocale microscopie toe te passen om de spatiotemporele dynamiek van signaleringsgebeurtenissen tijdens chemosensing in dictyostelium discoideum-cellen te monitoren. Eerst worden chemotactisch competente dictyostelium discoideum-cellen voorbereid. Vervolgens wordt een gecontroleerde chemoattractant-gradiënt afgebeeld om een lineair verband vast te stellen tussen de concentratie van de chemoattractant en de fluorescentie-intensiteit van de chemoattractant. De derde stap is het verkrijgen van een immobiel cellsysteem voor het afbeelden van signaleringsgebeurtenissen die betrokken zijn bij de detectie van de cyclisch AMP-gradiënt.De laatste stap is het gelijktijdig monitoren van twee G PCR R-gecontroleerde signaleringsgebeurtenissen in levende cellen: heterotrimere G-proteïne-activatie en PIP drie-productie. Uiteindelijk kunnen spatiotemporele veranderingen in fluorescentie-intensiteiten in individuele cellen die worden gestimuleerd met een chemoattractant, worden gevisualiseerd via live-cell imaging met geavanceerde confocale microscopie van Cyclic A MP.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om spatio-temporele informatie over signaleringsgebeurtenissen in levende cellen te verkrijgen. Deze live-cell metingen maken een beter begrip mogelijk van hoe het A-G-P-C-R signaleringsnetwerk in staat is om een chemo-attractant bestanddeel te detecteren en om适当 responsen te genereren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Shu, een expert in live-cell imaging methoden. Om Dictyostelium-cellen te genereren die chemotactisch zijn voor de chemo-attractant cyclic AMP, worden cellen geoogst die groeien in HL5-medium uit een schudcultuur bij 22 °C.Was de cellen tweemaal in een voedingsarme ontwikkelingsbuffer door centrifugatie bij 400 Gs gedurende vijf minuten. Resuspendeer de cellen bij kamertemperatuur in de DB-buffer met een dichtheid van 2 × 10⁷ cellen per milliliter. Breng 20 miljoen cellen in 10 milliliter ontwikkelingsbuffer over naar een kolf van 250 milliliter, en schud de cellen vervolgens bij 100 RPM bij 22 °C gedurende één uur.Voeg vervolgens elke zes minuten 100 µL van de 7,5 µM cyclic AMP-stamoplossing toe aan de 10 mL cellen gedurende de volgende zes uur om een eindconcentratie van 75 nM cyclic AMP te bereiken. Verzamel nu de cyclic AMP-chemo-attractant-competente cellen door centrifugatie, ditmaal bij 200 ×g, en resuspendeer de cellen vervolgens in DB-buffer met 2,5 mM cafeïne. Schud de cellen opnieuw 20 minuten bij 22 °C, ditmaal bij 200 RPM, om de cellen te sensibiliseren voor chemotaxis.Vul eerst een micropipet bij met een vers bereide oplossing van 30 milliliter van één micromolar cyclisch AMP en Alexa 594 bij 0,1 micrograms per microliter in DB-buffer. Bevestig vervolgens een Femto-tip aan een micropipethouder en sluit de slang aan op een druktoevoerapparaat. Om een stabiele gradiënt te creëren, wordt de micropipetmontage bevestigd aan een gemotoriseerde micromanipulator.Vul een lab tech kamer met één put met zes milliliters DB-buffer en monteer de kamer vervolgens over een 40 x olie-lens op een confocale microscoop met behulp van Brightfield-optiek, waarbij de Femto-tip in het gezichtsveld wordt gecentreerd. Zet daarna de druktoevoer aan en stel de compensatiedruk in op 70 Hector Pascals om een gradiënt van het cyclic A MP Alexa 5 94-mengsel te creëren. Visualiseer de cyclic A MP-gradiënt door het mengsel van de gewenste concentratie cyclic A MP en Alexa 5 94-fluorescentie te monitoren met excitatie via een 543 nanometer laserlijn.Gebruik tot slot de automatische positioneringsfunctie van de micromanipulator om de micropipet op de gewenste posities te plaatsen en stel positie één, positie twee en positie drie in om de gradiënt waaraan de cellen worden blootgesteld te manipuleren. Verwijder na de cafeïnebehandeling een aliquot cellen en pellet de cellen bij 500 Gs gedurende drie minuten. Verwijder bij kamertemperatuur de buffer en verdun de cellen tot vijf keer 10^5 cellen per milliliter.Met verse DB-buffer bevatttend 2,5 millimolar cafeïne. Breng vervolgens één milliliter van de celsuspensie aan in een enkele well-kamer. Laat de cellen 10 minuten hechten, pipetteer daarna voorzichtig de buffer af om niet-gehechte cellen te verwijderen en vervang deze door hetzelfde volume verse DB-buffer met cafeïne om te beginnen met imagen; lokaliseer de gewenste cellen onder de microscoop.Vervolgens wordt de dynamiek van de signaleringscomponenten in cellen die aan een constante gradiënt zijn blootgesteld, gemonitord. Behandel de cellen gedurende 10 minuten voorafgaand aan de experimenten met vijf micromolar LA truculent B. Dit schema toont een kort signaleringspad van directionele waarneming in deze video.Het kan worden gezien hoe een cyclisch AMP-gradiënt een snelle chemotaxis induceert van D discost-cellen, cellen die de PIP drie-probe tot expressie brengen. P-H-G-F-P verschijnt in het groen. De gradiënt, zoals gevisualiseerd door Alexa 5 