Name: A Simple Guide Schroef Methode voor Intracraniële xenograft Studies in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer de gidschroefmethode voor intracraniële xenograftstudies bij muizen om glioomtherapieën te testen. Deze techniek biedt een veiliger en efficiënter alternatief voor stereotactische benaderingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Verlene Henry en Lindsay Holmes bedanken voor de hulp bij de ontwikkeling van dit model. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de James S. McDonnell Foundation (# 220020173).

1. Cellijnen <ol><li> U87MG glioma cellen worden gekweekt in grote weefselkweek kolven met DMEM-F12 aangevuld met 5% foetaal bovine serum (FBS). </li><li> Cellen worden geoogst door het wassen kolven tweemaal met warm fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en incuberen ze op 37 ° C gedurende 5 minuten met 10 ml PBS, met 0,25% trypsine en 0,05% EDTA. Zodra cellen zijn opgeheven, zijn ze geplaatst in een 50 ml buis met 10 ml van de cultuur media en gecentrifugeerd (300 X g voor 4 min). </li><li> Na het wassen, worden de cellen geresuspendeerd bij een concentratie van 10 x 10 6 / ml in cultuur media, waardoor voor een inenting van 50.000 cellen / ul 5. </li><li> Cellen worden bewaard op ijs tot intracraniële injectie. </li></ol> 2. Gids schroef intracraniële bouten Deze procedure kan worden uitgevoerd enkele dagen voorafgaand aan de injectie van de cellen. Alle hier beschreven procedures zijn uitgevoerd onder strikte steriele omstandigheden. <ol><li> Muizen (BALB / c nu / nu vrouw, 5-6 weken, ongeveer 18 g) zijn genummerd voor identificatiedoeleinden, gewogen en onder narcose met een intraperitoneale (IP) injectie van een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg). </li><li> De huid wordt afgeveegd neer met een jodium-oplossing en een kleine incisie (2-3 mm) is gemaakt langs de rechterkant van de middellijn en anterior naar de interaurale lijn. Dit onthult de coronale en sagittale hechtingen van de schedel. De bregma is geplaatst op de kruising van deze twee hechtingen. </li><li> De gids schroef entry point is dan gemarkeerd op een punt 2,5 mm lateraal en 1 mm juist voor de bregma. Dit punt bevindt zich direct boven de nucleus caudatus 1. </li><li> A 1 x 1 mm diep gat is geboord met een steriele hand gehouden spiraalboor door de schedel naar de dura. </li><li> Een gesteriliseerde gids schroef die 1,6 mm verlengt onder het oppervlak van schedels in de dura wordt dan vastgeschroefd in het gat met een schroevendraaier tot gelijk met de schedel (figuur 1a). </li><li> Een steriele stilet of schroef dummy wordt dan geplaatst in het centrale gat van de gids schroef aan de opening (Figuur 1B) te sluiten. </li><li> De wond wordt gesloten met Vetbond Tissue Adhesive (n-butyl cyanoacrylaat) en de muizen krijgen een intraperitoneale injectie van reversine (kleine dieren) (0,1 ml / kg) en carprofen (5 mg/kg/100 ul) voor pijnstilling. Muizen worden dan toegestaan ​​om terug op een warming mat (36 ° C), die kan oplopen tot 20 minuten. Muizen worden vaak gecontroleerd en waargenomen tijdens deze herstelperiode tot ze volledig bij bewustzijn. </li></ol> 3. Intracraniële cellulaire aanslaan <ol><li> Een steriele geboeid Hamilton spuit wordt bereid door het aanbrengen van een klein plastic ring om de naald zodat alleen 2 mm van de naald uit te breiden onder de gids schroef uitlaat (Figuur 1B). De laatste inoculatie punt is dan ook 3,5 mm onder de schedel oppervlak. </li><li> Vier dagen na de gids schroef operatie, de muizen weer verdoofd als hierboven (2.1) en een kleine incisie wordt gemaakt over de gids schroef om de stilet verwijderen. </li><li> De geboeid Hamilton spuit is vervolgens gevuld met 5 pi van goed gemengd cellen die voorzorg niet te maken of op te stellen eventuele luchtbellen. </li><li> De spuit is bevestigd aan de perfusie pomp en de naald wordt ingebracht in de gids schroef (figuur 1C). De cellen worden vervolgens toegediend met een snelheid van 30 ul per uur. </li><li> De geautomatiseerde apparatuur (figuur 1D) liet ons toe om maximaal te injecteren tot 10 dieren in een tijd op een constant debiet. Cellen kunnen ook handmatig