Name: Erkenning van Epidermale Transglutaminase door IgA en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van Rhesus Dermatitis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer hoe je de auto-immuunreactie in huid visualiseert bij rhesusapen met dermatitis herpetiformis. Deze methode gebruikt immunofluorescentie om IgA en epidermale transglutaminase te detecteren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Amanda Tardo, Dr Mostafa Bouljihad, Stephanie Feely, Carol Coyne, Dr Erin Ribka, Dr Pete Didier en Dorothy Kuebler bedanken voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01-DK076653 en 3R01-DK076653-02S1 naar KS en de basis exploitatiesubsidie ​​van de TNPRC RR000164.

1. Huidbiopsie monstername <ol><li> Voorafgaand aan de huid biopsie procedure, intramusculair verdoven dieren met 2,5 mg / kg tiletamine hydrochloride en zolazepam hydrochloride telazol mengsel (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Toezicht op de dieren van de toediening van verdoving tot decubitus en daarna uit hun behuizing. </li><li> Verwijder het haar van de huid van belang gebruik te maken van een Oster Golden A5 Single Speed ​​Clipper Veterinaire met een grootte van 40 blad (Oster Professional Products, McMinnville, TN) en aseptisch bereiden met afwisselende Betadine scrub en alcohol. Secure een steriele fenestrated laken over de geselecteerde biopsie site. </li><li> Met behulp van een steriele techniek, plaats een 4,0 mm Miltex Punch Dermal Biopsie instrument (Miltex, York, PA) tegen de huid, terwijl het draaien van de instrument 180 graden met de klok mee en tegen de klok in met een lichte druk totdat de biopsie punch transecten door de dermale lagen in het subcutane tissue. Verwijder de biopsie monster en pak de doorsneden gedeelte van de huid met een pincet en vrij van het subcutane weefsel. </li><li> Sluit de huid defect met 3-0 nylon hechtdraad bevestigd aan een 3 / 8 cirkel snijden naald (Ethilon, Ethicon, Johnson &amp; Johnson Medical BV, Berkshire, Verenigd Koninkrijk) in een kruisvormig patroon. Geef alle dieren 0,01 mg / kg buprenorfine-hydrochloride (Hospira, Lake Forest, IL), dat intramusculair voor postoperatieve analgesie. </li></ol> 2. Monster verwerking <ol><li> Werken met de huid biopsie monsters van chronische dermatitis en gezonde controle makaken rhesus. Krijgen twee tot drie (4 mm in diameter) monsters biopsie van elk dier. </li><li> Fix eerste monster in zink formaline (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) voor 24 uur, wassen in water gedurende 30 minuten, spoel kort in 70% ethanol, en breng het in ASP300 Leica weefsel processor (Leica Microsystems Inc , Buffalo Grove, KS) waarbij weefsel is uitgedroogd met oplopende gradaties van 70%, 80%, 95% en 100% ethanol 48min elk (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), gevolgd door twee veranderingen van xyleen (Fisher). </li><li> Inbedden in paraffine media (Fisher) voor lange-termijn opslag bij kamertemperatuur. Plaats bij-20oC gedurende 20 min voorafgaand aan de snijden. Bereid 6 micrometer delen met behulp van een roterende microtoom (HM325, Microm International, Waldorf, Duitsland). Plaats secties over betalen dia's (Fisher) en de lucht droog bij 60oC 's nachts. Vlek met hematoxyline en eosine (H &amp; E)-methode (hieronder beschreven). </li><li> Fix tweede monster in 2% paraformaldehyde (USB Corp, Cleveland, OH) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, drie keer wassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), plaats in 30% sucrose (Fisher) voor 4 uur, en in te