Name: Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Leer het verpakken van lentivirale expressieconstructen in pseudovirale deeltjes voor efficiënte transductie van zoogdiercellen. Dit protocol optimaliseert de productie van hoge titers functioneel actief virus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen het personeel en wetenschappers van SBI te erkennen voor hun steun in het ontwikkelen en testen van deze protocollen.

1. Transfectie van 293TN Cellen met Packaging Plasmids en de expressie-construct <ol><li> Zaad 7,0 tot 8,0 x 10 6 293TN cellen per 15 cm2 petrischaal in 20 ml kweekmedium met DMEM medium aangevuld met 4 mM L-glutamine, 4,5 g / l glucose en foetaal runderserum (10%) zonder antibiotica. Groei gedurende 18-24 uur bij 37 ° C met 5% CO2, zodat de celdichtheid 60-80% confluentie bereikt bij de transfectie. In sommige gevallen kan het nodig zijn zaad meerdere platen cellen om een ​​voldoende hoge titer voor transductie van doelcellen verkrijgen. </li><li> Voor elke plaat van cellen, voeg 1,6 ml serum-vrij DMEM tot een autoclaaf 2 ml Eppendorff buis. Voeg 45 ul pPACKH1 of pPACKF1 en 4,5 ug van uw lentivector te maken die aan de DMEM en meng door en neer te pipetteren. </li><li> Voeg 55 ul van PureFection in dezelfde buis. Vortex gedurende 10 seconden. Incubeer de DMEM-plasmide-PureFection mengsel bij kamertemperatuur fof 15 minuten. </li><li> Voeg de DMEM-plasmide-PureFection mengsel aan de weefselkweek plaat druppelsgewijs en schud zachtjes gelijkmatig te verspreiden in de hele plaat. Breng de schotel naar de incubator en groeien bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Het is niet nodig om de media veranderen na transfectie. Als uw lentivector constructie drukt een gen dat codeert voor een fluorescerend eiwit als GFP, controleert u de cellen onder een microscoop 12-24 uur na transfectie. Je moet in staat zijn om&gt; 90% GFP-positieve cellen te zien, wat aangeeft dat de transfectie is geslaagd. </li><li> Verzamelt de celkweeksupernatant na 48 en 72 uur in een 50 ml steriel centrifugebuis. Deze celcultuur supernatant bevat nu besmettelijke pseudoviral deeltjes. (Volg de aanbevolen richtlijnen voor het werken met BSL-2 veiligheidsklasse.) Centrifugeer bij 1.500 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur pellet de cellulaire puin. Breng de virale supernatant naar een nieuwe buis, verzekert dat de pellet verstoren. </li><li> 293TN cellen die zijn gebruikt voor virale verpakking moet van een biologisch container en niet worden gebruikt voor volgende ronden van virale verpakking. </li></ol> 2. Concentratie van de Viral Supernatant <ol><li> Voeg 1 volume koude (4 ° C) PEG-it Virus Precipitatieoplossing elke 4 delen lentivirus deeltjes bevattende supernatant. Precipitatie van lentivirus deeltjes van grote hoeveelheden kunnen worden bereikt met Corning 250 ml polypropyleen centrifugebuis. Meng de oplossing door het omkeren van de buizen een paar keer, maar niet vortex het mengsel. </li><li> Koel de oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 12 uur (tot 4 dagen zijn). Niet schudden of draaien de buizen tijdens de koeling stap. </li><li> Centrifugeer de supernatant / PEG-het mengsel bij 1500 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Na centrifugeren de lentivirale deeltjes als een beige of wit pellet aan de bodem van de buis. Giet de supernatant. </li><li> Verwijder alle sporen van vocht door aspiratie, zorg ervoor dat u de neergeslagen lentivirale deeltjes in de pellet te verstoren. Spoor van residuele PEG-zal het virus verdunnen (waardoor de titer) maar niet de integriteit van de doelwitcellen, omdat PEG-het inert en niet giftig beïnvloeden. </li><li> Resuspenderen en combineren lentivirale deeltjes in 1/100 van de oorspronkelijke volume koude (4 ° C), steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing of DMEM dat 25 mM HEPES buffer. </li><li> Aliquot in steriele cryogene flesjes en bewaar bij -70 ° C tot aan gebruik. </li></ol> 3. Virale Titering en transductie van target cellen <ol><li> Wij raden titering de lentivirale deeltjes voordat transduceren de doelcellen-of-interest en de berekening van de juiste multipliciteit van infectie (MOI) voor de doelcellen voor de samenhang tussen experimenten. Voor virale titering, raden wij u aan HT1080 cellen als een eenvoudig te infecteren positieve controle lijn. Plgemak er rekening mee dat de titering protocol omvat transduceren HT1080 cellen met een kleine hoeveelheid van de lentivirale deeltjes je hebt verpakt. Zodra de titer bekend is, kan de doelcellen of interest worden getransduceerd met de geproduceerde lentivirale deeltjes. Een adviseren titering protocol is te vinden op: <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Plaat 50.000 doelcellen-of-interest per putje in een 24-wells plaat in celcultuur media. Gebruik de media dat de cellen normaal worden gekweekt binnen Grow de cellen 's nachts op hun specifieke kweekomstandigheden. Cellen moet 50 tot 70% confluent op de dag van transductie. </li><li> Op de dag van transductie, zuigen de media uit de cellen. Combineer kweekmedium met TransDux een 1 x eindconcentratie (bijvoorbeeld 2,5 pi TransDux 500 ul kweekmedium). Breng het TransDux-cell kweekmedium mengsel aan elke well. </li><li> Pipetteer de juiste hoeveelheid