worden geïnjecteerd met behulp van de handboeien hamilton spuit of als alternatief de spuit kan worden geboeid door een 200 ul pipettip die is gegarneerd met 3 mm, zodat de naald tot voorbij de gids schroef uit te breiden met 2 mm. De injectie moet dan worden uitgevoerd bij een constante gestaag tempo. </li><li> Wanneer infusie is voltooid, is de spuit zorgvuldig verwijderd en de stilet wordt vervangen in de gids schroef. De wond is gelijmd gesloten en de muizen worden gegeven herstel van medicijnen als voorheen (2.7) en om te herstellen op een warming mat. </li></ol> 4. Therapeutische uitdaging <ol><li> Vier dagen na de inoculatie U87MG cel, zijn muizen gewogen en willekeurig verdeeld in controle en behandeling van groepen. </li><li> De controle groep krijgt een intra-peritoneale (IP) injectie van PBS (100 pl), terwijl de behandelde groep krijgt een IP-injectie van AMG102 (100 ug in 100 ul PBS). </li><li> Injecties worden herhaald om de tweede dag gedurende 14 dagen, in totaal 6 injecties (figuur 2). </li><li> Na de laatste injectie, zijn muizen dagelijks gecontroleerd en gewogen om de dag. </li><li> Als muizen begon te significante neurologische disfuncties (evenwicht stoornis, verlamming), uitdroging, of meer dan 10% gewichtsverlies of stervende weer te geven, werden ze humaan afgemaakt. Deze humane eindpunt dag werden vervolgens opgenomen op de Kaplan-Meier survival curve. </li></ol> 5. Evaluatie van de therapeutische efficiëntie <li> De Kaplan-Meier survival curve werd gegenereerd met behulp van GraphPad Prism 4.03 voor Windows; GraphPad Software, San Diego California USA, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. Sterfgevallen of euthanizations werden gemarkeerd als eindpunt gebeurtenissen en scoorde als 1. Dieren die in leven bleef op het einde van het experiment werden geregistreerd als niet-events en scoorde als 0. </li> 6. Representatieve resultaten: Controle dieren begon te tekenen van neurologische verstoring en gewichtsverlies 23 dagen zien na de eerste inoculatie van cellen. Dit was significant vertraagd in de AMG102 behandelde groep tot 35 dagen. Inderdaad door de dagen 35, 77% (n = 7 / 9) van de controle groep was ingeslapen. De Kaplan-Meier survival curve toont duidelijk de sterke toename in overleving in reactie op AMG102 behandeling (figuur 3). Per dag 70, had 88% van de controle muizen zijn gedood (n = 8 / 9) in vergelijking met 37% (n = 3 / 8) van AMG102 behandelde groep. Histologische analyse van de hersenen bevestigd dat alle 9 dieren in de controlegroep ontwikkelden tumoren in vergelijking met slechts 3 van de 8 AMG102 behandelde muizen (figuur 4). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Image (A) laat zien intracraniële gids schroef geplaatst in een gebied gelegen direct boven de nucleus caudatus. De geboeid hamilton spuit (vooraf geladen met cellen) wordt dan geplaatst in de gids schroef zodat 2 mm van de naald gaat verder dan de gids en de cellen worden ingespoten 3,5 mm binnen de nucleus caudatus. De spuit is later verwijderd en vervangen door een stilet (B). De automatische infusie apparaat (C) kan injecteren tot 10 dieren tegelijk. Hier worden vijf gelijktijdige injecties (D). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: Schematische weergave van studie protocol. Cellen werden geïnjecteerd op dag 0 met de behandeling begint op dag 4. Controle dieren kregen een injectie van PBS (100 ul) IP, terwijl de behandelde groep kreeg een injectie van AMG102 (100 μg/100 pi) IP. Deze injecties werden gegeven om de tweede dag gedurende 10 dagen. Een totaal van zes injecties werden gegeven. Dieren werden vervolgens gecontroleerd op 70 dagen op tekenen van neurologische en lichamelijke stoornissen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: Kaplan-Meier survival curve te vergelijken controle en AMG102 behandelde muizen. Significant overlevingsvoordeel werd verkregen na de behandeling met AMG102 (p = 0,005). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: microfoto's van coronale hersenen secties tonen de ontwikkeling van tumoren in de controle dieren (A) en geen hersentumor ontwikkeling in de AMG102 behandelde dieren (B). Schaal bar is 1 mm.

