Tracking Morfogenetische Tissue vervormingen in de vroege Chick Embryo

Het algemene doel van de hier gepresenteerde technieken is het labelen en kweken van embryonaal weefsel om morfogenetische deformatie tijdens de vroege ontwikkeling te meten. Begin voor het kweken van het vroege kippenembryo met het verwijderen van het embryo uit het ei met behulp van een filterpapierdrager-methode. Afhankelijk van de experimentele toepassing labelt u het geëxtraheerde embryo met fluorescerende lipofiele kleurstoffen die via magnetische ijzerdeeltjes worden afgeleverd, of met polystyreen microsferen. Volg vervolgens de labels tijdens de kweek met behulp van fluorescentiemicroscopie of optical coherence tomography-beeldvorming.

Beeldvorming van de resulterende morfogenetische rekkaarten geeft regio's van weefselverlenging, verkorting en afschuiving aan in zowel twee als drie dimensies. Hallo, mijn naam is Ben Philis en ik ben een promovendus in het laboratorium van Dr. Larry Tabor van de afdeling Biomedical Engineering aan de Washington University in St. Louis. Voordat u dit type experimenten start, is het belangrijk om rekening te houden met de relevante weefselkweektechnieken in uw modelsysteem, de beeldvormingsmodaliteiten waartoe u toegang heeft, en ook het type gegevens dat u uit uw experimenten wilt verkrijgen.

Bent u bijvoorbeeld geïnteresseerd in het analyseren van weefseldeformaties in twee of drie dimensies? We behandelen enkele van deze vragen vandaag door twee complementaire labelingstechnieken in het vroege kikenbryo te laten zien. Hallo, mijn naam is Victor Varner en ik werk in het laboratorium van Dr. Larry Tabor aan de Washington University in St. Louis.

Bij beide technieken labelen we snel en gelijktijdig honderden cellen in het vroege kippenembryo. Door de beweging van deze labels te volgen, kunnen we niet alleen bepalen in welke weefsels deze cellen uiteindelijk terechtkomen, maar ook de vervorming op weefselniveau kwantificeren die het vroege embryo vormgeeft. Incubeer eerst de eieren in een longitudinale oriëntatie tot het gewenste stadium, zoals gedefinieerd door Hamburger en Hamilton.

Breek de onderkant van het ei tegen de wand van een Petri-schaal van 150 millimeter. Trek de schaal aan de onderzijde open, giet de inhoud van het ei in de schaal en verwijder met stompe pincetten het dikkere, visceuze albumine van de dooier. Maak vervolgens gaten door het midden van een rond filterpapier.

Plaats een van de filterpapierringen op de dooier, zodanig dat het embryo zichtbaar is door het centrale gat van de ring. Trim de buitenste rand van de filterpapierring met microschaartjes. Verwijder vervolgens het papier met het vastgehechte embryo van de dooier met een fijne pincet en week het embryo voorzichtig in een bad met PBS. Om aanhechtende dooierdeeltjes te verwijderen, brengt u het filterpapierensemble over naar een kweekschaal van 35 millimeter.

Plaats het embryo met de ventrale zijde naar boven in een tweede filterpapierring. Zet dit vast met een metalen ring en dompel het embryo onder in het cultuurmedium. Als het embryo niet volledig is ondergedompeld, kunnen de weefselgeometrie en de daaropvolgende morfogenese sterk worden beïnvloed door abnormaal hoge oppervlaktespanningen.

Verifieer tijdens de kweek de juiste morfologie en het embryonale stadium met behulp van een lichtveldmicroscoop. Neem vervolgens een kleine hoeveelheid ijzerpoeder, voeg enkele druppels verzadigde kleurstof en alcohol toe en laat dit aan de lucht drogen met de punt van een uitgetrokken micropipet. Breek de samengeklonterde ijzerdeeltjes op en breng ze over naar een microcentrifugebuis.

Na meerdere spoelingen met gedeïoniseerd water, wordt het geoogste embryo met de dorsale zijde naar boven geplaatst in een kweekschaal van 35 millimeter, bedekt met een royale laag kweekmedium. Verwijder onder een dissectiemicroscoop met de glazen naald het vliezige membraan om de electrodermale cellen bloot te leggen. Zuig vervolgens een kolom gemarkeerde ijzerdeeltjes op in een micropipet.

Dompel de pipet met behulp van de dissectiemicroscoop onder tot net boven het embryo. Rol de pipet langzaam heen en weer tussen de vingertoppen om deeltjes over het embryo te strooien. Na een incubatie van 10 minuten bij 37 °C worden de deeltjes met een sterke magneet verwijderd.

