Name: Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer dynamische veranderingen in het actine cytoskelet observeren in levende endotheelcellen met GFP-actine beeldvorming. Deze methode maakt real-time analyse van cytoskelet dynamiek mogelijk voor onderzoek naar endotheliale permeabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De GFP-β-actine plasmide werd rijkelijk verzorgd door dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Afdeling Pathologie, en werd versterkt in het laboratorium van Dr Becky Worthylake, LSUHSC-NO afdeling Farmacologie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (P20 RR-018766) en de American Heart Association (05835386N).

<ol><li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li>
<li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li>
<li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li>
<li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuran%2C+WN+%22Handbook+of+Physiology%3A+Microcirculation%22">Handbook of Physiology: Microcirculation</a>. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. , 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).</li>
<li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li>
<li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+ruffles+in+cell+migration%3A+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li>
<li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li>
<li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li>
<li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li>
<li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li>
<li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability%3A+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li>
<li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li>
<li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittman%2C+T+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).</li>
<li>Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRabut%2C+G+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De beeldvorming van GFP-actine in levende endotheelcellen in staat stelt een gedetailleerde analyse van de dynamica van het actine cytoskelet in reactie op inflammatoire stimuli. Deze methode kan ook nuttig zijn om voort te bouwen op eerdere bevindingen met herinrichting van het cytoskelet in reactie op de fysieke krachten als shear stress 11. Daarnaast is deze methode laat een gedetailleerde beoordeling van de bijdrage van actine cytoskelet dynamiek verschillende endotheelcellen activiteiten, waaronder migratie, mitose, de vorming van intercellulaire kruispunten en junctional rijping, en het onderhoud van de barrièrefunctie. In de getoonde gegevens kunnen het gedrag van de endotheel-actine cytoskelet in acht worden genomen voor en na behandeling met trombine. Lokale lamellipodia langs de randen van endotheliale cellen waargenomen vormen en achteruit in de tijd zowel nonconfluent en confluente cel monolagen. De behandeling met trombine kort onderbroken lamellipodia vormatie en omzet. Trombine veroorzaakte ook de cellen iets contract, in overeenstemming met eerdere rapporten die trombine actine stress-vezels vorming en een verhoogde spanning centripetale ontwikkeling in de endotheelcellen 12-14 veroorzaakt. Echter, van live cell imaging studies zoals deze, kan de oorsprong van de stress-vezels nu worden bepaald. In de HUVEC, de meeste van de stress vezels afkomstig van de cel periferie en lijken op dwarse boog vezels in migrerende cellen 8, 9. Een ander sterk punt van deze methode boven het gebruik van vaste cellen is dat het aantal van stress vezels kan worden gekwantificeerd in individuele cellen voor en na de behandeling trombine, waardoor selectie bias tussen de experimentele groepen. Met dit protocol evalueren we dynamische beweging van de cel rand en actine stress-vezels. Om actine monomeer dynamiek te begrijpen in endotheelcellen, meer geavanceerde technieken, zoals fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) of fluorescentie speckle microskopie (FSM) kan worden toegepast 15, 16. Bovendien, omdat microvasculaire endotheelcellen kunnen een beter model van microvasculaire barrièrefunctie, de optimalisering van transfectie protocollen om effectief GFP-actine uit te drukken in microvasculaire endotheelcellen vertegenwoordigt een logische toekomstige richting. In het kort, imaging van levende endotheliale cellen die GFP-actine vormt een krachtig instrument om te bepalen hoe de endotheelcellen actine cytoskelet reageert op verschillende soorten stimuli. Studies met behulp van goed samenvloeiing endotheliale monolagen zal helpen bij het bepalen van de rol van dynamische structuren zoals actine-rijke lamellipodia en dwars boog stress-vezels in endotheel barrièrefunctie. Daarnaast zal live cell imaging van endotheliale cellen die GFP-actine of andere fusie-eiwitten die visualisatie van andere subcellulaire structuren in staat te stellen die nodig zijn tijdruimtelijke gedetailleerde informatie om de signalering en structurele mechanismen te begrijpen dat determine barrière integriteit.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer 5x Stock </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Bedragen </td></tr><tr><td> Natrium Chloride </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Kalium Chloride </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Calcium Chloride </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Magnesium Sulfaat </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Steriel gefilterd water </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Breng aan een L </td></tr><tr><td colspan="4"> Steriele filter in geautoclaveerd flessen en winkels bij 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS buffer </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td>Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Bedragen </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Steriel gefilterd water </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Breng aan een L </td></tr><tr><td colspan="4"> Steriele filter in geautoclaveerd flessen en winkels bij 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumine fysiologische zoutoplossing (APSS) </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Bedragen </td></tr><tr><td> Ringer voorraad (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Natriumfosfaat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA natriumzout </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumine, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Steriel gefilterd water </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Breng aan een L </td></tr><tr><td colspan="4"> Breng de pH tot 7,4 bij 37 ° C, dan steriele filter in geautoclaveerd flessen en bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0,9% Saline </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Bedragen </td></tr><tr><td> Natrium Chloride </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Steriel gefilterd water </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Breng aan een L </td></tr><tr><td colspan="4"> Steriele filter in geautoclaveerd flessen en winkels bij 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% gelatine-oplossing </td></tr><tr><td> Gelatine van varkens huid </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> 0,9% Saline </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Breng aan een L </td></tr><tr><td colspan="4"> Verwarm de oplossing tot 37 ° C voldoende te ontbinden gelatine. Hoewel nog steeds warm, steriele filter in geautoclaveerd flessen en bewaar bij 4 ° C </td></tr></tbody></table>