<ol><li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li>
<li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMG+102%2C+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+neutralizing+antibody%2C+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li>
<li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+oncogene+addiction%3A+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li>
<li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li>
<li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+%28rilotumumab%29+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li>
<li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li>
<li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+brainstem+tumor+model%3A+functional+and+histopathological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li>
<li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels%2C+activation+status%2C+and+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li>
<li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li>
<li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li>
</ol>

Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksbeurs van Amgen Inc

De hier gepresenteerde methode met een intracraniële geleideschroef maakt de snelle en reproduceerbare vestiging van intracraniële xenografts mogelijk en deze procedure kan door een getrainde diertechnicus zeer eenvoudig worden uitgevoerd zonder dat er een stereotactisch apparaat nodig is. Onze methode combineert het gebruik van een geleideschroef, om nauwkeurig het hersengebied te lokaliseren dat het meest geschikt is voor in vivo tumorgroei, met een geautomatiseerde infusiepomp die de gelijktijdige inoculatie van maximaal 10 dieren tegelijk mogelijk maakt. De procedure voor de plaatsing van de geleideschroef neemt minder dan 5 minuten in beslag. De geautomatiseerde infusie van cellen bij 30 μl/uur duurt slechts 10 minuten voor een volume van 5 μl. Dit garandeert een nauwkeurige dosering bij een constante snelheid en vermindert het risico op celuitstoting naar het extracraniële gebied als gevolg van verhoogde intracraniële druk. We hebben deze procedure ook uitgevoerd met volumes van 10 μl en hebben geen extracraniële tumorgroei waargenomen als gevolg van cellulaire reflux. Omdat de geautomatiseerde infusiepomp ook toelaat dat meerdere dieren gelijktijdig worden geïnoculeerd, kunnen we tot 60 dieren per uur injecteren, in vergelijking met een stereotactische procedure die beperkt is tot ongeveer 15 dieren per uur.
De meest kritische stap in deze procedure is de plaatsing van de geleideschroef in de schedel, aangezien de positie hiervan de uiteindelijke locatie van de tumormassa bepaalt. Als de geleideschroef te centraal staat, worden de cellen geïnjecteerd in een gebied tussen de twee hersenhelften, terwijl de cellen bij een te ver naar voren geplaatste geleidingsschroef helemaal niet in de hersenen worden geïnjecteerd. Het is daarom essentieel om zo nauwkeurig mogelijk de geleiding te positioneren op 2,5 mm lateraal en 1 mm anterieur ten opzichte van het bregma1. In deze studie hebben we een stalen geleideschroef gebruikt, hoewel plastic geleideschroeven ook beschikbaar zijn voor studies waarbij hersenbeeldvorming zoals MRI of PET vereist is6. Zelfs als een automatische infusiepomp voor sommige groepen te kostbaar is, kunnen cellen nog steeds handmatig sneller worden geïnjecteerd dan bij stereotactische benaderingen. Over het algemeen kan deze snelle, nauwkeurige en reproduceerbare methode worden gebruikt om gliomen, medulloblastomen en hersenstamtumoren te bestuderen7. Deze procedure is in onze twee laboratoria bij meer dan 500 muizen uitgevoerd, waarbij sterfgevallen door onverwachte anesthetische reacties zeer gering waren (&lt;1%). Muizen waarbij de geleideschroef was gefixeerd en die vervolgens met cellen waren geïnfuseerd, zijn niet gestorven en hadden geen neurologische complicaties als gevolg van de procedure. Dieren zijn langer dan 100 dagen overleefd zonder complicaties. Hoewel we bij voorkeur een haarloze muis gebruiken, zou een immuungecompromitteerde muis met haar, zoals de SCID, net zo geschikt zijn, mits het haar op de schedel vóór de operatie is verwijderd om de plek schoon te houden en te voorkomen dat haar de geleideschroef hindert.
Er worden momenteel verschillende nieuwe therapeutica ontwikkeld voor de behandeling van glioom8-10. Onlangs hebben we aangetoond dat subcutane U87MG-glioomxenografts kunnen worden geremd door behandeling met AMG1023; een gehumaniseerd antilichaam gericht tegen HGF dat momenteel klinisch wordt geëvalueerd bij glioom5. We hebben de hier beschreven methode gebruikt om intracraniële U87MG-tumoren te vestigen in de hersenen van naakte muizen. Ons onderzoek toont duidelijk het nut van de methode aan en bewijst dat AMG102 de groei van orthotope U87MG-xenografts significant remt. We zullen dit model blijven gebruiken om te bepalen welke andere therapeutica in combinatie met AMG102 kunnen worden ingezet om een effectievere remming van de tumorgroei te verkrijgen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> Speciale functies </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c nu / nu muizen </td><td> ARC Perth </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schroef de houder </td><td> Plastics Een </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> Boor Holder </td><td> Plastics Een </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Boor </td><td> Plastics Een </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> Schroef gids (metaal) </td><td> Plastics Een </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> Schroef Dummy (stylus) </td><td> Plastics Een </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton spuit (10 ui 26g geharde naald) </td><td> Grace Division Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 22/2000 infuuspomp </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 70-2003 </td><td> Facultatief </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Thermo pad </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple guide schroef methode voor intracraniële xenograft studies in muizen

