CD4 + T-lymfocyten Capture Met behulp van een Wegwerp Microfluïdische Chip voor HIV
1 oktober 2007
Hallo, mijn naam is Richard Lin en ik ben een onderzoeker hier in de groep van Professor TI Mercy in de Harvard MIT Divisie voor Gezondheidswetenschappen en Technologie. Het project waar ik aan werk is om CD vier positieve en C3 positieve T-lymfocyten te kwantificeren en vast te leggen. Het bloed van patiënten zal worden gebruikt in omgevingen met beperkte middelen.
Dus hier voor me hebben we een microvulapparaat dat is samengesteld uit PDMS, wat Polymethyl Sloane is. Het apparaat, het kanaal zelf, de hoogte is 50 micrometer hoog en het totale volume in het apparaat is 10 microliter. Dus dit is een uiterst nauwkeurig apparaat dat we gaan gebruiken om T-helperlymfocyten vast te leggen.
Eigenlijk de diagnostische maatstaf voor HIV-patiënten. Dus het oppervlak van het microfluïdisch apparaat is al voorbereid met eiwit en CD vier positieve antilichamen in de spuit. Op dit moment hebben we alleen PBS biologisch buffer bij een pH van 7,4 en we zullen dit nu in het kanaal laten stromen om de extra CD vier positieve antilichamen weg te spoelen.
In dit stadium hoeft de snelheid niet te worden gecontroleerd omdat we alleen proberen de extra dingen weg te spoelen en het maakt niet echt uit wat onze snelheid is. Dit, dit is waar de ingangen van het apparaat gaan zijn en dit zullen de uitgangen naar onze, naar mijn linkerkant en naar uw rechterkant hier zijn. Dus nu zal ik de extra antilichaamoplossing wegwassen en als je vanuit de uitlaat kunt opmerken, heb je de vloeistof die eruit komt, je weet dat dit een zeer kleine hoeveelheid is, maar als je goed kijkt, kun je zien dat er lucht en vloeistof uit het kanaal door de slang komt.
Dus nu we de extra antilichaamoplossing hebben weggespoeld, kunnen we onszelf nu voorbereiden om het bloed in te spuiten. Dus ik zal nu de slang loskoppelen van de ingang. Dus we zullen een nieuwe spuit openen voor het bloed, menselijk bloed, volbloed.
Dus het is geen monstersteekje van een patiënt, het is een gezond monstersteekje, monstersteekje van een gezond persoon terwijl we onszelf voorbereiden om het bloed in het microfluïdisch apparaat te injecteren. Dus we zullen de spuit aan de spuitpomp bevestigen. Nu zullen we het aanzetten en je kunt de stroomsnelheden van de spuit zien en we hebben het ingesteld op vijf microliter per minuut.
En nu zullen we onszelf voorbereiden om het bloed in te spuiten. We zullen de spuitpomp verticaal plaatsen omdat we weten dat bloedcellen sedimenteren en we willen, we zullen willen dat de cellen in het kanaal stromen. Dus liever dat de cel naar de bodem sedimenteert, die vlak bij onze slang is.
Dus nu is alles klaar om te gaan. Het volume van mijn apparaat is 10 microliter per 10 microliter. En het volume dat we in de kanaalwand willen laten stromen is ook 10 microliter.
Dus ik kan vertellen of ik genoeg bloed instroom door gewoon de kleur van het kanaal te bekijken, als het helemaal rood is en vol, dan weet ik dat ik 10 microliter heb laten stromen en ik moet de spuitknop stoppen. Dus nu zal ik op de startknop drukken en het zal beginnen, soms, soms duurt het even voordat het bloed daadwerkelijk het kanaal in gaat. En dit komt veelal door de druk.
Bijvoorbeeld, wanneer we de spuit erop zetten, zouden we, weet je, soms de vloeistof terugtrekken of injecteren om het bloed in de slang aan te passen. Dus het kan iets duren, maar zodra het begint in een kanaal te pompen, is de stroomsnelheid ingesteld op ly per minuut, wat we willen. Dus we moeten hier een beetje geduld hebben en wachten, soms moet je wachten op twee minuten, drie minuten voordat het bloed in het kanaal begint te gaan.