virus die overeenkomt met de optimale MOI de doelcellen in elk putje. Indien de optimale MOI onbekend, raden proberen een aantal verschillende MOIS (zoals een MOI 1, 2 en 5 gemakkelijk te infecteren weefselkweekcellen en een MOI 1, 10 en 20 voor moeilijk -infecteren primaire cellen). Indien de concentratie van de deeltjes lentivirale niet bekend is (als bepaald door een virus titering protocol) kunnen verschillende hoeveelheden virus worden beproefd, zoals 1, 2 en 5 ul virus. Virus kunnen blijven in contact met de doelcellen tot 72 uur. </li><li> Verdere experimenten met de getransduceerde doelwitcellen of interest kan 72 uur begonnen na transductie, wanneer de virale construct is geïntegreerd in het gastheercelgenoom. Wijzig de medium en passage de doelcellen-of-interest op basis van hun specifieke behoeften. </li></ol> 4. Representatieve resultaten <pclass transfectie van cellen> Het uitgangspunt dichtheid van de 293TN cellen is cruciaal voor een succesvolle virale verpakking. 293TN cellen moeten 60 80% confluente de dag van transfectie (Figuur 2). Als de 293TN cellen minder dan 60% samenvloeiing, laat ze nog een paar uur te groeien voordat u de transfectie. Als de cellen 293TN&gt; 80% confluent, moeten zij worden uitgeplaat voor transfectie. Bij gebruik van een lentivector expressie GFP, ten minste 90% van de cellen 293TN fluoresceren groen 24 uur na de transfectie, aan te geven dat transfectie (Figuur 3). Indien minder dan 90% van de cellen GFP-positieve, niet naar de volgende stap omdat dit dat de transfectie niet succesvol was, en de virale titers laag zijn. In plaats daarvan plaat nieuwe 293TN cellen en opnieuw te beginnen, zorg ervoor dat de 293TN cellen op de juiste celdichtheid voor transfecteren. 293TN cellen kunnen trekken uit de weefselkweek platen 48-72 uur na transfectie. Dit heeft geen negatieve invloed hebben op de productie van lentivirale deeltjes. Titering met HT1080 Cellen Virale titers kan worden berekend met behulp van Global ultrasnelle SBI's Titering kit volgens de instructies van de fabrikant. Het systeem maakt gebruik van virale qPCR integratie van de sequentie WPRE meten van de lentivirale in HT1080 cellen en vergelijkt dit met een standaard curve, gebaseerd op een genomische referentiesequentie nauwkeurig meten infectieuze eenheden per ml (Fig. 4). Transductie van doelwitcellen Bij gebruik van lentivirale deeltjes het uitdrukken van een constitutief actieve GFP merker, moet GFP positieve cellen beginnen te verschijnen binnen 12-24 uur na transductie, als de transductie reactie werkt. GFP-expressie moet worden voortgezet na de lentivirale constructie stabiel te integreren met thij gastheercelgenoom. Als transduceren met verschillende MOIS, moet de GFP-fluorescentie ongeveer overeen met de MOI, waar lage MOIS tonen minder GFP-fluorescentie en hoger MOIS blijkt een toegenomen GFP-fluorescentie (figuur 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Overzicht van de virale productie protocol. De lentivector en PPACK verpakking plasmiden worden gemengd en geco-transfecteerd in cellen 293TN. Na 48 -72 uur wordt het virale supernatant verzameld en virale deeltjes worden neergeslagen met PEG-it. Na titering de lentivirale deeltjes, kunnen ze worden gebruikt om de doelcellen-of-interest transduceren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Fase contrast beeld van 293TN cellen. Cell density moet 60-80% confluent de dag van de transfectie. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Fluorescent beeld van GFP-positieve 293TN cellen 24 uur na transfectie met Purefection, pPACKH1 en een lentivector construct codeert GFP. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. WPRE qPCR resultaten en de standaard curve verkregen met behulp van Global ultrasnelle SBI's Titering kit om MOI en bijbehorende titer van verpakte virale deeltjes te berekenen. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Fluorescent beelden HT1080 cellen getransduceerd met toenemende hoeveelheden lentivirus. Foto's zijn vanaf 72 uur na transductie. </pclass>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNA+Viruses.+A+Practical+Approach%22">RNA Viruses. A Practical Approach</a>. Cann, A. J. , Oxford Univ. Press. (2000).</li>
<li>Gould, D. J., Favorov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vectors for the treatment of autoimmune diseases.</a> Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).</li>
<li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfer%2C+integration%2C+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li>
<li>Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Federico, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFederico%2C+M+%22Lentivirus+Gene+Engineering+Protocols%22">Lentivirus Gene Engineering Protocols</a>. , Humana Press. New Jersey. (2003).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
<li> Manual Titer Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> (2011).</li>
<li>Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L. Jr, Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).</li>
<li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Mol. Cell Biochem. , (2011).</li>
<li>NIH Office of Biotechnology Activities. Guidance on Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf</a> (2011).</li>
</ol>