studie van het actine cytoskelet in live endotheliale cellen die gfp-actine

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Het microvasculaire endotheel speelt een belangrijke rol als een selectief doorlaatbaar barrière voor vloeistoffen en opgeloste stoffen. De lijm verbindingen tussen endotheelcellen regelen doorlaatbaarheid van het endotheel, en vele studies hebben gewezen op de belangrijke bijdrage van het actine cytoskelet om te bepalen junctionele integriteit 1-5. Een corticale actine riem wordt gedacht dat belangrijk voor het behoud van stabiele knooppunten 1, 2, 4, 5. In tegenstelling, zijn actine stress-vezels dacht centripetale spanning binnen endotheelcellen die knooppunten 2-5 verzwakt genereren. Veel van deze theorie is gebaseerd op studies waarin endotheelcellen worden behandeld met inflammatoire mediatoren waarvan bekend is dat endotheliale permeabiliteit te verhogen, en vervolgens tot vaststelling van de cellen en de etikettering F-actine voor microscopisch observatie. Echter, deze studies een zeer beperkt begrip van de rol van het actine cytoskelet omdat beelden van de vaste cellen voorzien alleen snapshots intijd zonder informatie over de dynamiek van actine structuren 5. Live-cell imaging maakt integratie van de dynamische aard van het actine cytoskelet in de studies van de mechanismen die bepalen endotheliale barrière integriteit. Een groot voordeel van deze methode is dat de impact van verschillende inflammatoire stimuli op actine structuren in endotheelcellen kan worden beoordeeld in dezelfde set van levende cellen voor en na behandeling, het verwijderen van mogelijke vertekening die zich kunnen voordoen bij het observeren van vaste exemplaren. Humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) zijn getransfecteerd met een GFP-β-actine plasmide en uitgegroeid tot confluentie op glazen dekglaasjes. Time-lapse beelden van de GFP-actine in confluerende HUVEC worden opgevangen voor en na de toevoeging van ontstekingsmediatoren die tijd-afhankelijke veranderingen in de endotheliale barrière integriteit te lokken. Deze studies kunnen visuele waarneming van de vloeistof opeenvolging van veranderingen in het actine cytoskelet die bijdragen aan endotheell barrière verstoring en restauratie. Onze resultaten blijkt nog steeds lokaal, actine-rijke lamellipodia vorming en de omzet in endotheelcellen. De vorming en beweging van actine stress-vezels kunnen ook worden waargenomen. Een analyse van de frequentie van de vorming en de omzet van de plaatselijke lamellipodia, voor en na behandeling met inflammatoire stimuli kunnen worden gedocumenteerd door kymograaf analyses. Deze studies geven belangrijke informatie over het dynamische karakter van het actine cytoskelet in endotheelcellen die gebruikt kunnen worden om eerder geïdentificeerde moleculaire mechanismen van belang voor het behoud van de endotheliale barrière integriteit te ontdekken.

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Het microvasculaire endotheel speelt een belangrijke rol als selectief permeabele barrière voor vloeistoffen en opgeloste stoffen. De adhesieve juncties tussen endotheelcellen...

