Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen
11 november 2011
Een live fluorescentie imaging techniek om de aanvulling en de mobilisatie van specifieke synaptische vesicles (SV) zwembaden in het centrum van zenuwuiteinden te kwantificeren wordt beschreven. Twee rondes van SV recycling worden bewaakt in dezelfde zenuwuiteinden die een interne controle.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de aanvulling en mobilisatie van de specifieke synaptische blaasjespools in centrale zenuwuiteinden te kwantificeren met behulp van live fluorescentiebeeldtechnieken. Dit wordt bereikt door twee rondes van synaptische blaasjesrecycling te monitoren, met behulp van FM-kleurstoffen in dezelfde zenuwuiteinden om geldige interne controles te bieden. Als tweede stap worden de direct beschikbare pool en de reservepool sequentieel uitgeput met behulp van specifieke ontlaadprotocollen, die de kwantificering van relatieve poolgroottes mogelijk maken.
Verander vervolgens de laad- of ontlaadvoorwaarden om het effect van de gekozen variatie op het synaptische blaasje, poolaanvulling of mobilisatie te bestuderen. De resultaten laten zien dat FM d-belasting van verschillende synaptische fysische pools reproduceerbaar is op basis van de kwantificering en analyse van de geëvokte kleurstoffenontlading. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de vloeiende familie van genetische reporters, is dat deze techniek de aanvulling van pools specifiek volgt door middel van synaptische blaasjes die endocytose hebben ondergaan.
Het maakt ook een nauwkeurige kwantificering mogelijk. Aangezien dit protocol twee keer in dezelfde zenuwuiteinden wordt uitgevoerd, biedt het een interne controle. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het synaptische, CLE-, endocytose- en exocytosegebied, zoals hoe manipulatie in specifieke endocytosemodi de aanvulling van zowel de totale recyclingpool als de synaptische CLE-pools binnenin kan beïnvloeden, zoals de direct herbruikbare pool en de reservepool.
De basisexperimentele opstelling moet bestaan uit een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop, een gekoelde CCD-camera, een fluorescentielichtbron, een zwaartekrachtperfusie-apparaat, een beeldvormingskamer met parallelle platina-elektroden en elektrische stimulator en een computer. Voer de experimenten uit in het donker of onder rode lichtcondities met minimale fluorescentiebelichting van het monster om FM-kleurstoffenbleken te voorkomen. Begin dit proces door zeven dagen oude spra dolly rat pups te gebruiken om de primaire culturen van cerebellaire granulaircellen voor te bereiden.
Nadat de culturen zijn voorbereid, plaats de neuronen in het centrum van een poly D-lysine gecoate 25 millimeter dekglas in een druppel, niet groter dan zeven millimeter in diameter na een uur, voeg na zeven dagen twee milliliter kweekmedium toe aan de neuronen. Plaats een enkele dekglas in de zoutoplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om stabilisatie in het nieuwe medium mogelijk te maken. Verwijder daarna het dekglas, droog de onderkant en het gebied rond de gehechte cellen met een klein stuk papieren handdoek of absorberend papier.
Gebruik vervolgens de siliconenkit om het dekglas op de bodem van de beeldvormingskamer te lijmen. De cellen moeten zich tussen de twee parallelle draden bevinden. Gebruik voldoende siliconenkit om de kamer volledig te verzegelen zonder het centrum van de badkamer te betreden.
Vervolgens vult u de badkamer voorzichtig met ongeveer 260 microliters zoutoplossing. Vul vervolgens de invoer- en uitvoerslangen met dezelfde oplossing. Verzegel de kamer door een schone dekglas met siliconenkit op de bovenkant te lijmen.
Verwijder daarna eventuele luchtbellen die in de kamer met de invoer- en uitvoerslangen zijn gevangen. Immobiliseer vervolgens de beeldvormingskamer in een roestvrij stalen platform. Controleer op lekken door voorzichtig saline-oplossing door de invoerslang te laten lopen.
De volgende stap is om de geassembleerde kamer op het podium van een omgekeerde microscoop te monteren. Prime de inlaat van het zwaartekrachtperfusiesysteem met zoutoplossing en verbind de kamer met de inlaat. Bevestig vervolgens de verbindingsdraden van de kamer aan de elektrische stimulator.
Perfuseer de neuronen met 1,5 milliliter verdunde fm-kleurstof. Stimuleer vervolgens de neuronen met behulp van de aangesloten stimulator om kleurstoffopname op te roepen. Na stimulatie perfuseer de neuronen gedurende twee minuten met verse zoutoplossing om overtollig FM-kleurstof weg te spoelen. Houd de neuronen vervolgens acht minuten in de zoutoplossing.
Loceer ondertussen de axonnetwerken waar de individuele FM D-geladen zenuwuiteinden zichtbaar zijn. Gebruik fluorescerende golflengten. Vermijd de gebieden met clusters van cellen.
Focus vervolgens het beeld onmiddellijk voorafgaand aan beeldacquisitie opnieuw, aangezien er tijdens de rustperiode een lichte drift kan zijn opgetreden. Begin met time-lapse beeldacquisitie met een snelheid van één frame elke vier seconden. Na het verkrijgen van vijf tot 10 basisbeelden, roep exocytose van de direct beschikbare pool op door een 30 hertz-stimulatie gedurende twee seconden te leveren.
Na het verkrijgen van nog eens 10 beelden, roep exocytose van het synaptische blaasje, exocytose van de reservepool op met behulp van drie stimulaties van 40 hertz gedurende 10 seconden met een interval van 40 seconden tussen de stimulaties, en verwerf nogmaals vijf tot 10 beelden. Pauzeer vervolgens de beeldacquisitie. Laat de neuronen minstens 20 minuten herstellen en herhaal dit S een-fase protocol opnieuw in S twee-fase voor het controle-experiment.