Productie en vrije toegang tot deze video artikel wordt gesponsord door System Biosciences.

Deze virale verpakking en transductie van target cellen protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met virale verpakking SBI&#39;s reagentia. Vervanging van andere reagentia kunnen invloed hebben op de uitkomst van het protocol. Dit protocol is alleen geoptimaliseerd voor lentivirale productie en mogelijk niet geschikt voor de productie van andere soorten virussen of pseudovirussen. Succesvolle virale verpakking is afhankelijk van een aantal belangrijke stappen. De 293TN cellen drukken de SV40 grote T antigen, wat absoluut noodzakelijk is voor afscheiding van het lentivirale deeltjes in de cel cultuur supernatant. De dichtheid van de cellen 293TN bij de transfectie is vooral van belang om de PureFection reagens voldoende overdragen lentivector en verpakking plasmiden in de cellen. Het toevoegen van de PureFection mengsel aan de weefselkweek plaat in een druppelsgewijze manier gevolgd door grondig te zwenken de plaat is belangrijk voor de verspreiding van de verpakking plasmidenen lentivector bouwen in alle van de cellen. Niet juiste verdeling van de vectoren kunnen leiden tot onvoldoende lentivirus deeltjes geproduceerd. De virale verpakking reactie kan worden opgeschaald voor de productie van hoge titer virus op het oppervlak van het weefsel kweekplaten. Er kan gekozen worden tot op het bord verschillende weefsel-cultuur schotels van 293TN cellen per construct dat moet worden verpakt. Concentratie van de virale supernatanten is vooral handig bij het maken van hoge titer virus. Virale supernatant uit meerdere platen cellen kunnen worden gecombineerd en geconcentreerd voor gebruik in in vivo experimenten of cellen die moeilijk te transduceren. Titering de geproduceerde lentivirale deeltjes is belangrijk voor de berekening een nauwkeurige MOI gebruiken voor transductie van doelcellen. Het kennen van de MOI die werd gebruikt in een bepaalde transductie in staat stelt het oplossen van problemen in het geval dat de transductie niet succesvol is. Bijvoorbeeld met een moi diete laag kan in enkele beoogde cellen die de sequenties van belang. Met een moi die te hoog is, kan echter resulteren in doelcellen tekenen van spanning vertonen. Het doel is het gebruik van een MOI dat de expressie van het construct-of-interest maximaliseert met behoud van de gezondheid van de cellen. Hoewel wij bevelen qPCR gebaseerde titering protocol geïntegreerde kopieën van het construct in lentivirale HT1080 cellen meet, kunnen andere titering methoden worden gebruikt, zoals p24 ELISA of schatting van het percentage GFP-positieve cellen. Succesvolle transductie van target cellen is ook afhankelijk van een aantal belangrijke factoren. TransDux is een uniek infectie reagens dat hoge transductie efficiëntie mogelijk maakt, maar dat is niet toxisch voor cellen. TransDux kan worden gebruikt in plaats van polybreen, die vaak giftig is voor de doelcellen. Opneming van TransDux in de transductie van de doelwitcellen helpt kosten neutraliseren van het virale deeltjes en kan het virus in de cels. Aangezien TransDux niet toxisch voor de cellen, kan men laat de lentivirale deeltjes in contact met de cellen blijven tot 72 uur (de tijd waarop de virale constructen zijn geïntegreerd in het gastheercelgenoom), waardoor de waarschijnlijkheid van de virale deeltjes in de cel. Voor sommige moeilijk te transduceren cellen, kan transductions worden herhaald op opeenvolgende dagen op de transductie efficiëntie te verhogen. Bijvoorbeeld, transduceren de cellen op dag 1, laat de cellen te rusten op dag 2, en dan weer transduceren de cellen op dag 3. Het is belangrijk 72 uur wachten na de laatste transductie voor het begin selectie verdere experimenten of karakterisering van de doelcellen. Efficiënte virale verpakking is afhankelijk van de grootte van de lentivirale construct, tussen de 5 &#39;en 3&#39;LTR gebieden. Dit deel van de lentivirale construct moet ongeveer 9 kb of minder, hetgeen overeenkomt met de grootte van de oorspronkelijke HIV genoom. Meer dan 9 kb kan deplooi de titer van het geproduceerde pseudoviral deeltjes. Nieuwe technologie, zoals piggyBac transposon vectoren mogelijk betrouwbare, stabiele integratie van transgenen tot 100 kb via een transfectie. Deze benadering kan worden gebruikt voor constructen die de grootte voor lentivirale vectoren, wanneer het mogelijk is om transfecteren doelcellen overschrijden en biedt het bijkomende voordeel dat er geen een virale verpakkingsstap 9,10. De geproduceerde pseudoviral deeltjes met dit protocol infectueus in dat ze het meest zoogdiercel types infecteren. De producten die gebruikt worden in dit protocol, echter zijn de derde generatie BioSafe in dat ze produceren niet-replicatieve en zelf-inactiverende pseudovirussen. Daarom, zodra getransduceerde in doel-cellen of dieren, de doelcellen of dieren zijn niet besmettelijk of besmettelijk. Vervanging van andere lentivector plasmiden die niet van de derde generatie BioSafe is mogelijk, maar niet aan te raden van een bioveiligheidperspectief. De virale productie-protocol en de daarop volgende transductie van target cellen moeten worden uitgevoerd onder Biosafety Level 2, volgens de NIH richtlijnen 11 en onderzoekers moeten altijd een laboratoriumjas en handschoenen bij het ​​hanteren van de virale deeltjes. Gebruikt 293TN producerende cellen moeten tubes van virale deeltjes, en wegwerp pipetten worden weggegooid in een geschikte biohazard container. Herbruikbare pipetten en glaswerk moet worden ontsmet met bleekwater en autoclaveren om de blootstelling van het personeel te verminderen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM Hoge Glucose Medium </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 293TN Cellen </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> Voor HIV-gebaseerde lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> Voor FIV-based lentivectors </td></tr><tr><td> Elke Lentivirale vector </td><td> SBI </td><td> Diverse </td><td> cDNA, shRNA, microRNA, transcriptie verslaggevers </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-it </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Global ultrasnelle Titering kit </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> Niet beschreven in dit protocol, maar nodig is om de virale deeltjes titer </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