Het doel van deze procedure is om dynamische veranderingen in het actine-cytoskelet van levende endotheelcellen te observeren. Transfect eerst menselijke navelstrengader-endotheelcellen met een A GFP bèta-actine-plasmide en kweek deze tot confluentie op dekglasjes. Plaats vervolgens de dekglasjes in een live-cell imagingkamer met een verwarmde tafel en een infusie van een fysiologische albuminoppelossing.De laatste stap is de data-acquisitie van een geselecteerd gebied met cellen via time-lapse beeldopname vóór en na behandeling met een farmacologische stof. Chime-graafanalyse met beeldbewerkingssoftware zoals Image J kan inzicht bieden in lokale lamelle podia-uitstulpingen, zoals de afstand, tijd en snelheid van uitstulpingen, evenals de beweging van actinevezels in de loop van de tijd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunofluorescentie-imaging, is dat live-cell imaging het mogelijk maakt om de dynamische aard van het actine-cytoskelet te betrekken bij studies naar de mechanismen die de endotheelpermeabiliteit bepalen.Waar gefixeerde en gekleurde cellen momentopnamen in de tijd zijn en weinig informatie bieden over de dynamiek van de actine en het cytoskelet vóór en na behandeling met een inflammatoire mediator in een biologische veiligheidswerkkast. Gesteriliseerde dekglasjes met 70% ethanol gedurende twee minuten en vervolgens aan de lucht laten drogen. Plaats elk dekglasje in een kweekplaat van 10 centimeter en voeg 300 µL warme gelatineloplossing toe aan het centrum zonder de randen van het dekglasje te raken. Zuig de vloeistof na vijf minuten af.Oogst nu een confluente cultuur van menselijke navelstrengader-endotheelcellen of VE met 0,25% tripsin EDTA. Tel de cellen en spoel ze door middel van centrifugatie. Aspireer zoveel mogelijk van het SUP natum-medium voor een transfectiereactie met de VE nuclear effector kit.Resuspendeer de celpellets in basis-nucleaire effectoroplossing en voeg 0,2 tot 2 µg van het GFP beta-actine vectorplasmid toe. Breng 100 µL van de celsuspensie over naar een nucleaire effector-qvete. Tik een paar keer tegen de afgesloten qvete om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen zitten tussen de bodem van de qvete en het transfectiemonster.Plaats de Q VET in het nuclear effector two-apparaat en voer programma A 0 3 4 uit. Gebruik hiervoor een transferpipet uit de nuclear effector-kit om 500 µL voorverwarmd EGM two MV-medium over te brengen naar de qve. Breng het mengsel vervolgens terug naar de microcentrifugebuis en incubeer dit gedurende 15 minuten. Meng de getransfecteerde VE-suspensie voorzichtig één keer en breng 300 µL van de suspensie aan op een gelatine-gecoat dekglasje, zonder de randen te raken.Incubeer vervolgens gedurende één tot vier uur. Inspecteer de getransfecteerde cellen om te bevestigen dat ze aan het dekglas zijn gehecht. Voeg vervolgens 10 milliliters E GM two MV medium toe aan de plaat en incubeer verder voor GFP-expressie.Voeg eerst een albumine-fysiologische zoutoplossing of een PSS toe aan het zwaartekrachtstroomsysteem en verbind dit met de inline-verwarmer. Stel vervolgens de stroomregelaar in om een stroomsnelheid van ongeveer 40 milliliters per uur te bereiken. Stop daarna de stroom door de stopkraan met een wattenstaafje te sluiten.Breng vacuümvet aan op de buitenrand aan de onderzijde van het diamantbad. Haal nu een getransfecteerde cultuur uit de incubator. Til het dekglas voorzichtig op met een pincet.Gebruik vervolgens een Kim wipe om overtollig EGM two MV-medium op de onderste dia te absorberen, terwijl de cellen naar boven zijn gericht. Plaats het diamantbad over het dekglas om een kamer te vormen. Plaats de kamer snel in de objecttaalverwarmer.Draai de klemmen over de kamer vast en pipetteer ongeveer één milliliter EGM two MV-medium van de plaat in de kamer. Bevestig nu de vacuümslang aan de houder aan de linkerkant van de kamer en de A PSS-leiding vanuit de inlijnverwarmer in het kanaal aan de rechterkant van de kamer. Zet vervolgens het vacuüm aan en open de A PSS-leiding om de badperfusie over de getransfecteerde cellen mogelijk te maken.Schakel daarnaast de inline-verwarmer in op 37 °C. Plaats vervolgens de thermistorsensor voor de verwarmde plaat aan de rand van het bad en schakel de plaatverwarmer in op 37 °C. Om eventuele resterende EGM two MV-media en zoutaanslag te verwijderen, wordt de onderzijde van het dekglas voorzichtig