Bevestig indien nodig de magneet aan een magnetische fijne pincet en gebruik de gemagnetiseerde pincet om eventuele resterende ijzerdeeltjes voorzichtig te verwijderen. Ga vervolgens over tot het maken van zowel brightfield- als fluorescentiebeelden van het embryo. Met een naald van 22 gauge.

Trek een oplossing van zwarte microsferen met een diameter van 10 µm in PBS op in een spuit van 10 cc. Schuin de punten van uitgetrokken glazen naalden af met behulp van een computerharde schijf en vul deze met de kraal-oplossing. Tik lichtjes tegen de micropipet aan zodat de oplossing de punt bereikt met behulp van een micromanipulator.

Plaats de glazen naald in hetzelfde gezichtsveld als het embryo. Bevestig dat de kraaltjes uit de pipetpunt stromen. Voer nu de pipetpunt in het lumen van de hersenbuis in.

Zorg ervoor dat de ventrale bodem van het weefsel niet wordt doorprikt. Let op de tijdelijke zwelling van het weefsel terwijl de kraaltjes en vloeistof het lumen binnendringen. Verwijder vervolgens snel de glazen naald.

Verifieer ten slotte of er een voldoende bolletjesdichtheid aanwezig is in het binnenste lumen van de hersenbuis. Laat de bolletjes gedurende 20 tot 30 minuten bezinken met behulp van een lichtveldmicroscoop voordat u lichtveldafbeeldingen of een optische coherentietomografie-dataset vastlegt. Plaats na het maken van de eerste afbeeldingen maximaal 7 kweekschalen van 35 millimeter met monsters in een Petrischaal van 150 millimeter en plaats de gehele constructie in een klein plastic zakje.

Voeg druppels gedeïoniseerd water toe aan de zak voor bevochtiging en vul de zak vervolgens met een mengsel van 95% zuurstof en 5% kooldioxide. Plaats de embryo's in een incubator van 37 °C tot het volgende tijdstip voor beeldvorming; plaats de gelabelde embryo's vervolgens in een delta T-schaaltje met 1,2 ml cultuurmedium en dek het schaaltje af met een glazen deksel bij 37 °C. Superfuseer het embryo met een gasmengsel van 95% O2 en 5% CO2, geleverd via een minipomp met variabele flow. Stel nu de software in om automatisch beelden te verwerven met de gewenste tijdsintervallen.

Gedurende het experiment kunnen labels automatisch of handmatig worden gevolgd, en kunnen morfogenetische rekkaarten worden berekend voor markercoördinaten. Hier werd de techniek met ijzerdeeltjes gebruikt om de beweging van electrodermale cellen tijdens de vorming van de hoofdvouw te labelen en te volgen. In het vroege kiजembyo werden fluorescentie-gelabelde cellen over het gehele embryo verdeeld.

Brightfield- en fluorescentiebeelden van het embryo werden met verschillende intervallen vastgelegd tijdens ex ovo-kweek. Om de bewegingen van de tract-markeringen te monitoren. Cumulatieve gegevens maken de berekening mogelijk van de evoluerende morfogenetische rekverdelingen tijdens de vorming van de kopplooi.

Op soortige wijze werd de techniek met polystyreen-microsferen gebruikt om weefselbewegingen te volgen bij de grens tussen het middenhersenen- en achterhersengebied van het vroege kippenbrein. Merk op dat deze methode in staat is om duidelijk driedimensionale vervormingen te verwerken, aangezien de bolletjes zich hechten aan alle zijden van het innerlijke lumen van het brein. Na het volgen van de bewegingen van de bolletjes gedurende zes uur, maken de coördinaten van de markers de berekening van rekken mogelijk, waardoor de weefselvervorming in de longitudinale en circumferentiële richtingen wordt gekarakteriseerd.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed beeld gekregen van enkele van de experimentele stappen die nodig zijn om uw eigen weefselkweek en labelingsmethode te implementeren. De hier gepresenteerde protocoltechnieken zijn bijzonder voordelig omdat ze minimaal invasief zijn voor de natuurlijke weefsels en gebruikmaken van goedkope en gemakkelijk verkrijgbare materialen. Deze experimenten zijn bijzonder nuttig voor studies naar de mechanica van de embryonale ontwikkeling.

Aangezien de deformatievelden die zijn berekend op basis van de gevolgde beweging van gelabelde cellen kunnen worden gebruikt om zowel fysieke modellen van morfogenese te testen als te construeren.