Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

Deze video demonstreert een procedure voor het genereren van driedimensionale culturen waardoor pancreasspecifieke progenitorcellen kunnen differentiëren tot insuline-expresserende kolonies. Ten eerste worden gedifferentieerde cellen, afgeleid van een neurogen in three EGFP Knockin muis-embryonale stamcellijn, gedissocieerd en gesorteerd op EGFP-expressie om endocrine-achtige progenitorcellen te verrijken. De gesorteerde EGFP-positieve enkelcellen worden uitgeplaat in een semi-solide medium dat matrigel en groeifactoren bevat.

Dit beperkt de beweging van individuele progenitorcellen, terwijl hun overleving, proliferatie en differentiatie in vitro mogelijk blijft. Vervolgens werden het aantal ontstane kolonies met een kenmerkende morfologie geteld en gescoord onder een microscoop om de frequentie van kolonie-vormende progenitoren in een gegeven gesorteerde populatie te berekenen. Analyse van individuele kolonies via real-time PCR en immunofluorescentiemicroscopie onthult insuline-expressie in kolonies afgeleid van ngn three positieve cellen, maar niet in kolonies afgeleid van NGN three negatieve cellen.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals pancreassferen in suspensiecultuur, is dat deze techniek het mogelijk maakt om tegelijkertijd een grotere hoeveelheid cellen te onderzoeken op hun intrinsieke vermogen om progenitorcoloniën te vormen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen over de biologie van pancreatische stam- en progenitorcellen, zoals welke markers progenitorcellen tot expressie brengen en welke intrinsieke of extrinsieke factoren belangrijk zijn voor het behoud, de zelfvernieuwing en de differentiatie van deze cellen. De implicaties van deze techniek kunnen zich uitstrekken tot de therapie voor diabetes type 1, omdat wanneer pancreatische progenitorcellen kunnen worden geïdentificeerd en gedifferentieerd tot bèta-achtige cellen, deze cellen kunnen worden gebruikt om beschadigde bètacellen te vervangen bij patiënten met diabetes type 1 in het eindstadium.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals het bestuderen van de kolonievormende progenitorcellen van de postnatale en volwassen pancreas, het beenmerg, de lever en de milt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat het dissocieren van de cellen tot een single-cell suspensie en het hanteren van de matrigel en methylcellulose ter voorbereiding op het dispenseren lastig kan zijn. Ik bedacht deze methode toen ik me realiseerde dat er geen clonogene assay bestond om de afstammingsrelatie tussen progenitorcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen uit de pancreas te onderzoeken.

Een dergelijke colony assay is in het verleden essentieel geweest voor het bestuderen van hematopoëtische stamcellen en progenitorcellen. Ik zie een behoefte aan een dergelijke assay voor het bestuderen van de biologie van pancreatische stamcellen. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de halfvaste mediumcomponent van nature viskeus is en de stappen voor bereiding en dispensatie moeilijk aan te leren zijn.

De procedures zullen worden gedemonstreerd door dhr. Michael Winkler, een masterstudent, mej. Nancy, een laborante, en dr. Lang Jing, een postdoc-fellow van een laboratorium, om geconditioneerd medium te genereren voor de kolonie-assay die later zal worden uitgevoerd. Neurale ES-cellen worden in vitro gedifferentieerd tot pancreasachtige cellen. Begin deze procedure door zes dagen oude embryoi lichamen onder een lichtmicroscoop te onderzoeken.

Minstens 30 tot 40% van hen moet een diameter van ten minste 150 microns hebben. De grotere embryo-lichamen moeten donkere vlekken bevatten die wijzen op een verhoogde differentiatie. Breng 80 tot 100 embryo-lichamen over naar elke well van een zes-well-hechtingsplaat en schud de plaat vervolgens voorzichtig om de embryo-lichamen in het midden van de wells te verzamelen om het cel-celcontact te vergroten.

Deze contacten leiden tot een betere ontwikkeling van pancreas-achtige cellen vanuit embryo-lichamen. Plaats de platen voorzichtig terug in de incubator bij 37 °C en 5% CO₂ in het kweekmedium. A 13.

Vervang het medium door vers aanhechtingsmedium voor culturen dat nicotinamide en humaan recombinant actieve beta-B bevat om de differentiatie van endocriene cellen te induceren. Plaats de culturen vervolgens terug in de incubator. Verzamel op dag 16 het medium en filtreer dit door een polyethersulfonmembraan van 0,2 micron om eventuele celresten te verwijderen.