afgeveegd met een Kimwipe gedrenkt in 70% ethanol, gevolgd door een droge Kimwipe. Laat de getransfecteerde HU-cellen 30 minuten equilibreren.Blokkeer de loop. Focus op het geselecteerde gebied met kweekcellen voor studie. Stel de belichtingstijd van de camera in tussen 0,5 en twee seconden, afhankelijk van de signaalintensiteit van GFP Act in de cellen.Stel daarnaast het interval en de duur van het experiment in. Maak nu, met de kamerverlichting uit, één enkele afbeelding om de instellingen te evalueren. Neem de time-lapse serie op en controleer de beelden terwijl deze worden gegenereerd.In een typisch protocol worden gedurende 20 tot 30 minuten baseline-beelden verkregen vóór toevoeging van een testmiddel, gevolgd door 0,5 tot vier uur aan aanvullende beeldacquisitie. Evalueer vervolgens, zoals подробно beschreven in de begeleidende tekst, de uitsteekafstand, persistentie en snelheid van lamely-podia via CH-grafiekanalyse. In een typisch experiment wordt GFP-actine in meer dan 50% van de getransfecteerde VE op willekeurige wijze tot expressie gebracht.Deze beelden, die eenmaal per minuut werden opgenomen, legden GFP-actine vast in het gehele cytoplasma, evenals in filamenteuze structuren en in lokale e meli podia die langs de celrand uitstaken. De afstand, persistentie en snelheid van celuitstulpingen worden gekwantificeerd aanlyd de hand van time-lapse beeldsets. Bij gebruik van chm-grafiekanalyse wordt eerst een lijn van één pixel getrokken die ongeveer loodrecht op de rand van de cel staat.Dit gebied wordt uit elke afbeelding van de time-lapse set geëxtraheerd om een montage van het gebied over de tijd of een chime-grafiek te genereren; hier, vanuit een perspectief van links naar rechts in de chime-grafiek, worden uitstulpingen weergegeven als opwaartse bewegingen in de rand van de cel. Wanneer een lijn over de rand van een van deze uitstulpingen wordt gelegd, kunnen de pixelgegevens die bij die lijn horen worden verzameld om de dynamiek van de uitstulpingen te kwantificeren. Het totale aantal uitstulpingen in een chime-grafiek kan worden gebruikt om de frequentie van de uitstulpingen te schatten.Deze analyse beeldt de bewegingen van stressvezels af die zich vormen nabij de celperiferie en naar het centrum van de cel bewegen, waar ze uiteindelijk worden afgebroken. Op de kymograaf verschijnen de stressvezels als continue lijnen in het cytoplasmatische gebied, die vaak naar beneden en naar rechts bewegen richting het centrum van de cel. Wanneer de vezels moeilijk te zien zijn op de oorspronkelijke kymograaf, scherpt het unsharp mask-filter de afbeelding aan. Lijnen die over de stressvezels worden getrokken, vergemakkelijken de verzameling van pixelgegevens met behulp van de meetfunctie. Alternatief kunnen lijnen vanaf het begin tot het einde van de geïdentificeerde stressvezel worden getrokken om een gemiddelde van de pixelgegevens over de periode te verkrijgen waarin de vezel is waargenomen.Deze presentatie demonstreerde hoe gegevens uit een time-lapse beeldenreeks kunnen worden geanalyseerd via grafiekanalyse met software zoals Image J. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de dynamiek van het actine-cytoskelet als reactie op inflammatoire mediatoren kan worden bestudeerd met behulp van live-cell imaging van getransfecteerde endotheelcellen.

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Selectie, micro-injectie, en de beeldvorming van fluorescent-gelabeld F-actine via fluorescentie microscopie spikkel (FSM).

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

Een methode om te visualiseren en te kwantificeren F-actine weerhaken eindigt in neuronale groei kegels wordt beschreven. Na het kweken neuronen op glas dekglaasjes worden cellen gepermeabiliseerd met een saponine-bevattende oplossing. Dan, een korte incubatie met de saponine buffer met rhodamine-actine bevat fluorescerende actine op gratis actine prikkeldraad eindigt.

Labeling F-actine Prikkeldraad Eindigt op Rhodamine-actine in gepermeabiliseerde neuronale groei Cones

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Leer dynamische veranderingen in het actine cytoskelet observeren in levende endotheelcellen met GFP-actine beeldvorming. Deze methode maakt real-time analyse van cytoskelet dynamiek mogelijk voor onderzoek naar endotheliale permeabiliteit.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Meer video's verkennen