Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om meer te leren over lentiviraal packaging. Een vijfdaags protocol. Op de eerste dag worden 2 9 3 TN produceercellen op een berekende dichtheid geplaatst.

Op de tweede dag worden cellen getransfecteerd met de gekozen lenti-vectorconstruct die het gen van belang bevat en een mengsel van viraal packaging-plasmiden. Op dag vier wordt het virale sate geoogst en geconcentreerd door toevoeging van PEG-virus precipitatie-oplossing. De laatste stappen van de procedure zijn het oogsten van het geconcentreerde PEG-virus, het verdelen van het virus in aliquoten en het infecteren van cellen met het geconcentreerde virus voor virale titering.

Uiteindelijk wordt kwantitatieve PCR van stabiel geïntegreerde genen gebruikt om het aantal stabiel geïntegreerde constructen te berekenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals plasmatransfectie of retrovirale transductie, is dat FBI's geoptimaliseerde lentivirus packaging protocol een hoog titer functioneel actief virus produceert, wat een efficiënte levering mogelijk maakt in bijna elke zoogdiercel, inclusief moeilijk te transfecteren cellen zoals stamcellen en niet-delende primaire cellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat ze niet bekend zijn met de kleine protocoldetails, die essentieel zijn voor het succesvol produceren van hoog titer virus.

Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat de celdichtheid die door een microscoop wordt gevisualiseerd tijdens transfectie, de efficiëntie van viraal packaging bepaalt, wat de uiteindelijke virale titer bepaalt. In gevallen waar toepasbare fluorescerende reporter expressie de efficiëntie van transfectie bepaalt, heeft dit een significante impact op de uiteindelijke virale titer. Bovendien is visuele demonstratie van deze methode nuttig voor onderzoekers om zich vertrouwd te maken met subtiele maar belangrijke onderdelen van het protocol, zoals beste praktijken om steriliteit te handhaven tijdens het hele proces, en hoe te voorkomen dat cellulaire brokstukken in het geoogste virus worden opgenomen.

Efficiënt lentiviraal packaging vertrouwt op drie componenten. Ten eerste moet de lentivirale expressievector enkele elementen bevatten die nodig zijn voor viruspackaging en stabiele integratie, evenals elementen voor expressie van het gen van belang. Korte hairpin, RNA, micro RNA of een reporter cassette.

Ten tweede moeten de lentivirale packaging-plasmiden de essentiële eiwitten leveren voor het verpakken van een RNA-kopie van het expressieconstruct in recombinante pseudo virale deeltjes en daaropvolgende reverse transcriptie en virusintegratie bij infectie. Ten derde moeten 2 9 3 TN produceercellen tijdelijk worden getransfecteerd met de expressie- en packaging-vectoren. Deze cellen produceren hoge titers van pseudo virale deeltjes die uit het kweekmedium kunnen worden geoogst.

Uiteindelijk hangt succesvolle transductie van de doelcellen vooral af van het aantal virale deeltjes per cel voor een bepaald celtype. Met andere woorden, de multipliciteit van infectie begint met het laten groeien van 2 9 3 TN cellen. In 15 centimeter celkweekplaten gedurende 18 tot 24 uur om 60 tot 80% confluency te verkrijgen.

Op het moment van transfectie zal elke plaat ongeveer 14 miljoen cellen opleveren om de virusopbrengst te verhogen. Meer dan één plaat kan de volgende dag worden gebruikt wanneer de 2 9 3 TN cellen 60 tot 80%confluent zijn, zijn ze klaar voor transfectie. Voeg voor elke plaat cellen 1,6 milliliter serumvrij DMEM toe aan een 15 milliliter falconbuisje.

Voeg vervolgens 22,5 microgram van ppac H een of Ppac F1 en 4,5 microgram van uw lenti-vectorconstruct toe aan de DMEM en meng door op en neer te pipetteren. Voeg vervolgens 55 microliters pure affectie toe aan dezelfde buis en vortex gedurende 10 seconden, gevolgd door een 15 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur. Voeg na 15 minuten één buis toe aan elke kweekplaat.

Laat het druppelsgewijs en zachtjes ronddraaien in de plaat en incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide na 48 uur. Als het lenti-vectorconstruct een fluorescerend gen zoals GFP expresseert, bekijk de cellen onder een microscoop, een succesvolle transfectie zal 50 tot meer dan 90% groen fluorescerende cellen opleveren. Verzamel nu het cellenkweeksupernatant in een 50 milliliter conische buis. Het supernatant bevat de besmettelijke pseudo virale deeltjes.

Alle cellen die van de plaat zijn getrokken, hebben geen negatief effect op de virusproductie. Om brokstukken te verwijderen, centrifugeer het virale supernatant gedurende 15 minuten bij 1500 G op kamertemperatuur. Verzamel vervolgens het virale supernatant zonder de pellet te verstoren, zorg ervoor dat er een buffer van ongeveer 500 microliters supernatant overblijft en ga verder met de volgende stap, namelijk het concentreren van de virale deeltjes 72 uur na transfectie.

Een optionele tweede verzameling van het virale supernat kan worden gedaan met behulp van dezelfde techniek nadat het virale sate is verzameld. Geconcentreerd door toevoeging van één volume ijskoud peg-virus precipitatie-oplossing aan elke vier volumes supernatant in een 50 milliliter polypropyleen centrifugeerbuisje. Draai de oplossing om het te mengen.

Gebruik nooit een vortex, sla de oplossing vervolgens op zonder schudden bij vier graden Celsius gedurende maximaal 96 uur. Na een minimum van 12 uur koeling centrifugeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 1500 G en vier graden Celsius. Na de centrifugatie zullen de peggo geprecipiteerde lentivirale deeltjes als een beige of witte pellet op de bodem van de buis verschijnen.

Verwijder nu alle restvloeistoffen door zorgvuldig aspireren zonder de geprecipiteerde lentivirale deeltjes in de pellet te verstoren. Alternatief, verwijder het grootste deel van het supra natin en resuspendeer het pellet in de resterende supinate. Breng vervolgens de suspensie over in een steriele twee milliliter einorbuis en centrifugeer de buis gedurende twee minuten in een koude micro fuge.

Bij 14.000 RPM pipetteer de resterende supernatant weg en resuspendeer het lentivirale deeltjespellet in ijs,