bedden in oktober bevriezing medium (Sakura Finetek, Torrence, CA). Houden-80 ° C gedurende 20 min voorafgaand aan de snijden. Bereid 15 micrometer secties met behulp van de cryostaat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI). </li></ol> 3. H &amp; E kleuring <ol><li> Deparaffinize insluitenDED delen door drie veranderingen van xylenen (Fisher) en rehydrateren via gesorteerd rietsuikeralcohol: drie veranderingen van 100%, twee veranderingen van 95%, een verandering van 80% en gedestilleerd water, 2 minuten elk. </li><li> Vlek met hematoxyline (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) voor een min en volgen door een kort wassen in stromend leidingwater. </li><li> Tegenkleuring met eosine (Sigma) voor 6 minuten. </li><li> Uitdrogen gekleurde weefsels door middel van 95% en absolute ethanol, twee veranderingen van 2 minuten elk en vervolgens duidelijk in drie veranderingen van xylenen, 3 minuten elk. </li><li> Mount dekglaasje met behulp van Cytoseal Mounting Medium (Richard Allan-wetenschappelijk) over de H &amp; E-gekleurde weefselcoupes. </li></ol> 4. Histopathologische beoordeling Inspecteer de H &amp; E-gekleurde huid biopsie secties onder een lichtmicroscoop met behulp van de 4 - 40x vergroting en Leica microscoop met een SPOT Insight digitale camera (Digital Instruments Inc, Michigan, USA). 5. Immunofluorescentie staining <ol><li> Werken met OKT-embedded skin secties voor immunofluorescentie kleuring. Voorafgaand aan de kleuring, week gedurende 20 min in PBS met 0,2% vis huid gelatine (FSG, Sigma) met 0,1% Triton X-100 (Sigma) om de LGO te verwijderen en het weefsel permeabilize. </li><li> Na het wassen van de glaasjes, incubeer met 10% normaal geit serum (NGS, Sigma), verdund in PBS-FSG gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, in een bevochtigde slide kamer. </li><li> Met het oog op de afzetting van IgA antilichamen en tTG2 visualiseren, incubeer dia's met anti-rhesus IgA en tTG2 primaire antilichamen, verdund in 10% NGS-PBS-FSG gedurende 1 uur. </li><li> Wassen met PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) gedurende 10 min, gevolgd door PBS-FSG gedurende 10 minuten. </li><li> Incubate met secundaire, isotype-specifieke antilichamen gelabeld met Alexa Fluor fluorchroom 488 (groen), 568 (rood) of 633 (blauw) (Molecular Probes-Invitrogen) op 1:1000 verdunning. Gebruik de Topro-3 kleurstof om de kern-DNA te visualiseren. Gebruik maken van de 10% NGS-PBS-FSG als een antilichaam verdunningsmiddel. </li><li> Gebruik maken van de anti-quenching oplossing (Sigma) om de gekleurde weefselcoupes monteren. </li></ol> 6. Confocale imaging Voer beeldvorming met een Leica TCS SP2 True confocale laser scanning microscoop (Leica, Wetzlar, Duitsland), uitgerust met drie lasers (zes lijnen voor excitatie beschikbaar): een argon-laser krypton bij 488 nm (groen), een krypton laser op 568 nm ( rood) en een helium-neon laser bij 633 nm (blauw), dat de spanwijdte van het zichtbare naar het verre-rode kant van het spectrum. Record differentieel interferentie contrast (DIC) beelden voor evaluatie van niet-gemerkte weefsel architectuur. 