verpakking hiv-of fiv-based lentivector expressie constructen en transductie van vsv-g pseudogetypeerde virale deeltjes

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Zoals met standaard plasmide vectoren is het mogelijk om lentivectors in plasmide vorm transfecteren in cellen met lage tot middelmatig tot transiënte expressie effectors verkrijgen. Verpakking lentivirus expressieconstructen in pseudoviral deeltjes maakt het echter mogelijk tot 100% transductie, zelfs bij moeilijk te transfecteren cellen, zoals primaire, stengel en gedifferentieerde cellen. Bovendien is de lentivirale levering niet het specifieke cellulaire respons doorgaans geassocieerd met chemische transfecties, zoals mobiele overlijden ten gevolge van de toxiciteit van de transfectie reagens 1, 2. Bij getransduceerd in doelcellen, lentivirale construct integreert genomisch DNA en zorgt voor een stabiele expressie van de kleine haarspeld RNA (shRNA), cDNA, microRNA reportergen of 3, 4. Doelcellen stabiel tot expressie de effector-molecule kan worden geïsoleerd met een selecteerbare marker in de expressie vector, zoals het bouwen puromycine of GFP. Na pseudoviral deeltjes infecteren doelcellen kunnen zij niet repliceren in doelwitcellen door de virale structurele genen ontbreken en de lange terminale herhaling (LTR) zijn bedoeld om zelf-inactiverende na transductie 5, 6. Er zijn drie componenten nodig voor efficiënte lentivirale verpakking 1, 5, 6, 7. <ol><li> De lentivirale expressievector dat sommige genetische elementen voor verpakking, stabiele integratie van de virale expressie-construct in genomisch DNA en expressie van de effector of reporter. </li><li> De lentivirus verpakking plasmiden eiwitten noodzakelijk voor transcriptie en verpakken van een RNA kopie van de expressie-construct in recombinant pseudoviral deeltjes. Dit protocol maakt gebruik van de PPACK plasmiden (SBI) die coderen voor gag, pol, en toerenteller van de HIV of FIV genoom en vesiculaire stomatitis virus g eiwit (VSV-G) voor de virale manteleiwit. </li><li> 293TN produceren<html> r cellen (verkregen van HEK293 cellen) die de SV40 grote T antigen, die nodig is voor hoge-titer lentivirus productie en neomycine resistentie gen, nuttig voor de cellen opnieuw te selecteren voor onderhoud drukken. </li></ol> Een overzicht van de virale productie protocol kan worden gezien in figuur 1. Virale productie begint door co-transfectie 293TN producerende cellen met lentivirale expressievector en de verpakking plasmiden. Virusdeeltjes worden uitgescheiden in de media. Na 48-72 uur de cel cultuur media wordt geoogst. Celresten wordt uit de celkweekmedia, en de virale partikels worden neergeslagen door centrifugeren met PEG-it concentratie. Geproduceerd lentivirus worden vervolgens getitreerd en kan worden gebruikt om doelcellen transduceren. Details van virale titering zijn niet opgenomen in dit protocol, maar is te vinden op: Ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Dit protocol is geoptimaliseerd met de specifieke producten zijn aangegeven. Andere reagentia kunnen worden vervangen, maar dezelfde resultaten kunnen worden gegarandeerd.

