Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de aanvulling en mobilisatie van specifieke synaptische blaasjespools in centrale zenuwuiteinden te kwantificeren met behulp van live fluorescentiebeeldtechnieken. Dit wordt bereikt door twee rondes van recycling van synaptische blaasjes te monitoren, waarbij FM-kleurstoffen in dezelfde zenuwuiteinden worden gebruikt om geldige interne controles te verkrijgen. Als tweede stap worden de direct vrijzetbare pool (readily releasable pool) en de reservepool opeenvolgend uitgeput met behulp van specifieke ontladingsprotocollen, waardoor de relatieve poolgroottes kunnen worden gekwantificeerd.

Pas vervolgens ofwel de laad- of de ontlaadcondities aan om het effect van de gekozen variatie op de synaptische blaasjes, de aanvulling van de pool of de mobilisatie te bestuderen. De resultaten tonen aan dat de FM d-lading van verschillende fysieke synaptische pools reproduceerbaar is, op basis van de kwantificering en analyse van de opgewekte kleurstofontlading. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de fluent-familie van genetische reporters, is dat deze techniek specifiek de aanvulling van pools door synaptische blaasjes volgt die endocytose hebben ondergaan.

Het maakt bovendien een nauwkeurige kwantificering mogelijk. Aangezien dit protocol tweemaal in dezelfde zenuwuiteinden wordt uitgevoerd, dient dit als interne controle. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van synaptische CLE, endocytose en exocytose, zoals de vraag hoe manipulatie van specifieke endocytosemodi de aanvulling van zowel de totale recyclingpool als de daarin gelegen synaptische CLE-pools kan beïnvloeden, zoals de direct herbruikbare pool en de reservepool.

De basisexperimentele opstelling dient te bestaan uit een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop, een gekoelde CCD-camera, een fluorescentielichtbron, een zwaartekrachtperfusie-apparaat, een beeldkamer met parallelle platina-elektroden en een elektrische stimulator, en een computer. Voer de experimenten uit in het donker of onder rood licht, met minimale fluorescentieverlichting van het monster om bleken van de FM-kleurstof te voorkomen. Begin deze procedure door zeven dagen oude Sprague-Dawley ratpups te gebruiken voor het bereiden van de primaire culturen van cerebellaire korrelcellen.

Nadat de culturen zijn voorbereid, plaatst u de neuronen in een druppel in het centrum van een met poly-D-lysine gecoate dekglasplaat van 25 millimeter, met een diameter van maximaal zeven millimeter. Voeg na één uur twee milliliter kweekmedium toe aan de neuronen. Plaats na zeven dagen een enkel dekglas gedurende 10 minuten in de zoutoplossing bij kamertemperatuur om stabilisatie in het nieuwe medium mogelijk te maken. Verwijder daarna het dekglas en droog de onderzijde en het gebied rondom de gehechte cellen met een klein stukje keukenpapier of absorptiepapier.

Gebruik vervolgens het siliconenvet om het dekglas aan de bodem van de beeldvormingskamer te lijmen. De cellen moeten zich tussen de twee parallelle draden bevinden. Gebruik voldoende siliconenvet om de kamer volledig af te dichten zonder dat dit het midden van de badkamer bereikt.

Vul vervolgens de badkamer voorzichtig met ongeveer 260 µL zoutoplossing. Vul daarna de in- en uitlaatslangen met dezelfde oplossing. Sluit de kamer af door een schoon dekglas met siliconenvet op de bovenkant te lijmen.

Verwijder daarna alle luchtbellen die in de kamer vastzitten met de in- en uitlaatslangen. Immobiliseer vervolgens de beeldvormingskamer in een platform van roestvrij staal. Controleer op lekken door voorzichtig een zoutoplossing door de inlaatslang te perfunderen.

De volgende stap is het monteren van de geassembleerde kamer op de tafel van een geïnverteerde microscoop. Spoel de inlaat van het gravitatieperfusiesysteem voor met zoutoplossing en verbind de kamer met de inlaat. Sluit vervolgens de verbindingsdraden van de kamer aan op de elektrische stimulator.