7. Representatieve resultaten Een voorbeeld van positieve erkenning van de ETG door zowel tTG2 en IgA-antistoffen wordt getoond in Fig. 3A. In overeenstemming met situatie in menselijke patiënten en als gevolg van veel lagere prevalentie van DH-achtige dermatitis dan CD-achtig gluten gevoeligheid ook in de rhesus makaken, zijn de meeste van de huid biopsie monsters zullen naar verwachting show de positieve reactie met tTG2 antistoffen maar zonder de aanwezigheid van IgA tTG2 + + dubbele positieve cellen (afb. 4). Deze DH-niets gevallen, zoals dermatitis gevallen van microbiële oorsprong, zal onthullen een aantal single-positieve IgA + cellen verspreid onder de epitheel, maar niet spectrale overlap tussen de tTG2 en IgA-gelabeld markers (figuren 3B en 4). Daarom is het belangrijk om de volgorde van de voorgestelde testprocedures te onderhouden, te beginnen bij klinisch onderzoek (afb. 1), gevolgd door histopathologische evaluatie (afb. 2) en alleen als er geen andere, meer algemene dermatitis-veroorzakende stoffen kunnen worden geïdentificeerd, confocale microscopie onderzoek van huidbiopten gekleurd voor tTG2 en IgA is gerechtvaardigd. Klinische en / of histopathologische evaluaties alleen zijn niet voldoende voor een positieve diagnose van deze aandoening. In die gevallen waar dubbel-positieve (+ tTG2 IgA +) zijn geïdentificeerd in de omgeving van dermale papillen, DH-achtige dermatitis diagnose kan worden uitgegeven. In een dergelijk geval, de intrekking van dieet glutenen het beheer van gluten-vrij dieet wordt aanbevolen om de dermatitis symptomen te verlichten. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Liesstreek van de EM96 makaak vóór (A) en na (B) intrekking van dieet gluten gedurende 5 weken. Herintroductie van dieet gluten viel samen met de terugkeer van dermatitis (C). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. HE kleuring van EM96 makaak huidbiopten verzameld voor (A) en na (B) intrekking van dieet gluten voor 9 weken. A: Epithelium is verdikt (7-15 lagen van epitheliale cellen) met een dikke korst van oppervlakkige hyperkeratotische cellen geïnfiltreerd met degenererende neutrofielen. Neutrofielen verschijnen ook in het epitheel en worden gemengd met een beperkt aantal lymfocyten, plasma cellen, histiocyten en rond de adnexa in de bovenste dermis. B: Sommige hyperkeratosis is nog steeds aanwezig, epitheliale dikte is genormaliseerd (4-7 lagen) met minimale lymphoplasmacytic infiltratie in de bovenste dermis. C: Normaal buikhuid van FR56 makaken, zonder lymphoplasmacytic infiltratie, is opgenomen ter vergelijking. Vergroting 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Confocale microscopie beelden van EM96 makaak huidbiopten verzameld voor (A) en na (B) intrekking van dieet gluten voor 9 weken. A: IgA vlekken (groen), tTG2 (rood) en Topro-3 nucleair DNA-merker (blauw). Co-lokalisatie van IgA en tTG2 verschijnt in het geel rond het gebied van dermale papilae. B: Huid monster genomen na negen weken van gluten-vrij dieet laat geen IgA in het epitheel, terwijl sommige subepitheliale IgA is nog steeds aanwezig (groen), tTG2 (rood) en Topro-3 nucleair DNA-merker (blauw). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Animal Tag </td><td> Seks [M / F] </td><td> Leeftijd [Jaren] </td><td> Klinische symptomen </td><td> Plasma tTG2 antilichamen </td><td> Dieet [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td> Gezond </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td> Gezond, af en toe diarree </td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td> Chronische idiopathische diarree </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5.0 </td><td> Chronische dermatitis </td><td> + / - (Borderline) </td><td> 1 en 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td> Chronische dermatitis </td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. TNPRC resusmakaken die voor de inzameling van huidbiopten * Dieet 1 - regelmatige aap chow (gluten-bevattende), Diet 2 - gluten-vrij dieet