Eigenlijk kun je nu zien dat het bloed in het kanaal begint te gaan. Dus je kunt zien dat het apparaat nu bijna helemaal vol is. Oké, dus nu zullen we de slang terugzetten naar PBS om het bloed dat in het kanaal zit weg te spoelen.
En om dit te doen zullen we herhalen wat we al hebben gedaan om de slang te verwijderen. Omdat we nog steeds de snelheid van de stroom van de PBS moeten controleren, hebben we nog steeds de spuitpomp nodig. Echter, omdat we geen bloed meer stromen, hoeven we de spuitpomp niet in een verticale positie te laten staan omdat er geen cellen in de PBS zijn.
Dus nu zijn we allemaal klaar en we zullen nu het bloed uit het apparaat spoelen en ik zal hier de scherpe knop weer indrukken. Dus zoals je kunt zien, begint het apparaat op te ruimen. De randen hebben nog steeds wat bloed, maar het verdwijnt langzaam.
Dus zodra al het bloed weg is, zullen we de snelheid verhogen van vijf microliter per minuut naar 20 microliter per minuut. En de reden voor deze verandering is omdat er in het bloed eigenlijk twee celtypen zijn die C vier positieve antigenen hebben. De ene is waarnaar we op zoek waren, de T-helperlymfocyten.
De andere is wat we monocyten noemen. We willen ervoor zorgen dat ons apparaat specifiek alleen de T-helperlymfocyten vastlegt in plaats van zowel de T-helperlymfocyten als de monocyten. En de methode die we daarvoor doen is om de stroomsnelheid te verhogen omdat we weten dat monocyten groter zijn in grootte dan T-helpercellen.
Dus door de stroomsnelheid te verhogen, zullen de grotere monocyten meer druk ervaren om het oppervlak te verlaten dan de CD vier positieve T-helpercellen. Dus nu is het ongeveer 20 minuten geleden. Dus wat ik nu in mijn hand heb, is het een oplossing.
Het wordt faxlicentieoplossing genoemd. Het doel hiervan is om rode bloedcellen te lyseren. Dus waar rode bloedcellen in het kanaal achterblijven, zal deze oplossing het lyseren.
Dit is 10 keer verdund uit de basisoplossing. Dus wat we nu gaan doen is de spuitpomp stoppen, de slang verwijderen en de oplossing in principe vervangen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de kwantificering en captatie van CD4-positieve en C3-positieve T-lymfocyten uit patiëntenbloed met behulp van een microfill-apparaat. Het apparaat is ontworpen voor gebruik in omgevingen met beperkte middelen en demonstreert de precisie en efficiëntie bij het vastleggen van T-helperlymfocyten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Biomedische Techniek
Achtergrond
- CD4-positieve T-lymfocyten spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- In omgevingen met beperkte middelen ontbreekt vaak geavanceerde apparatuur voor celanalyse.
- Microfluïdische apparaten kunnen de precisie van celcaptuur verbeteren.
- Het begrijpen van T-celpopulaties is essentieel voor diverse medische toepassingen.
Doel van de studie
- Om een microfill-apparaat te ontwikkelen voor het vastleggen van specifieke T-lymfocytenpopulaties.
- Om effectieve analyse van T-cellen in uitdagende omgevingen mogelijk te maken.
- Om de toegankelijkheid van immunologische onderzoeksinstrumenten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ontwerp en vervaardiging van een microfluïdisch apparaat op basis van PDMS.
- Karakterisering van de kanaaldimensies en het volume van het apparaat.
- Toepassing van het apparaat voor het opvangen van CD4- en C3-positieve T-lymfocyten.
- Testen van de prestaties van het apparaat onder gesimuleerde omstandigheden met beperkte middelen.
Belangrijkste resultaten
- Het microfill-apparaat heeft T-helperlymfocyten succesvol opgevangen.
- De afmetingen van het apparaat werden geoptimaliseerd voor een effectieve celopvang.
- Het potentieel voor gebruik in omgevingen met beperkte middelen is aangetoond.
- De resultaten wijzen op een hoge precisie bij de kwantificering van lymfocyten.
Conclusies
- Het ontwikkelde microfluïdische apparaat is een veelbelovend instrument voor immunologisch onderzoek.