Lentivirale expressievectoren zijn het meest effectief voertuigen stabiel tot expressie verschillende effector-moleculen of reporter-constructen in delende en niet-delende zoogdiercellen en hele organismen. Hier bieden we een protocol over hoe lentivector expressie constructen te verpakken in pseudoviral deeltjes en target cellen met behulp van de pseudoviral deeltjes transduceren.

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

Net als bij standaardplasmidvectoren is het mogelijk om lentivectoren in plasmidevorm met een lage tot gemiddelde efficiëntie in cellen te transfecteren om transiënte ...

Het algemene doel van deze procedure is om te leren over lentivirale packaging. Een protocol van vijf dagen. Op de eerste dag worden 2 9 3, TN producer-cellen uitgeplaat door middel van een berekende dichtheid.Op de tweede dag worden de cellen getransfecteerd met het gekozen lenti-vectorconstruct dat het gen van belang bevat en een mix van virale verpakkingsplasmiden. Op dag vier wordt het virale supernatant geoogst en geconcentreerd door toevoeging van een PEG-virusprecipitatie-oplossing. De laatste stappen van de procedure zijn het oogsten van het PEG-geconcentreerde virus, het verdelen van het virus in aliquots en het infecteren van cellen met het geconcentreerde virus voor virale titratie.Uiteindelijk wordt kwantitatieve PCR van stabiel geïntegreerde genen gebruikt om het aantal stabiel geïntegreerde constructen te berekenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals plasmatransfectie of retrovirale transductie, is dat het geoptimaliseerde lentivirus-verpakkingsprotocol van FBI een functioneel actief virus met een hoge titer produceert, wat een efficiënte aflevering in bijna elke zoogdiercel mogelijk maakt, inclusief moeilijk te transfecteren cellen zoals stamcellen en niet-delende primaire cellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat zij niet bekend zijn met de kleine protocolgegevens, die essentieel zijn voor de succesvolle productie van virus met een hoge titer.Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, aangezien de celdichtheid die via een microscoop tijdens transfectie wordt gevisualiseerd, de efficiëntie van de virale verpakking bepaalt, wat op zijn beurt de uiteindelijke virale titer bepaalt. In gevallen waarin dit van toepassing is, bepaalt de expressie van een fluorescente reporter de transfectie-efficiëntie, wat een significante invloed heeft op de uiteindelijke virale titer. Daarnaast is een visuele demonstratie van deze methode behulpzaam voor onderzoekers om vertrouwd te raken met subtiele maar belangrijke onderdelen van het protocol, zoals best practices om de steriliteit gedurende het gehele proces te bewaren en hoe men kan voorkomen dat er celdebris in het geoogste virus terechtkomt.Efficiënte lentivirale verpakking berust op drie componenten. Ten eerste moet de lentivirale expressievector enkele van de elementen bevatten die nodig zijn voor virusverpakking en stabiele integratie, evenals elementen voor expressie van het gen van belang, zoals een short hairpin RNA, microRNA of een reportercassette.Ten tweede moeten de lentivirale verpakkingsplasmiden de eiwitten leveren die essentieel zijn voor het verpakken van een RNA-kopie van het expressieconstruct in recombinante pseudovirale deeltjes en de daaropvolgende reverse transcriptie en virusintegratie na infectie. Ten derde moeten 2 9 3 TN-producentencellen transient worden