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Het enten van menselijke tumorcellen in de hersenen van muizen immunosuppressie is een gevestigde methode voor de studie van de hersenen kanker inclusief glioblastoma (glioom) en medulloblastoom. De meest gebruikte stereotactische aanpak alleen toestaat voor de injectie van een enkel dier in een tijd, is arbeidsintensief en vereist zeer gespecialiseerde apparatuur. De gids schroef methode, oorspronkelijk ontwikkeld door Lal et al.., 1 werd ontwikkeld om omslachtige stereotactische procedures te elimineren. We hebben nu beschrijven een aangepaste gids schroef aanpak die is snel en uitzonderlijk veilig, die beide een kritische, ethische overwegingen. Met name onze werkwijze omvat nu een infusiepomp waarmee maximaal 10 dieren tegelijk worden geïnjecteerd met tumorcellen. Om aan te tonen het nut van deze procedure, wij menselijke U87MG glioomcellen opgericht als intracraniële xenotransplantaten in muizen, die vervolgens werden behandeld met AMG102, een volledig humaan antilichaam gericht op HGF / verstrooien factor ondergaat momenteel klinische evaluatie 2-5. Systemische injectie van AMG102 verlengde significant de overleving van alle muizen met intracraniële U87MG xenografts en resulteerde in een aantal volledige genezing. Deze studie toont aan dat de gids schroef-methode is een goedkope, zeer reproduceerbaar aanpak voor het vaststellen van intracraniële xenotransplantaten. Bovendien biedt een relevante fysiologische model voor de validatie van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van hersentumoren.

Met het oog op nieuwe therapeutische paradigma&#39;s voor de behandeling van gliomen te evalueren, fysiologisch relevante modellen zijn essentieel. We maken gebruik van een implanteerbare gids schroef procedure voor de oprichting van intracraniale xenotransplantaatmodellen dat is sneller en veiliger dan stereotactische benaderingen.

A Simple Guide Schroef Methode voor Intracraniële xenograft Studies in Muizen

Het enten van menselijke tumorcellen in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen is een gevestigde methode voor de studie van hersenkankers, waaronder glioblastoom ...