- Het speelt in op de behoefte aan toegankelijke methoden voor celanalyse.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse klinische en onderzoeksinstellingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze microfluidische benadering maakt nauwkeurige kwantificering en opvang van CD4+ T-lymfocyten uit volbloed mogelijk, waardoor wordt voldaan aan een kritieke behoefte aan toegankelijke immunomonitoring in omgevingen met beperkte middelen. Door de integratie van specifieke antilichaamsopvang met stroomgebaseerde discriminatie van cel-subtypen, ondersteunt deze methode vroege targetvalidatie en biomarkerbeoordeling in HIV-onderzoek. De eenvoud van het platform en de lage eisen aan het monstervolume vergroten het potentieel voor implementatie in gedecentraliseerde diagnostische workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de co-expressie van CD4+ en CD3+ mogelijk om de specificiteit van T-helperlymfocyten bij immuunprofilering te valideren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een wegwerpbare PDMS-chip met gedefinieerde kanaaldimensies (50 µm hoogte, 10 µL volume) voor reproduceerbare celvangst zonder kruiscontaminatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de preparatie van gevangen lymfocyten voor daaropvolgende kleuring en beeldvorming, waardoor gestandaardiseerde uitlezingen van de expressie van oppervlaktemarkers mogelijk worden.
- Operationele waarde: Ondersteunt sequentiële reagensuitwisseling (antibody flush, perfusie met volbloed, PBS-wasbeurt, RBC-lyse) via controle met een spuitpomp, wat standaardisatie van de assay tussen verschillende operators mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt discriminatie tussen monocyten en T-helperlymfocyten mogelijk op basis van grootteafhankelijke retentie bij een verhoogde stroomsnelheid (20 µL/min), waardoor de specificiteit van de gevangen celpopulaties wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Genereert kwantificeerbare ruimtelijke capture-profielen (afstand vanaf de inlaat versus celdichtheid) die correleren met de input-celconcentratie, wat bijdraagt aan de kalibratie van de assay en longitudinale monitoring.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows waarbij fenotypering van immuuncellen inzicht geeft in target engagement en het werkingsmechanisme, in het bijzonder bij immunomodulatoire programma's of de ontwikkeling van vaccins.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten mogelijk met betrekking tot CD4+ subset-frequenties en functionele toestanden in bloedmonsters zonder dat complexe fractionering vereist is.
- Screening: Zorgt voor gestandaardiseerde, reproduceerbare vangst van doellymffocyten, wat de assay-gereedheid ondersteunt voor screeningscampagnes van antilichamen of kleine moleculen.
- Analytics: Levert kwantitatieve gegevens over de ruimtelijke verdeling en dual-marker validatie (CD4+/CD3+) om condities of donoren te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van ex vivo vangst naar fenotypische karakterisering, wat relevant is voor biomarker-validatie in modellen voor infectieziekten.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Het ontwerp van de wegwerpship en de compatibiliteit met spuitpompen maken hergebruik van het platform in meerdere studies mogelijk met minimale hervalidatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit bij de isolatie van immuuncellen door specifieke captatie en fenotypische bevestiging van CD4+ T-helperlymfocyten mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde vloeistofvolumes, gecontroleerde stroomsnelheden (5 µL/min voor captatie, 20 µL/min voor monocyten-exclusie) en gedefinieerde was-/lysisstappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen bij targetvalidatie door betrouwbare, kwantitatieve immuuncelgegevens uit minimaal bewerkte monsters te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van reproduceerbare target-engagementmetrieken in primaire menselijke cellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microfluidische hantering, fluorescente kleuring en microscopie voor nauwkeurige celidentificatie en kwantificering.
- Is afhankelijk van toegang tot spuitpompen, slangsystemen en fluorescentiemicroscopie voor de opstelling en uitlezing.
- Maakt standaardisatie van antilichaamcoating, blokkeren en kleuringsprotocollen tussen gebruikers noodzakelijk om een consistente capture-efficiëntie te garanderen.
- Variabiliteit in primaire bloedmonsters (bijv. hematocriet, leukocytenaantal) moet worden meegewogen bij het interpreteren van de capture-efficiëntie en ruimtelijke profielen.
- Praktische beperkingen omvatten het risico op verstopping van het apparaat bij gebruik van volbloed en de afhankelijkheid van de techniek van de operator voor een optimale start van de stroming en het vermijden van luchtbellen.