gecotransfecteerd met de expressie- en verpakkingsvectoren. Deze cellen produceren pseudovirale deeltjes met hoge titers die uit het cultuurmedium kunnen worden geoogst.Uiteindelijk hangt een succesvolle transductie van de doelcellen grotendeels af van het aantal virale deeltjes per cel voor een bepaald celtype. Met andere woorden, de multipliciteit van infectie; begin met het kweken van 2 9 3 TN-cellen in 15 centimeter cellenkweekplaten gedurende 18 tot 24 uur om een confluentie van 60 tot 80% te bereiken.Op het moment van transfectie zal elke plaat ongeveer 14 miljoen cellen opleveren om de virusopbrengst te verhogen. Er kan gebruik worden gemaakt van meer dan één plaat; wanneer de 2 9 3 TN-cellen 60 tot 80% confluent zijn, zijn ze klaar voor transfectie. Voeg voor elke plaat cellen 1,6 milliliters serumvrij DMEM toe aan een 15 milliliter falcon-buis.Voeg vervolgens 22,5 micrograms ppac H one of Ppac F1 en 4,5 micrograms van uw lenti vector Construct toe aan het DMEM en meng door herhaaldelijk te pipetteren. Voeg daarna 55 microliters pure affection toe aan dezelfde buis en vortex deze 10 seconden, gevolgd door een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 15 minuten één buis toe aan elke kweekplaat.Voeg de vloeistof druppelsgewijs toe en wals de plaat vervolgens voorzichtig, incubeer daarna de cellen gedurende 48 uur bij 37 °C met 5% CO2. Indien het lenti-vectorconstruct een fluorescent gen zoals GFP tot expressie brengt, controleer de cellen dan onder een microscoop; een succesvolle transfectie zal 50 tot meer dan 90% groene fluorescerende cellen opleveren. Verzamel nu het supernatant van de celcultuur in een conisch buisje van 50 mL. Het supernatant bevat de infectieuze pseudovirale deeltjes.Eventuele cellen die van de plaat worden losgetrokken, hebben geen negatieve invloed op de productie van het virus. Om debris te verwijderen, wordt het virale supernatant gecentrifugeerd bij 1500 G gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Collecteer vervolgens het virale supernatant zonder de pellet te verstoren, waarbij u ervoor zorgt dat er een buffer van ongeveer 500 microliters supernatant overblijft, en ga verder naar de volgende stap, namelijk het concentreren van de virusdeeltjes 72 uur na transfectie.Een optionele tweede collectie van het virale supernatant kan met dezelfde techniek worden uitgevoerd nadat de virale staat is verzameld. Concentreer dit door één volume ijskoude peg-virusprecipitatie-oplossing toe te voegen aan elke vier volumes supernatant in een centrifugebuis van 50 milliliter van polypropyleen. Keer de oplossing om om deze te mengen.Gebruik nooit een vortexmixer en bewaar de oplossing vervolgens zonder agitatie bij vier graden Celsius gedurende maximaal 96 uur. Centrifugeer het mengsel na een minimale koeltijd van 12 uur gedurende 30 minuten bij 1500 G en vier graden Celsius. Na de centrifugatie zullen de geprecipiteerde lentivirale peptiden zichtbaar zijn als een beige of witte pellet onderin de buis.Verwijder nu alle resten vloeistof door voorzichtig te aspireren, zonder de neergeslagen lentivirale particles in het pellet te verstoren. Alternatief kan het grootste deel van het supernatant worden verwijderd, waarna het pellet wordt geresuspendeerd in het resterende supernatant. Draag de suspensie vervolgens over naar een steriele eppendorfbuis van twee milliliter en centrifugeer de buis gedurende twee minuten in een koude microcentrifuge.Pipette