Het doel van deze procedure is om een intracraniale graft van hersenkanker te genereren om de effectiviteit van een nieuw therapeutisch middel te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst een geleideschroef in de schedel te plaatsen en vervolgens cellen via de geleideschroef in de hersenen te infuseren. De volgende stap is het starten van een therapeutische challenge gericht op de tumorcellen die zich in de hersenen hebben gevestigd.De dieren worden vervolgens gemonitord op therapeutische responsen door de overlevingsuitkomsten te evalueren. Uiteindelijk kunnen therapeutische middelen de tumorgroei en overleving in behandelingsgroepen beïnvloeden in vergelijking met de controlegroepen. Deze procedure kan enkele dagen vóór de celinjectie worden uitgevoerd.Begin met het wegen van de muizen en anestheseer ze met een mengsel van ketamine en xylazine via een intraperitonele injectie. Zodra de muizen niet meer reageren op een knijpreflex in de teen, bereid de hoofdhuid voor met jodium en maak vervolgens een incisie van twee tot drie millimeter langs de rechterkant van de middenlijn en anterieur ten opzichte van de interorbitale lijn. Deze incisie legt de coronale en sagittale suturen van de schedel bloot.De bgma bevindt zich op het kruispunt van deze twee suturen. Markeer de ingang van de geleideschroef 0,2 0,5 millimeter lateraal ten opzichte van de bgma en één millimeter anterieur ten opzichte van de bgma. Dit punt bevindt zich direct boven de CAU eight nucleus.Gebruik nu op de markering een handboor om een gat van één millimeter diep in de dura-bout te maken. Draai een gesteriliseerde geleideschroef in het gat totdat deze gelijkvlak met het schedeloppervlak ligt. Zorg ervoor dat u stopt met het verder aandraaien van de schroef zodra deze het oppervlak van de schedel raakt.Als de schroef in de schedel indringt, kan de schedel fractureren. De geleideschroef ondersteunt een 26 gauge naald met een lengte van 1,6 millimeter. Plaats een dop of een dummy-schroef in de geleider om de opening van de geleideschroef te sluiten.Schroef nu vast. Sluit de wond door de ingesneden huid met een pincet bij elkaar te houden en de huid te verlijmen met een druppel vet bond en deze langs de snijrand van de huid uit te smeren; houd de huid enkele seconden vast tot deze is gehecht. Dien ten slotte een omkeermiddel en carprofen-analgetica toe via een intraperitonele injectie en laat de muizen herstellen op een warmtemat.Het herstel kan tot 20 minuten duren. Voor het voorbeeldexperiment werden U 87 mg glioma-cellen gekweekt in grote weefselkweekflessen met D-M-E-M-F 12 aangevuld met 5% foetaal runderserum. Deze sectie beschrijft hoe deze cellen op de dag van de injectie moeten worden voorbereid voor injectie.Oogst de cellen door de fles eerst twee keer te wassen met warme PBS. Voeg vervolgens 10 milliliters PBS toe die 0,25%trypsine en 0,05%EDTA bevat en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende vijf minuten of totdat ze zijn losgekomen. Verzamel de cellen vervolgens in 10 milliliters medium.Plaats de cellen op een hemocytometer en tel de cellen onder een microscoop. De 50 milliliter conische buis met 10 milliliter kweekmedium en cellen wordt gecentrifugeerd bij 300 ×g gedurende vier minuten. Resuspendeer de cellen na het centrifugeren in kweekmedium tot een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter. Bij deze concentratie bevat elke vijf µL cel-suspensie 50.000 cellen, wat wordt gebruikt voor elke intracraniale injectie.Bewaar de celsuspensie voor de injectie op ijs. Hier is een enkel volume celsuspensie vereist, aangezien volumes van vijf µL gemakkelijk verdampen en zo de cellen zouden vernietigen. Begin met het voorbereiden van een Hamilton-spuit met manchet.Bevestig een kleine plastic ring aan de naaldpunt, zodanig dat er slechts twee millimeter van de naald onder de uitgang van de geleideschroef uitsteekt. Dit zorgt ervoor dat het inoculatiepunt 3,5 millimeter diep ligt. Anestheseer een eerder geaugmenteerde muis en maak een kleine incisie boven de geleideschroef. Verwijder de stylet.Vul vervolgens de spuit met 5 µL van de goed gemengde cellen die op ijs zijn bewaard. Let erop dat er geen luchtbellen in de spuit terechtkomen, omdat deze een embolie kunnen veroorzaken of ertoe kunnen leiden dat cellen uit de injectieplaats worden teruggestuwd. Bevestig de spuit aan de perfusiepomp en plaats daarna de naald in de geleider.Start de celinfusie met een snelheid van 30 µL per uur. Met behulp van het geautomatiseerde apparaat kunnen tot 10 dieren tegelijkertijd worden geïnjecteerd met een constante stroomsnelheid. Handmatige injectie is ook mogelijk, mits dit in een constant en gestaag tempo gebeurt.Wanneer de infusie is voltooid, verwijdert u voorzichtig de spuit en plaatst u vervolgens de stylet opnieuw in de geleidingsschroef zoals eerder beschreven. Sluit de wond met vet bond, dien pijnstillers toe en laat de muizenstherapie herstellen. Het herstel kan tot 20 minuten duren.Vier dagen na de inoculatie met U 87 mg-cellen werden de muizen gewogen en willekeurig verdeeld in controle- en behandelgroepen. De controlegroep kreeg een intraperitonele injectie van 100 µL PBS en de behandelgroep kreeg een intraperitonele injectie van 100 µg per 100 µL MG 1 0 2. De injectie werd om de dag herhaald gedurende 14 dagen, voor een totaal van zes injecties.Na de laatste injectie werden de muizen dagelijks gecontroleerd en om de dag gewogen. Het eindpunt voor het dier werd gedefinieerd als het optreden van significante neurologische dysfuncties zoals balansverstoring of verlamming, dehydratie, een gewichtsverlies van meer dan 10% of overlijden. De dagen tot het eindpunt werden vastgelegd als Kaplan-Meier overlevingscurves.Sterfgevallen, of calls die als eindpunten werden aangemerkt, werden geregistreerd als events en scoorden als één. Dieren die aan het einde van het experiment nog in leven waren, werden geregistreerd als non-events en scoorden nul als controle. Dieren begonnen tekenen van neurologische stoornissen en gewichtsverlies te vertonen 23 dagen na de initiële inoculatie van cellen.Dit was significant vertraagd in de groep behandeld met A MG 1 0 2. Op dag 35 waren 7 van de negen controledieren geëuthanaseerd. Op dag 78 waren negen van de controledieren geëuthanaseerd, vergeleken met slechts drie van de 8:00 AM g 1 0 2 behandelde dieren.Histologische analyse van de hersenen bevestigde dat alle negen dieren in de controlegroep tumoren ontwikkelden, vergeleken met slechts drie van de om 8:00 uur met g 1 0 2 behandelde muizen.