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Ons nieuw opgerichte niet-menselijke primaat model van gluten gevoeligheid werd onlangs gebruikt om de darmpermeabiliteit veranderingen ten gevolge van dieet gluten 5,6 bestuderen. Plasma tTG2 antilichamen evenals intestinale tTG2 + IgA + deposito&#39;s werden ontdekt in een aantal gluten-gevoelige makaken. Aangezien wij recent geïdentificeerde zeldzame gevallen van idiopathische dermatitis in kolonie rhesus makaken, waar geen gebruikelijke (infectieus / metabole) etiologie kon worden vastgesteld, doel van de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum of de apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nummer / Product Code </td><td> Noot </td></tr><tr><td> Anti-Human IgA-FITC * </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> F-5259 </td><td> 1:100 werkverdunning </td></tr><tr><td> Anti-Human tTG2 </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> MS-300-P1ABX </td><td> 1:100 werkverdunning </td></tr><tr><td> Anti-Mouse IgG1 ** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> A-21.124 </td><td> 1:1000 werkverdunning </td></tr><tr><td> Topro-3 DNA-probe *** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> T-3605 </td><td> 1:1000 werkverdunning </td></tr><tr><td> Zink formaline (Z-fix) </td><td> Anatech Ltd, Battle Creek, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Oktober Invriezen Medium </td><td> Sakura Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal Montage Medium </td><td> Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Afschrikken Oplossing </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (Nylon Suture) </td><td> Ethicon, Johnson &amp; Johnson, Berkshire, Verenigd Koninkrijk </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Punch Dermaal Biopsie Instrument </td><td> Miltex, York, PA </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Oster Golden A5 Single Speed ​​Clipper Vet met een grootte van 40 blad </td><td> Oster Products, McMinnville, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Tissue Processor </td><td> Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> Rotatiemicrotoom </td><td> Microm International, Waldorf, Duitsland </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Leica, Wetzlar, Duitsland </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * Fluoresceïne isothiocyanaat ** Secundaire (Alexa Fluor 568-geconjugeerd) antilichaam gebruikt na tTG2 primair antilichaam ** Dye