bij 14.000 RPM het resterende supernatant weg en resuspendeer het pellet van lentivirale partikels in ijskoude, steriele buffer op één tiende tot één honderdste van het oorspronkelijke volume. Pipetteer het pellet voorzichtig in de oplossing zonder bellen te vormen en houd het gedurende het hele proces koud. Zorg ervoor dat het pellet volledig is geresuspendeerd.Maak tot slot aliquots van 15 tot 25 µL in steriele cryogene buisjes op ijs en bewaar de buisjes bij -70 °C. Een succesvolle verpakkingsronde levert 10 miljoen tot 1000 miljoen IFU per milliliter op voor virustransductie in een 24-wells kweekplaat, met 50.000 cellen per well, en kweek deze gedurende de nacht onder hun gespecificeerde kweekcondities. De cellen moeten een confluentie van 50 tot 70% hebben voor transductie voor titteringsdoeleinden.HT 10 80-cellen kunnen worden gebruikt als een gemakkelijk te transduceren controlecellijn. Aspireer de volgende dag het medium van de cellen. Combineer vervolgens het cultuurmedium met de geconcentreerde duck-oplossing, zodat de uiteindelijke concentratie van trans-ducks 1x is. Voeg 0,5 mL van de transduceerde oplossing toe aan elke put met doelcellen bij de juiste dichtheid van 50 tot 70% confluentie. Voeg virus toe aan elke put in de volgende verdunningen: 1:100, 1:10 en een onverdunde 1:1 verdunning.Het virus kan tot 72 uur in contact blijven met de doelcellen zonder het medium te vervangen. Na 72 uur zal het provirus stabiel in het genoom van de gastheer zijn geïntegreerd en het gen van belang tot expressie brengen. Indien de expressie van een aanwezige fluorescente marker kan worden gebruikt om de transductie-efficiëntie bij verschillende virusverdunningen te schatten, kan het aantal infectieuze eenheden worden gekwantificeerd via QPCR.Zodra de virustiter bekend is, berekent u het juiste volume virus om de gewenste multiplicity of infection voor andere doelcellen te bereiken. Het meten van de titer en het beheersen van de MOI garandeert consistentie tussen experimenten en verschillende viruspreparaten. Het virus is nu klaar voor gebruik in verdere experimenten.De startdichtheid van de 2 9 3 TN-cellen was cruciaal voor een succesvolle virale verpakking op de dag van transfectie. Deze 2 9 3 TN-cellen waren tussen de 60 en 80% confluent. 24 uur na een succesvolle transfectie met een lenti-vector die GFP tot expressie bracht, bleek dat ten minste 90% van de 2 9 3 TN-cellen groene fluorescentie vertoonde.72 uur na transductie bleef GFP tot expressie komen in de HT 10 80 gastcellen. Dit geeft aan dat het lentivirale construct stabiel in het genoom van de gastheer is geïntegreerd; transductie van dezelfde gastcellen bij een tienvoudige verdunning leidde tot een proportionele afname van de GFP-expressie. Dit komt doordat de relatie tussen de virale titer en de lentiviraal gemedieerde genexpressie direct proportioneel is.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vijf dagen worden uitgevoerd, met ongeveer één tot twee uur per dag indien correct uitgevoerd. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u functioneel infectieuze virale partikels efficiënt en veilig kunt verpakken en hoe u cellen succesvol met het virus kunt transduceren. Vergeet niet dat werken met lentivirus gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen nodig zijn, zoals het werken in een BSL 2 weefselkweekkap.Draag altijd een laboratoriumjas en handschoenen bij het uitvoeren van deze procedure.