a-simple-guide-screw-method-for-intracranial-xenograft-studies-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

Source: Liou, C. et al. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the intracranial injection of short-chain fatty acids (SCFAs) in a freely moving mouse to study their effects on brain-mediated behavior. An injector cannula is inserted into a guide cannula implanted in the mouse brain. After recovery, the mouse acclimates in a novel cage. SCFAs are then administered, and locomotor behavior is recorded.

Intracranial Injection of Gut-Derived Microbial Metabolites in a Mouse Model

A Novel Hoge-resolutie<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.

Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

Stamcellen zijn veelbelovende therapeutische dragers om hersentumoren te behandelen als gevolg van hun intrinsieke tumor tropisme. Niet-invasieve intranasale stamcelafgifte omzeilt de bloedbreinbarrière en toont een sterk potentieel voor klinische vertaling. In dit artikel worden de basisprincipes van intranasale stamcellen in een muismodel van glioma samengevat.

Intranasale Levering van Therapeutische Stamcellen aan Glioblastoma in een Muis Model

Tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij kinderen, en locoregionale immuungebaseerde therapieën worden steeds vaker getest voor patiënten in klinische onderzoeken. Dit protocol beschrijft methoden voor locoregionale canule-implantatie bij muizen voor de preklinische evaluatie van immunotherapeutische infusies gericht op CZS-tumoren.

Intracraniële canule-implantatie voor seriële locoregionale chimere antigeenreceptor (CAR) T-celinfusies bij muizen

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Leer de gidschroefmethode voor intracraniële xenograftstudies bij muizen om glioomtherapieën te testen. Deze techniek biedt een veiliger en efficiënter alternatief voor stereotactische benaderingen.

A Simple Guide Schroef Methode voor Intracraniële xenograft Studies in Muizen

Meer video's verkennen