Lensless fluorescentie microscopie op een chip

Het algemene doel van deze procedure is om een lensloze on-chip fluorescente microscopieplatform te demonstreren voor het beeldvormen van fluorescente objecten over een ultrabreed gezichtsveld. Om dit te bereiken, worden een dunne absorptiefilter en een glasvezelplaat voorzichtig op een opto-elektrische sensorarray of CCDC-mos geplaatst, en vervolgens wordt een microfluïdische chip op de plaat gepositioneerd. Vervolgens wordt een prisma samengesteld met de microchip door gebruik te maken van indexaanpassingsolie.

Fluorescente citatie wordt bereikt via de zijfacet van een ruitvormig prisma en de holografische verlichting gebeurt via de topfacet van hetzelfde prisma. Uiteindelijk kunnen hoge resolutie microscopische beelden worden verkregen uit de verkregen fluorescente beelden door de ruwe beelden te decoderen via digitale algoritmen. Indien nodig kunnen de gedecodeerde fluorescente objecten automatisch worden geteld met behulp van een op maat ontwikkelde interface.

On-chip lens. Beeldvorming in het algemeen heeft tot doel om omvangrijke lensgebaseerde optische microscopen te vervangen door eenvoudigere en compactere ontwerpen. Dit opkomende technologieplatform heeft het potentieel om de behoefte aan omvangrijke en dure optische componenten te elimineren met behulp van nieuwe theorieën en digitale reconstructiealgoritmen.

De lenslijst op de on-chip beeldvormingsplatform omvat verschillende optische componenten, waaronder een digitale sensorarray, een incoherente lichtbron, een prisma, een absorptiefilter en een glasvezelplaat of een glasvezelverloop. In dit platform kunnen verschillende soorten sensorarrays worden gebruikt voor de detectie van het fluorescente signaal van doelmicro-objecten. Voor de doeleinden van deze video wordt een ladingsgekoppeld apparaat gebruikt, een incoherante lichtbron, zoals een eenvoudige lichtemitterende diode, voor fluorescentie-excitatie.

Twee verschillende excitatiefiltermethoden worden parallel gebruikt om de vereiste donkerveldachtergrond te creëren, zoals weergegeven in dit diagram. Ten eerste wordt een glazen prisma of een glazen halfbol gebruikt om totale interne reflectie of TIR te creëren op het onderoppervlak van de microfluïdische chip die de monsters van belang host. Parallel hieraan wordt een goedkope absorptiefilter gebruikt om de week verspreide excitatielichten te verwijderen die niet aan het TIR-proces voldoen.

Na succesvolle afwijzing van de excitatie met behulp van deze twee mechanismen, wordt alleen de fluorescente emissie van de monsters verkregen op het detectorvlak. Ondanks een dergelijk groot detectie numeriek diafragma, worden de ruwe fluorescente vlekken op de sensorarray redelijk breed om de ruimtelijke verspreiding van dit fluorescente signaal te bewerken en beter te controleren. Een glasvezelplaat wordt tussen het object en de sensorvlakken geplaatst als alternatief voor een reguliere plaat.

Een taps toelopende glasvezelplaat, die een aanzienlijk hogere dichtheid van glasvezelkabels op zijn topfacet heeft in vergelijking met de onderkant, kan worden gebruikt voor hogere resolutie beeldvorming door vergroting. De microfluïdische chips die in dit platform worden gebruikt, worden gemaakt met behulp van poly dimethyl Sloane-wanden op glazen platen om de microkanalen te creëren die nodig zijn voor on-chip beeldvorming om de assemblage van de landloze on-chip beeldvormingsplatform te beginnen. Verwijder eerst het dekglas van de opto-elektronische sensorarray met behulp van een vacuümpen, plaats voorzichtig een dunne absorptiefilter op de bovenkant van het actieve gebied van de detector.

Plaats een glasvezelplaat boven deze absorptiefilter. Plaats vervolgens de gemaakte microfluïdische chip direct boven de glasvezelarray. Vervolgens wordt een glazen prisma boven de microfluïdische chip geassembleerd met behulp van indexaanpassingsolie zodat de brekingsindex van de interface wordt aangepast aan de brekingsindex van het glas.

Verbind de lichtbronnen met glasvezelkabels met behulp van FC-connectors. Een van de moeilijkste aspecten van deze procedure is de uitlijning van de componenten. Lijn de afstanden tussen de componenten, de positie en hoek van de verlichting zorgvuldig uit.

Verplaats ten slotte de zijverlichtingsvezel dichter bij het prisma en pas de hoek aan om ervoor te zorgen dat totale interne reflectie optreedt bij de glas-luchtinterface die overeenkomt met de microfluïdische chips. Ondersubstraat, verschillende cellen of kleine diermodellen kunnen worden afgebeeld met behulp van deze on-chip platform, maar witte bloedcellen worden afgebeeld voor de doeleinden van deze demonstratie. Om de witte bloedcellen met een fluorescente kleurstof te labelen, meng eerst ongeveer 100 microliters van volbloed met ongeveer één milliliter van rood bloedcelopwekkingsbuffer, incubeer gedurende ongeveer drie minuten op kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens de leugenbloedoplossing.

Na het verwijderen van de bovenste laag met behulp van een micropipet, resuspendeer de pelletlaag in fosfaat gebufferde zoutoplossing om de nucleïnezuur van de cellen met fluorescente kleurstof te labelen, voeg SYTO 16 toe aan de resuspendering en incubeer vervolgens het monster gedurende ongeveer 30 minuten in het donker op kamertemperatuur. Na 30 minuten centrifugeert u het gelabelde monster. Verwijder de supinate om de achtergrondruis te verminderen als gevolg van fluorescente emissie van vrije kleurstoffen.

Reese heeft de witte bloedcelpelletlaag in ongeveer vijf milliliters PBS gebogen. Het monster is nu klaar om te worden geladen in de microfluïdische chip voor lensvrije on-chip fluorescente beeldvorming. Voorafgaand aan de beeldvorming van de witte bloedcellen, moet het beeldvormingsplatform worden gekalibreerd met behulp van fluorescente microbeadjes.

Bereid een verdunde microbeadjes-monster met behulp van gedeïoniseerd water en ruwe beadjes-oplossing. Injecteer dit initiële monster in de microfluïdische chip vanaf de zijkant van de PDMS-wanden met behulp van een scherpe naaldsyringe.

Na het assembleren van de componenten om on-chip fluorescente beeldvorming te bereiken, verwerft u ruwe beelden van fluorescente beadjes met behulp van de op maat ontwikkelde labview-interface via een computer. Zorg ervoor dat er minstens 20 geïsoleerde fluorescente beadjes-beelden over het hele gezichtsveld zijn. Sla de kalibratiegegevens op, die later zullen worden gebruikt om de puntspreidingsfunctie van het lensloze fluorescente microscopieplatform te kalibreren en te extraheren.

Verwijder de microfluïdische chip met het fluorescente beadjes-monster en los het prisma los van deze chip. Injecteer he