Voor data-analyse, converteer de beelden naar een stack. Gebruik een ingebouwde functie van image J en pas vervolgens de helderheid en het contrast van de stack aan om het dynamische bereik te maximaliseren als er significante horizontale drift is opgetreden. Tijdens het experiment, voer stack reg en turbo reg plugins uit op image J om de beeldstack uit te lijnen.
Vervolgens runtime series analyzer plugin. Definieer vervolgens de interessegebieden over ten minste 90 zenuwuiteinden. Het is handig om te schakelen tussen de beelden voor en na die ontlading om actieve zenuwuiteinden te onthullen.
Een ideale grootte van het interessegebied is een die iets groter is dan een typische zenuwuiteinden. Verkrijg vervolgens de totale fluorescentie-intensiteit van elk interessegebied over tijd. Exporteer vervolgens naar Microsoft Excel.
Hier wordt een stroomdiagram van een controle-experiment getoond waarbij cerebellaire granulaircellen werden geladen met 10 micromolar FM 1 43 met behulp van
Overzicht
Dit artikel beschrijft een live fluorescentiebeeldtechniek om de aanvulling en mobilisatie van specifieke synaptische blaasjes (SV) pool te kwantificeren in centrale zenuwuiteinden. De methode maakt het mogelijk om twee rondes van SV-recycling in dezelfde zenuwuiteinden te monitoren, wat een interne controle biedt voor nauwkeurige kwantificering.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldtechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van synaptische blaasjesdynamiek is cruciaal voor inzichten in neurotransmissie.
- Live beeldtechnieken verbeteren het vermogen om synaptische processen in real-time te bestuderen.
- Vorige methoden misten de mogelijkheid om specifieke blaasjespools effectief te volgen.
- Deze studie heeft tot doel bestaande technieken te verbeteren door interne controles te bieden.
Doel van de studie
- Om de aanvulling en mobilisatie van synaptische blaasjespools te kwantificeren.
- Om twee rondes van synaptische blaasje recycling in dezelfde zenuwuiteinden te monitoren.
- Om de effecten van verschillende laad- en loscondities op blaasjesdynamiek te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Live fluorescentiebeeldvorming met FM-kleurstoffen om synaptische blaasjes te visualiseren.
- Sequentiële depletie van gemakkelijk vrijgeefbare en reservepools met behulp van specifieke protocollen.
- Time-lapse beeldvorming om blaasjesdynamiek tijdens stimulatie vast te leggen.
- Gegevensanalyse met beeldverwerkingssoftware om fluorescentie-intensiteit te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt reproduceerbaar volgen van synaptische blaasjeslading en loslating mogelijk.
- Interne controles verhogen de validiteit van de verkregen resultaten.
- Manipulaties van endocytosemodi hebben significant effect op blaasjesaanvulling.
- Kwantitatieve analyse geeft inzichten in synaptische blaasjespoolgroottes.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak om synaptische blaasjesdynamiek te bestuderen.
- Het biedt potentieel om sleutelvraagstukken in synaptische fysiologie te beantwoorden.
- De bevindingen kunnen toekomstig onderzoek naar neurotransmissie en synaptische plasticiteit informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise quantification of synaptic vesicle pool dynamics, supporting mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. By providing internal controls and differential pool analysis, it enhances predictive confidence in early discovery stages where vesicle trafficking mechanisms are therapeutic targets. The approach addresses variability across preparations, improving reproducibility for cross-functional collaboration in assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic vesicle trafficking pathways to validate targets involved in neurotransmitter release and recycling.
- Operational Value: Provides quantitative, reproducible measurements of readily releasable and reserve pool replenishment under varying stimulation conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates assay-ready readouts of vesicle mobilization kinetics that can be used to screen compounds affecting endocytosis or exocytosis.
- Operational Value: Uses FM dye labeling to produce quantal fluorescence signals proportional to vesicle release, enabling standardized, quantitative screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by quantifying how manipulations of endocytosis modes affect specific vesicle pools in cerebellar granule neurons.
- Operational Value: Enables within-preparation comparisons (S1 vs S2 phases) to control for biological variability, increasing assay reliability in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where understanding vesicle pool dynamics informs mechanism of action and compound effects on presynaptic function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how endocytosis pathways (e.g., clathrin-dependent vs activity-dependent bulk endocytosis) regulate vesicle pool mobilization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (fluorescence decay kinetics) that enable comparison of compound effects on vesicle recycling.
- Analytics: Provides time-resolved fluorescence intensity measurements from regions of interest, allowing calculation of pool-specific replenishment rates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant neuronal models to assess how genetic or pharmacological perturbations alter vesicle trafficking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging workflow that can be adapted across neuronal models and stimulation paradigms for repeated use in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by isolating the contributions of specific synaptic vesicle pools to neurotransmission dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility through internal controls (dual-phase measurements in same nerve terminals) and standardized FM dye protocols.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in presynaptic target validation, supporting better go/no-go decisions in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on vesicle pool replenishment, a key presynaptic mechanism.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live fluorescence imaging and neuronal culture preparation, particularly for primary cerebellar granule neurons.
- Depends on inverted epifluorescence microscopy, cooled CCD camera, electrical stimulation, and perfusion systems for precise solution exchange.
- Necessitates standardization of staining, washing, and stimulation timing across runs to ensure comparable vesicle loading and unloading.
- Must account for variability in nerve terminal density and health, addressed by selecting active terminals and using internal controls.
- Limited to optically accessible preparations; not suitable for high-throughput formats without automation of imaging and analysis.