erkenning van epidermale transglutaminase door iga en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van rhesus dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is een intestinale digestief enzym dat al gedeeltelijk verteerd dieet gluten bijvoorbeeld gliadine peptiden deamidates. In aanleg gevoelige individuen, tTG2 triggers auto-immune reacties die worden gekenmerkt door de productie van tTG2 antilichamen en hun directe depositie in kleine darmwand 1,2. De aanwezigheid van dergelijke antilichamen vormt een van de belangrijkste kenmerken van de coeliakie (CD). Epidermale transglutaminase (ETG) is een ander lid van de transglutaminase familie die ook kan functioneren als een autoantigen in een kleine minderheid van de CD-patiënten. In deze relatief zeldzame gevallen, ETG triggers een auto-immuun reactie (huiduitslag) klinisch bekend als dermatitis herpetiformis (DH). Hoewel het exacte mechanisme van CD en DH pathogenese is niet goed begrepen, is het bekend dat tTG2 en ETG delen antigene epitopen die door serum antilichamen te herkennen aan zowel cd-als DH patiënten 3,4. (Macaca mulatta) met dermatitis (tabel 1, Fig. 1 en 2) werd gebruikt om de getroffen weefsels te bestuderen. In een dier (EM96) een spectrale overlap van IgA en tTG2 antilichamen (afb. 3) werd aangetoond. De aanwezigheid van de dubbele positieve tTG2 + IgA + cellen werd geconcentreerd in de diepe epidermis, rond de dermale papillen. Dit komt overeen met letsels beschreven in DH patiënten 3. Toen EM96 werd geplaatst op een gluten-vrij dieet, de dermatitis, evenals tTG2 + IgA + deposito&#39;s verdwenen en waren niet meer aantoonbaar (afb. 1-3). Dermatitis echter verscheen, op basis van re-introductie van gluten in de voeding EM96 (niet afgebeeld). In andere makaken met inbegrip van dierlijke met niet verwante dermatitis, werden de tTG2 + IgA + deposito&#39;s niet gedetecteerd. Gluten-vrij dieet-afhankelijke vergeving van dermatitis in EM96, samen met de aanwezigheid van IgA tTG2 + + cellen in de huid suggereren een auto-immuunziekte, DH-achtigemechanisme voor de ontwikkeling van deze aandoening. Dit is het eerste verslag van de DH-achtige dermatitis in een niet-menselijke primaat.