Vanaf dit punt wordt het verzamelde medium aangeduid als geconditioneerd medium. Aliquoteer het geconditioneerde medium in conische polypropyleen buisjes van 15 milliliter en bewaar deze bij minus 80 graden Celsius tot vlak voor gebruik. Neurogenine 3 is een transcriptiefactor die tijdens de ontwikkeling wordt tot expressie gebracht door pancreatische endocriene progenitorcellen. Endocriene precursoren die neurogenine 3 tot expressie brengen, differentiëren uiteindelijk tot pancreatische alfa-, bèta-, delta-, epsilon- en pancreatisch polypeptide-expresserende cellen. Om de identificatie van cellen die NGN3 tot expressie brengen te vergemakkelijken, werd één allel van de NGN3-locus vervangen door het EGFP-reportergen in een knock-in muizen-ES-cellijn. De resulterende cellijn werd aangeduid als NGN3-EGFP. Om gedifferentieerde NGN3-EGFP-positieve en NGN3-EGFP-negatieve cellen te verkrijgen.

De cellen worden op dag 16 eerst met trypsine losgemaakt van de kweekplaten om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. De celaggregaten worden geïncubeerd met collagenase B en DNase I en vervolgens door een mesh van 40 of 70 micron geleid. Vervolgens wordt DPI toegevoegd en worden de cellen met een cell sorter gesorteerd op basis van forward scatter versus side scatter, welke respectievelijk indicatief zijn voor de celgrootte en granulariteit en worden uitgezet in een plot.

Vervolgens wordt er een gate getrokken om niet-cellulair debris te elimineren. DPI wordt gebruikt om dode cellen te onderscheiden, die positief zullen aankleuren. Wanneer er wordt geëxciteerd bij 405 tot 413 nm en de emissie wordt gedetecteerd met een 454/40 filter, onthult het gaten van de pulsbreedte — de breedte van de elektronische forward scatter-puls — doubletten, die geëlimineerd moeten worden voordat ze door de fluorescence activated cell sorter gaan via gating van het EGFP-kanaal FL1 tegenover autofluorescentie.

Door gebruik te maken van cellen van dag 16 uit een controle-ouderlijke cellijn, zoals TL, dat in het linkerpaneel is getoond, wordt de werkelijke fluorescentie verlicht en kan de NGN three EEG FP-positieve celpopulatie dus worden gevisualiseerd, zoals te zien is in het rechterpaneel. De sort gate van de NGN three EGFP-positieve cellen is opzettelijk naar rechts verschoven, zoals hier door de pijl wordt aangegeven, om contaminatie door NGN three EEG FP-negatieve cellen tijdens het sorteren te beperken. Zodra de gates zijn vastgesteld, worden de NGN three EEG FP-positieve en NGN three EGFP-negatieve cellen gesorteerd en op ijs bewaard tot gebruik ter voorbereiding op het uitplaten.

Plaats de Matrigel de avond voor het experiment op ijs bij 4 °C. Op de dag van het experiment moeten de volgende reagentia of oplossingen op ijs worden geplaatst: DMEM/F12, methylcellulose, geconditioneerd medium, FCS, nicotinamide, XTEND-4, VEGF-A en recombinant menselijk actief TGF-β1. Plaats een steriele doos met 200 µL pipetpunten ten minste een half uur voor gebruik bij -20 °C. Ter voorbereiding op het uitplaten van de gesorteerde cellen moeten de componenten van het semi-solide medium eerst worden toegevoegd aan een polystyreen buisje van 5 mL. Gebruik eerst een naald van 16,5 gauge om een kleine hoeveelheid 3,3% methylcellulose-oplossing in een spuit op te zuigen.

Druk vervolgens de oplossing onmiddellijk naar buiten om de lucht te verdrijven. Hiermee wordt de dode ruimte in de spuit gevuld met oplossing, wat een nauwkeurige meting van het volume van de halfvaste oplossing vergemakkelijkt. Trek vervolgens, terwijl de vorming van luchtbellen wordt vermeden, het beoogde volume methylcellose-oplossing op en breng dit over in een buis van vijf milliliter.

Voeg het geconditioneerde medium FCS nicotinamide toe, bestaande uit active in beta B, VEGF A en D-M-E-M-F 12. Gebruik vervolgens de koude pipetpunten om de matrigel toe te voegen. Voeg tot slot de gewenste hoeveelheid gesorteerde cellen toe aan de buis van vijf milliliter.