Perfuseer de neuronen met 1,5 milliliter verdunde fm-kleurstof. Stimuleer vervolgens de neuronen met de aangesloten stimulator om kleurstofopname op te wekken. Perfuseer de neuronen na stimulatie gedurende twee minuten met verse zoutoplossing om overtollige FM-kleurstof weg te spoelen. Houd de neuronen daarna acht minuten in de zoutoplossing.

Zoek ondertussen de axonale netwerken op waar de individuele FM D-geladen zenuwuiteinden zichtbaar zijn. Gebruik hiervoor fluoresceïnegolflengten. Vermijd de gebieden met celclusters.

Stel het beeld vervolgens onmiddellijk voor de beeldacquisitie opnieuw scherp, aangezien er tijdens de rustperiode een lichte drift kan zijn opgetreden. Begin de time-lapse beeldacquisitie met een snelheid van één frame per vier seconden. Nadat er vijf tot 10 basislijnbeelden zijn verkregen, wordt exocytose van de readily releasable pool opgewekt door een stimulatie van 30 hertz gedurende twee seconden toe te dienen.

Nadat er nog eens 10 beelden zijn verkregen, wordt de exocytose van de reservepool van synaptische blaasjes opgewekt met drie stimulaties van 40 hertz gedurende 10 seconden, met een interval van 40 seconden tussen de stimulaties, waarna er nog vijf tot 10 beelden worden verkregen. Pauzeer vervolgens de beeldacquisitie. Laat de neuronen ten minste 20 minuten herstellen en herhaal dit protocol van de S1-fase opnieuw in de S2-fase voor het controle-experiment.

Zet voor de data-analyse de beelden om in een stack. Gebruik hiervoor een ingebouwde functie van ImageJ en pas vervolgens de helderheid en het contrast van de stack aan om het dynamische bereik te maximaliseren als er sprake is van aanzienlijke horizontale drift. Voer tijdens het experiment de plugins stack reg en turbo reg uit in ImageJ om de beeldstack uit te lijnen.

Start vervolgens de runtime series analyzer-plug-in. Definieer daarna de regio's van interesse bij ten minste 90 zenuwuiteinden. Het is nuttig om te schakelen tussen de beelden vóór en na het uitwassen van de kleurstof om actieve zenuwuiteinden zichtbaar te maken.

Een ideale grootte voor het interessegebied is iets groter dan een typisch zenuwuiteinde. Bepaal vervolgens de totale fluorescentie-intensiteit van elk interessegebied gedurende de tijd. Exporteer deze gegevens daarna naar Microsoft Excel.

Hier wordt een stroomschema getoond van een controle-experiment waarbij cerebellaire granulaire neuronen werden geladen met 10 micromolar FM 1 43 met behulp van stimulatie van 80 hertz gedurende 10 seconden. Hier is een afbeelding die zenuwuiteinden toont die geladen zijn met FM 1 43. Hier is dezelfde afbeelding met 90 genummerde regions of interest die zijn geselecteerd voor analyse na het identificeren van actieve zenuwuiteinden, en dit zijn de afbeeldingen van de zenuwuiteinden op geselecteerde tijdstippen.

Deze afbeeldingen worden in pseudokleuren gepresenteerd om de veranderingen in fluorescentie te illustreren naarmate de verschillende pools van synaptische blaasjes werden uitgeput. Tot slot worden hier de genormaliseerde fluorescentie-eenheden van deze 90 zenuwuiteinden getoond. In de S one- en S two-fasen kan de daling van de fluorescentie bij elke opeenvolgende stimulatie worden gemeten en vergeleken tussen de S one- en S two-fasen.

In dit controle-experiment resulteerden zowel S één als S twee in dezelfde groottes van de readily releasable pool en de reservepool. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de aanvulling en mobilisatie van specifieke synaptische blaasjespools in de centrale zenuwuiteinden kunt kwantificeren met behulp van live-fluorescentiebeeldtechnieken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de cellevensvatbaarheid en responsiviteit te bevestigen door de S één controle-experimenten uit te voeren voordat de S twee experimentele condities worden gevarieerd.