Dermatitis herpetiformis (DH) is een chronische inflammatoire aandoening die wordt gekenmerkt door een auto-immune reactie tussen IgA en epidermale transglutaminase (ETG). DH ontwikkelt zich in een heel klein deel van gluten-gevoelige en / of patiënten met coeliakie. De resultaten van deze studie geven aan dat DH ook kunnen ontwikkelen in een resusaap gastheer met symptomen van idiopatic dermatitis.

Erkenning van Epidermale Transglutaminase door IgA en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van Rhesus Dermatitis

Weefseltransglutaminase 2 (tTG2) is een intestinaal spijsverteringsenzym dat reeds gedeeltelijk verteerde gluten uit de voeding, zoals gliadinepeptiden, deamideert. In ...

Dit video-artikel demonstreert een methode om de auto-immuunreactie in de huid van glutengevoelige Reeses Maccas met dermatitis herpetiformis te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst dieren met dermatitis te identificeren die niet kunnen worden gelinkt aan andere, vaker gediagnosticeerde oorzaken van dermatitis, uit deze idiopathische gevallen plus gezonde controledieren van vergelijkbare leeftijd. Huidmonsters worden afgenomen uit het aangetaste gebied om de weefselarchitectuur, inflammatie en de aanwezigheid van epidermale transglutaminase te evalueren.Monstercollecties van autoantistoffen worden gefixeerd in zinkformaline en 2%paraldehydhematine in EOSIN of HNE. Vervolgens wordt er gekleurd om de mate van ontsteking en histopathologie te evalueren, en wordt er immunofluorescente kleuring uitgevoerd om de afzetting van epidermale transglutaminase-autoantistoffen in de diepe epidermis te evalueren. Dermatitis herpetiformis is een chronische inflammatoire aandoening die wordt gekenmerkt door een auto-immuunreactie tussen IgA en epidermale transglutaminase; DH ontwikkelt zich bij een zeer klein deel van glutensensitieve patiënten met coeliakie. De resultaten van deze studie wijzen erop dat DH zich ook kan ontwikkelen bij een klein deel van glutensensitieve resusapen.Onze resultaten bevestigen de validiteit van het recent ontwikkelde Resus Meac-model voor glutensensitiviteit zoals gepresenteerd. De resultaten tonen aan dat de klinische manifestaties van deze aandoening niet beperkt zijn tot alleen de dunne darm. Een typisch protocol omvat één dier met idiopathische dermatitis en één gezonde controlegroep van dezelfde leeftijd.Na passende anesthesie en voorbereiding van de locatie met steriele techniek, plaatst u een 4,0 millimeter Miltex punch dermale biopsie-instrument tegen de huid van het dier terwijl u lichte druk uitoefent. Draai het instrument 180 graden met de klok mee en tegen de klok in totdat de biopsiepunch door de dermale lagen in het subcutane weefsel dringt. Herhaal dit voor een tweede biopsie met behulp van een pincet.Pak het doorgesneden deel van de huid vast en maak het los van het subcutane weefsel. Plaats het eerste monster, dat bestemd is voor H&amp;E-kleuring, in zinkformaline. Plaats vervolgens het tweede monster, dat via immunofluorescentiemicroscopie zal worden geëvalueerd, in 2% paraformaldehyde met behulp van een driedachtigste cirkelvormige snijnaald met een 3-0 nylon hechtdraad.Sluit het huiddefect met een kruissteek. Herhaal dit proces om twee tot drie biopsiemonsters per dier te verkrijgen. Dien postoperatieve analgesie toe zoals in detail beschreven in het geschreven protocol voor het onderzoeken van de aanwezigheid en lokalisatie van IGA en TTG twee.Begin met het incuberen van de monsters, die in 2% formaldehyde waren geplaatst, gedurende vier uur bij kamertemperatuur om ze te fixeren na de fixatie. Verwijder het paraformaldehyde en was met PBS gedurende 30 tot 60 minuten op een schudplatform. Herhaal dit twee keer voor een totaal van drie wasbeurten, verwijder vervolgens de PBS en vervang deze door 30% sucrose voor ten minste vier uur en tot maximaal twee weken.Plaats vervolgens het monster in OCT-vriesmedium en dompel het onder in een bad van trimethylbutaan en droogijs totdat het heldere OCT solide wit wordt, wat aangeeft dat het volledig bevroren is. Plaats de blokjes daarna gedurende ten minste 20 minuten bij -80 °C. Dit zorgt ervoor dat het weefsel volledig is bevroren, zodat het mes erdoorheen kan snijden zonder het te verbrijzelen.Het weefsel kan langdurig bewaard worden in OCT bij -80 °C. Na het maken van coupes en het monteren van de coupes op objectglazen, wordt het OCT verwijderd om het weefsel te permeabiliseren. Dompel de objectglazen onder in een Copeland-pot met PBS met 0,2% vis huidgelatine en 0,1% Triton X 100.Plaats de pot vervolgens gedurende 20 minuten op een rocker. Was de objectglazen na 20 minuten gedurende 10 minuten in PBS met 0,2% vishuidgelatine, en incubeer ze vervolgens gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde objectglaskamer met 10% normaal geiten serum verdund in PBS met 0,2% vishuidgelatine. Incubeer de objectglazen elk afzonderlijk gedurende één uur met anti resus IGA en TTG primaire antilichamen. Spuit vervolgens, terwijl u het objectglas bij de randen vasthoudt, voorzichtig