Voeg de cellen altijd als laatste toe om vroegtijdige stimulatie van de cellen te voorkomen. Sluit de buis vervolgens stevig af met de dop en schud de buizen krachtig en grondig met de hand. Omdat het schudden luchtbellen veroorzaakt, plaatst u de buizen vijf minuten op ijs of totdat de kleine luchtbellen naar de oppervlakte zijn gestegen.

Gebruik een spuit van 1 milliliter met een naald van 18,5 gauge om een kleine hoeveelheid van het mengsel van cellen in semi-solide medium op te zuigen en druk onmiddellijk de lucht uit de spuit. Dispenseer vervolgens langzaam 500 microliters van het semi-solide celmengsel direct in het midden van elke put van een 24-wells low attachment plaat. Elk monster moet in vierduplicaat worden geplaatst; voor de cultuur worden alleen de vier binnenste kolommen van de horizontaal georiënteerde 24-wells plaat gebruikt.

Vul de resterende putjes met steriel water om de bevochtiging van de cultuur met cellen te ondersteunen. Bekijk de cellen direct na het uitplaten onder een lichtmicroscoop.

Enkelvoudige cellen zijn willekeurig en gelijkmatig over de putjes verdeeld. Incubeer de cellen gedurende acht tot 12 dagen bij 37 °C en 5% carbon dioxide lucht. Observeer de cellen na incubatie van acht tot 12 dagen opnieuw onder een microscoop.

Dit is een goed voorbeeld van gelijkmatig verdeelde Matrigel in een kweek. Hier is een voorbeeld van ongelijkmatig verdeelde Matrigel, wat resulteert in een ongelijkmatig raamwerk. Kolonies groeien niet op plaatsen waar Matrigel afwezig is.

Dit is een voorbeeld van de achtergrond van de well waarin geen Matrigel is toegevoegd aan het mengsel van semi-solide medium. Bevestig een raster onder de plaat om de resulterende kolonies te tellen. Observeer en tel de kolonies vervolgens met een 10x objectief; vanwege de driedimensionale aard van het medium zullen de kolonies op verschillende brandpunten verschijnen.

Hierdoor kan tijdens observatie via lichtmicroscopie een aanpassing van de focus voor elke kolonie vereist zijn; hier worden representatieve fotomicrografieën getoond van insuline-expresserende kolonies in semisolide kweek na acht tot 12 dagen, waarbij de door pijlen aangegeven kolonies willekeurig verdeeld zijn en verschijnen als kleine, donkere, niet-lichtreflecterende clusters met een diameter van ongeveer 60 tot 100 microns. Vervolgende microfluïdische RT-PCR-analyse van individueel handgeplukte kolonies onthulde expressie van insuline 2 en glucagon, consistent met ons vorige rapport. Deze resultaten tonen het vermogen van enkelvoudige NGN3-EGFP-positieve cellen aan om te differentiëren tot kolonies die gelijktijdig twee eilandjeshormonen bevatten, wat lijkt op primitieve first-wave-achtige endocriene cellen; de eiwitexpressie van eptide, een marker voor de novo insulineproductie, werd bevestigd met behulp van fluorescentiekleuring van het gehele preparaat.

Samenvattend kan, wanneer de assay voor insuline-expresserende kolonievormende eenheden wordt uitgevoerd zoals geïllustreerd in dit verslag, het aantal individuele progenitoren dat in staat is om koloniën te vormen gemakkelijk worden bepaald. Zoals hier en in ons vorige verslag is aangetoond, kunnen insuline-expresserende kolonievormende eenheden worden verrijkt door te sorteren op NGN EGFP-positieve, maar niet op ngn three EEG FP-negatieve cellen afgeleid van rine ES-cellen in vitro. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één tot drie uur worden uitgevoerd na het sorteren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de cellen volledig te dissociëren tot een enkelcellige suspensie en alle cultuurcomponenten op ijs te houden om stolling van matrigel te voorkomen, en de cellen als laatste aan de buisjes toe te voegen om voortijdige stimulatie van de cellen na deze procedure te vermijden. Andere methoden, zoals enkelcelmanipulatie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of een enkele cel voldoende is om kolonievorming te initiëren na de ontwikkeling ervan.

Deze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van de biologie van pancreatische stam- en progenitorcellen. Het stelt hen in staat om de zelfvernieuwingscapaciteit en het differentiatievermogen tot bèta-achtige cellen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de kwantitatieve colony assay voor insuline-exprimerende colony-forming progenitors uitvoert.