94, verschijnt in het rood.Een eenvoudige methode om een lineaire relatie te verkrijgen tussen de concentratie cyclisch AMP en de intensiteit van een fluorescente kleurstof. Een verdunningsreeks van 2 µM cyclisch AMP gemengd met 10 µg/mL Alexa 594 wordt getoond.Vervolgens wordt grafisch gedemonstreerd hoe een kwantitatieve meting van de cyclisch AMP-concentratie van een gradiënt op een eenvoudige manier kan worden vastgesteld aan de hand van de intensiteit van Alexa 594. Deze figuur laat zien hoe cellen waarvan de motiliteit is onderdrukt door latrunculine B, een actinepolymeriseremmer, hun vermogen tot directionele waarneming behouden. De cellen tot expressie brengen de PIP3-probe, PH-GFP en kleuren groen, terwijl de gradiënt in rood wordt gevisualiseerd door Alexa 594.In deze video is te zien hoe het gebruik van een niet-gepolariseerd, vereenvoudigd cellsysteem en manipuleerbare cyclisch AMP-stimulatie fundamentele vragen over directionele waarneming kunnen beantwoorden. Om de toepassing van live-cell imaging met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie te demonstreren, wordt hier een cel in het groen getoond die een bifasische expressie van PIP3 vertoont als reactie op blootstelling aan een gestage cyclisch AMP-gradiënt in het rood.Deze afbeelding toont de regio's van belang voor de meting van de kinetiek van PIP3-productie. De kinetiek van PIP3-productie aan de voorzijde en achterzijde van de cellen na blootstelling aan een constante gradiënt wordt hier gepresenteerd, waarbij de PIP3-productie aan de voorzijde en achterzijde respectievelijk in zwart en grijs zijn weergegeven. Door gebruik te maken van live-cell imaging hebben we systematisch de dynamiek van een signaalnetwerk specifiek voor directionele detectie gemeten, van cyclic AMP-stimulatie tot PIP3-productie.Dit schema toont het signaleringsnetwerk van directionele waarneming, van cyclisch AMP-stimulatie tot PIP3-productie. De kinetiek van elke component wordt weergegeven met een lijn in dezelfde kleur. In deze eerste figuur wordt in deze video getoond hoe een uniform toegepaste cyclisch AMP-stimulatie een aanhoudende G-eiwitactivering teweegbrengt, wat vervolgens leidt tot een tijdelijke PIP3-productie.Een reeks beelden van G- en pH-cellen laat zien dat een uniform toegepaste cyclisch AMP-stimulatie een aanhoudende G-proteïne-activatie aan de celperiferie teweegbrengt, wat gelijktijdig een transiënte PIP3-productie induceert. Hier worden de kinetiek van G-proteïne-activatie en PIP3-productie na een uniform toegepaste cyclisch AMP-stimulatie getoond. Bij het uitvoeren van deze experimenten is het belangrijk om rekening te houden met het feit dat de sleutel ligt in het verkrijgen van reactieve cellen, de verschillende genetische achtergronden van de cellen en de omgevingscondities.De condities voor beeldacquisitie beïnvloeden allemaal de celphysiologie en kunnen de cel minder responsief maken. Na deze procedure kan computationele modellering worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe dynamische interacties binnen een signaleringsnetwerk leiden tot een bepaald celgedrag. Deze methoden banen de weg voor onderzoekers op het gebied van eukaryote chemotaxis.We kunnen een computationeel model ontwikkelen voor de detectie van chemoattractanten. Dit model kan worden gebruikt om de dynamiek van een signaleringsgebeurtenis te simuleren. De wisselwerking tussen modelverfijning en levensstijlmetingen kan leiden tot een dieper begrip van chemotaxis.Na het bekijken van deze video hopen we dat u een beter inzicht heeft gekregen in hoe u geavanceerde fluorescentie-confocale microscopie kunt toepassen om signaleringsgebeurtenissen in levende cellen te monitoren. Hopelijk kunt u deze methode toepassen in uw onderzoek.

imaging-g-protein-coupled-receptor-gpcr-mediated-signaling-events

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De ECIS / Taxi-systeem is een geautomatiseerde, real-time test die cellulaire chemotaxis meet. In deze assay cellen bewegen onder een laag van agarose om tot een doel elektrode. Cellulaire beweging wordt gemeten door het optreden van resistentie tegen wisselstroom 0.

Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons...

C. elegans Chemotaxis Assay

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via de S1P-receptoren (S1PR's) subfamilie. Hier wordt een pijplijn beschreven om de structuren en functie van S1PR's uit te leggen.

Een pijplijn om de structuren en signaalroutes van sfingosine-1-fosfaatreceptoren te onderzoeken

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

Leer geavanceerde fluorescentieconfocale microscopie om signaalgebeurtenissen tijdens chemotaxis te monitoren in Dictyostelium discoideum. Deze methode onthult ruimtelijk-temporele dynamica van GPCR-signalering.

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum /em (Video) | JoVE Journal

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum

Meer video's verkennen