P-B-S-F-S-G Triton X 100 op het glas met behulp van een transferpipet.Plaats het vervolgens in een Copeland-pot met dezelfde buffer. Zet de pot daarna 10 minuten op een rocker. Herhaal de wasstap één keer.Voer vervolgens een wasstap uit met P-B-S-F-S-G gedurende 10 minuten. Incubeer na de incubatie gedurende 40 minuten met isotype-specifieke Alexa fluor-gelabelde secundaire antilichamen. Was de slide zoals voorheen.Voeg vervolgens de nucleaire DNA-kleuring toe aan het Pro Three anti-quenching monteermedium bij een verdunning van 1:2000. Breng een druppel van het medium direct aan op elk objectglas. Plaats vervolgens een dekglas over het weefsel en verzegel dit met nagellak.Plaats het preparaat in het donker en laat het drogen. Om de dubbele kleuring van IGA en TTG te visualiseren, voert u beeldvorming uit met een confocale laserscanningmicroscoop die is uitgerust met de juiste lasers voor de secundaire antilichamen die zijn gebruikt voor de evaluatie van het niet-gelabelde weefselrecord. Maak beelden met differentiële interferentiecontrast, DIC.DIC is een kanaal binnen de microscoop dat het weefsel op een grijsschaal weergeeft. Dit maakt het mogelijk om de cellulaire architectuur beter te bepalen voor het uitvoeren van HNE-kleuring. Het monster dat in zinkformaline was geplaatst, wordt eerst in paraffine ingebed en in coupes op objectglazen gesneden.De objectglazen worden vervolgens een nacht gebakken bij 60 °C en geplaatst in een automatische kleurer, die de objectglazen kleurt met HNE zodra de kleuring voltooid is. Inspecteer de gekleurde biopsiedelen onder een lichtmicroscoop uitgerust met een digitale camera met behulp van Forex en een 40 x vergroting. Leg drie tot vier beelden vast voor elke vergroting. Biopsie monsters van huidlaesies van Reuss Maca werden verkregen en gekleurd zoals beschreven in deze video om het effect van het onttrekken van glutenvrij dieet op dermatitis hier te bestuderen.De liesregio van één makaak wordt getoond voordat dietary gluten werden weggenomen. Wanneer dit dier een glutenvrij dieet kreeg, verdween de dermatitis en was deze niet langer detecteerbaar, zoals hier te zien is. Dermatitis verscheen opnieuw na herintroductie van dietary gluten om de weefselarchitectuur te evalueren.H&amp;E-kleuring werd uitgevoerd vóór het onttrekken van gluten. Het epitheel was verdikt met zeven tot 15 lagen epitheelcellen en een dikke oppervlakkige korst van hyperkeratotische cellen, geïnfiltreerd met degenererende neutrofielen. Na negen weken glutenvrij dieet waren er ook neutrofielen zichtbaar in het epitheel, vermengd met een matig aantal lymfocyten, plasmacellen en histiocyten rondom de adnexa in de oppervlakkige dermis.Er was nog steeds sprake van enige hyperkeratose en een verdikt epitheel, maar ter vergelijking was er slechts minimale lymfoplasmacytaire infiltratie in de bovenste dermis aanwezig. Hier wordt normale abdominale huid getoond, zonder epitheliale verdikking en zonder lymfoplasmacytaire infiltratie van de bovenste dermis. Confocale microscopiebeelden van dezelfde huidbiopten van maca's, afgenomen vóór het stopzetten van glutenvrij dieet; colocalisatie van IGA (getoond in groen) en ttg twee (getoond in rood) verschijnt in geel rond het gebied van de dermale papillen, wat duidt op de aanwezigheid van autoantistoffen tegen epidermale transglutaminase.De to pro drie nucleair DNA-marker is in het blauw weergegeven na negen weken van een glutenvrij dieet. IgA werd niet langer waargenomen binnen het epitheel, wat duidt op de afwezigheid van auto-antilichamen tegen epidermale transglutaminase, die in het geel zouden worden weergegeven. Enige subepitheliale IgA, weergegeven in het groen, was nog steeds aanwezig; de to pro drie nucleair DNA-marker is in het blauw weergegeven bij andere Macau's, waaronder een dier met niet-gerelateerde idiopathische dermatitis.Autoantistoffen werden niet gedetecteerd. De IgA-kleuring is groen, ttg2 is rood en de TO-Pro3 nucleaire DNA-marker is blauw. De ttg2-positieve cellen bevinden zich in het epitheel.Een paar IgA-positieve cellen onder het epitheel. Er is geen uitgebreide spectrale overlap tussen de rode en groene markers zichtbaar, wat duidt op de afwezigheid van autoantilichamen tegen epidermale transglutaminase. In deze studie gebruiken we confocale microscopie om de aanwezigheid van IgA-autoantilichamen tegen epidermale transglutaminase te visualiseren.Bij het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om te onthouden dat de meeste gevallen van dermatitis niet worden veroorzaakt door glutensensitiviteit. Daarom moeten vooraf andere methoden worden toegepast, waaronder serumonderzoek, detectie van anti-gliadine- en anti-weefseltransglutaminase-antilichamen, evenals een zorgvuldige klinische evaluatie. Ondanks dit is de prevalentie van dermatitis herpetiformis lager dan de prevalentie van de beschreven glutensensitieve enteropathie.De resultaten vormen de basis voor toekomstig onderzoek, ervan uitgaande dat er aanvullende dieren met deze aandoening worden geïdentificeerd.