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Te maken lentivirussen, zijn DNA-vectoren getransfecteerd in humane 293 cellen. Na de oogst en het concentreren van de supernatant, is virustiter bepaald door fluorescentie expressie met een flowcytometer.

Lentivirus Productie

We hebben een lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, de Rev-respons element (RRE) die reporter genexpressie kan reguleren in een HIV-1-Tat en Rev-afhankelijke manier. De vector maakt de specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cellen via de expressie van GFP.

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Lentivirussen zijn een waardevol onderzoeksinstrument voor het verkennen van genfunctie, maar onderzoekers kunnen wensen om de productie van pantropic bekende lentivirus codering of vermoede oncogenen te vermijden. Als alternatief, presenteren we een veiliger protocol voor het gebruik van ecotropic lentivirus op menselijke cellen aangepast aan de ecotropic receptor mSlc7a1 uit te drukken.

Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

In dit protocol beschrijven we de productie, zuivering en titratie van lentivirale vectoren. Wij bieden een voorbeeld van lentivirale vector-gemedieerde gen-levering in de eerste gekweekte neuronen en astrocyten. Onze methoden kunnen ook van toepassing op andere...

De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.

Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.

Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Leer het verpakken van lentivirale expressieconstructen in pseudovirale deeltjes voor efficiënte transductie van zoogdiercellen. Dit protocol optimaliseert de productie van hoge titers functioneel actief virus.

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

Meer video's verkennen