recognition-epidermal-transglutaminase-iga-tissue-transglutaminase-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In het diermodel beschreven in onze huidige werk gezuiverde IgG antilichamen tegen een stuk van 200 aminozuren (aa 757-967) van collageen VII herhaaldelijk geïnjecteerd in muizen reproduceren blaarvorming fenotype en de histo-en immunopathologische kenmerken vertonen de menselijke epidermolysis bullosa acquisita...

Granulocyt-afhankelijke auto-antilichaam-geïnduceerde blaarvorming

Hier beschrijven we twee assays voor het meten van complement activatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen. Het grote voordeel boven de huidige assays is de kwantitatieve en eenvoudig te interpreteren natuur.

Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Is beschreven het protocol tot zelf-reactieve CD4 T-cellen te detecteren in de hersenen en het hart door directe kleuring met hoofdhistocompatibiliteitscomplex klasse II dextramers in dit rapport. Voor uitgebreide analyse is een betrouwbare methode om de frequentie van antigeen-specifieke CD4 + T-cellen in situ sommen ook ontwikkeld.

In Situ Detectie van autoreactieve CD4 T-cellen in de hersenen en het hart met behulp van Hoofdhistocompatibiliteitscomplex Klasse II Dextramers

Hier voorgesteld hebben we de methoden voor het detecteren van menselijke islet autoantilichamen met behulp van electrochemiluminescence (ECL) testen. Het protocol, gebruikt voor het voorspellen van type 1 diabetes, kan worden uitgebreid om te detecteren autoantilichamen voor andere auto-immune ziekten.

Electrochemiluminescence testen voor menselijke Islet autoantilichamen

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Dit document stelt een protocol voor het opsporen van serum specifieke immunoglobuline met een cartridge gebaseerde Chemoluminescentie-systeem van microfluidic en de evaluatie van het nut ervan in allergie diagnoses.

Toepassing van Biochip Microfluidic technologie te detecteren Serum allergeen-specifieke Immunoglobulin E (sIgE)

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de scheiding van epidermis van dermis om de productie van ontstekingsmediators te evalueren. Na ontsteking wordt de epidermis van de achterpoot van de rat gescheiden door thermolysine bij 4 °C.  De epidermis wordt vervolgens gebruikt voor mRNA-analyse door RT-PCR en eiwitevaluatie door westerse vlek en immunohistochistry.

Scheiding van rat epidermis en dermis met thermolysine om site-specifieke inflammatoire mRNA en eiwit te detecteren

Dit protocol maakt gebruik van G6PI gemengde peptiden om reumatoïde artritis modellen die dichter bij die van de menselijke reumatoïde artritis in CD4+ T cellen en cytokines construeren. Hoge zuiverheid invariant natuurlijke killer T cellen (voornamelijk iNKT2) met specifieke fenotypes en functies werden verkregen door in vivo inductie en in vitro zuivering voor adoptieve immunotherapie.

Adoptieve immunotherapie van iNKT-cellen in glucose-6-fosfaat-isomerase (G6PI)-Geïnduceerde RA-muizen

We modelleren een eenvoudige multiplexed ECL-test die 7 autoantilichaamtests samen combineert. De test is in staat om tegelijkertijd te screenen op T1D en meerdere andere auto-immuunziekten, waaronder coeliakie, auto-immuun schildklierziekte en auto-immuun polyglandulair syndroom 1.

Een high-throughput elektrochemiluminescentie 7-Plex-test die tegelijkertijd screent op type 1 diabetes en meerdere auto-immuunziekten

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om driedimensionale gereconstitueerde menselijke epidermis op een reproduceerbare en robuuste manier te cultiveren. Bovendien kenmerkt het de structuur-functierelatie van het epidermale barrièremodel. De biologische reacties van de gereconstitueerde menselijke epidermis op pro-inflammatoire stimuli worden ook gepresenteerd.

Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

Huidlaesies zijn veel voorkomende en belangrijke kenmerken bij veel reumatische aandoeningen, en biopsie met pathologische analyse speelt een cruciale rol bij de diagnose. Dit artikel geeft een gedetailleerd overzicht van de gestandaardiseerde huidbiopsieprocedure en, met discoïde lupus erythematosus als voorbeeld, belicht de essentiële rol van dermatopathologie bij het diagnosticeren van reumatische aandoeningen.

Huidbiopsie voor het diagnosticeren van discoïde lupus erythematosus

Leer hoe je de auto-immuunreactie in huid visualiseert bij rhesusapen met dermatitis herpetiformis. Deze methode gebruikt immunofluorescentie om IgA en epidermale transglutaminase te detecteren.

Erkenning van Epidermale Transglutaminase door IgA en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van Rhesus Dermatitis (Video) | JoVE Journal

Erkenning van Epidermale Transglutaminase door IgA en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van Rhesus Dermatitis

Meer video's verkennen