Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Het doel van deze procedure is om dynamische veranderingen in het actine-cytoskelet van levende endotheelcellen te observeren. Transfect eerst menselijke navelstrengader-endotheelcellen met een A GFP bèta-actine-plasmide en kweek deze tot confluentie op dekglasjes. Plaats vervolgens de dekglasjes in een live-cell imagingkamer met een verwarmde tafel en een infusie van een fysiologische albuminoppelossing.

De laatste stap is de data-acquisitie van een geselecteerd gebied met cellen via time-lapse beeldopname vóór en na behandeling met een farmacologische stof. Chime-graafanalyse met beeldbewerkingssoftware zoals Image J kan inzicht bieden in lokale lamelle podia-uitstulpingen, zoals de afstand, tijd en snelheid van uitstulpingen, evenals de beweging van actinevezels in de loop van de tijd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunofluorescentie-imaging, is dat live-cell imaging het mogelijk maakt om de dynamische aard van het actine-cytoskelet te betrekken bij studies naar de mechanismen die de endotheelpermeabiliteit bepalen.

Waar gefixeerde en gekleurde cellen momentopnamen in de tijd zijn en weinig informatie bieden over de dynamiek van de actine en het cytoskelet vóór en na behandeling met een inflammatoire mediator in een biologische veiligheidswerkkast. Gesteriliseerde dekglasjes met 70% ethanol gedurende twee minuten en vervolgens aan de lucht laten drogen. Plaats elk dekglasje in een kweekplaat van 10 centimeter en voeg 300 µL warme gelatineloplossing toe aan het centrum zonder de randen van het dekglasje te raken. Zuig de vloeistof na vijf minuten af.

Oogst nu een confluente cultuur van menselijke navelstrengader-endotheelcellen of VE met 0,25% tripsin EDTA. Tel de cellen en spoel ze door middel van centrifugatie. Aspireer zoveel mogelijk van het SUP natum-medium voor een transfectiereactie met de VE nuclear effector kit.

Resuspendeer de celpellets in basis-nucleaire effectoroplossing en voeg 0,2 tot 2 µg van het GFP beta-actine vectorplasmid toe. Breng 100 µL van de celsuspensie over naar een nucleaire effector-qvete. Tik een paar keer tegen de afgesloten qvete om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen zitten tussen de bodem van de qvete en het transfectiemonster.

Plaats de Q VET in het nuclear effector two-apparaat en voer programma A 0 3 4 uit. Gebruik hiervoor een transferpipet uit de nuclear effector-kit om 500 µL voorverwarmd EGM two MV-medium over te brengen naar de qve. Breng het mengsel vervolgens terug naar de microcentrifugebuis en incubeer dit gedurende 15 minuten. Meng de getransfecteerde VE-suspensie voorzichtig één keer en breng 300 µL van de suspensie aan op een gelatine-gecoat dekglasje, zonder de randen te raken.

Incubeer vervolgens gedurende één tot vier uur. Inspecteer de getransfecteerde cellen om te bevestigen dat ze aan het dekglas zijn gehecht. Voeg vervolgens 10 milliliters E GM two MV medium toe aan de plaat en incubeer verder voor GFP-expressie.

Voeg eerst een albumine-fysiologische zoutoplossing of een PSS toe aan het zwaartekrachtstroomsysteem en verbind dit met de inline-verwarmer. Stel vervolgens de stroomregelaar in om een stroomsnelheid van ongeveer 40 milliliters per uur te bereiken. Stop daarna de stroom door de stopkraan met een wattenstaafje te sluiten.

Breng vacuümvet aan op de buitenrand aan de onderzijde van het diamantbad. Haal nu een getransfecteerde cultuur uit de incubator. Til het dekglas voorzichtig op met een pincet.

Gebruik vervolgens een Kim wipe om overtollig EGM two MV-medium op de onderste dia te absorberen, terwijl de cellen naar boven zijn gericht. Plaats het diamantbad over het dekglas om een kamer te vormen. Plaats de kamer snel in de objecttaalverwarmer.

Draai de klemmen over de kamer vast en pipetteer ongeveer één milliliter EGM two MV-medium van de plaat in de kamer. Bevestig nu de vacuümslang aan de houder aan de linkerkant van de kamer en de A PSS-leiding vanuit de inlijnverwarmer in het kanaal aan de rechterkant van de kamer. Zet vervolgens het vacuüm aan en open de A PSS-leiding om de badperfusie over de getransfecteerde cellen mogelijk te maken.

Schakel daarnaast de inline-verwarmer in op 37 °C. Plaats vervolgens de thermistorsensor voor de verwarmde plaat aan de rand van het bad en schakel de plaatverwarmer in op 37 °C. Om eventuele resterende EGM two MV-media en zoutaanslag te verwijderen, wordt de onderzijde van het dekglas voorzichtig afgeveegd met een Kimwipe gedrenkt in 70% ethanol, gevolgd door een droge Kimwipe. Laat de getransfecteerde HU-cellen 30 minuten equilibreren.

Blokkeer de loop. Focus op het geselecteerde gebied met kweekcellen voor studie. Stel de belichtingstijd van de camera in tussen 0,5 en twee seconden, afhankelijk van de signaalintensiteit van GFP Act in de cellen.

Stel daarnaast het interval en de duur van het experiment in. Maak nu, met de kamerverlichting uit, één enkele afbeelding om de instellingen te evalueren. Neem de time-lapse serie op en controleer de beelden terwijl deze worden gegenereerd.

In een typisch protocol worden gedurende 20 tot 30 minuten baseline-beelden verkregen vóór toevoeging van een testmiddel, gevolgd door 0,5 tot vier uur aan aanvullende beeldacquisitie. Evalueer vervolgens, zoals подробно beschreven in de begeleidende tekst, de uitsteekafstand, persistentie en snelheid van lamely-podia via CH-grafiekanalyse. In een typisch experiment wordt GFP-actine in meer dan 50% van de getransfecteerde VE op willekeurige wijze tot expressie gebracht.

Deze beelden, die eenmaal per minuut werden opgenomen, legden GFP-actine vast in het gehele cytoplasma, evenals in filamenteuze structuren en in lokale e meli podia die langs de celrand uitstaken. De afstand, persistentie en snelheid van celuitstulpingen worden gekwantificeerd aanlyd de hand van time-lapse beeldsets. Bij gebruik van chm-grafiekanalyse wordt eerst een lijn van één pixel getrokken die ongeveer loodrecht op de rand van de cel staat.

Dit gebied wordt uit elke afbeelding van de time-lapse set geëxtraheerd om een montage van het gebied over de tijd of een chime-grafiek te genereren; hier, vanuit een perspectief van links naar rechts in de chime-grafiek, worden uitstulpingen weergegeven als opwaartse bewegingen in de rand van de cel. Wanneer een lijn over de rand van een van deze uitstulpingen wordt gelegd, kunnen de pixelgegevens die bij die lijn horen worden verzameld om de dynamiek van de uitstulpingen te kwantificeren. Het totale aantal uitstulpingen in een chime-grafiek kan worden gebruikt om de frequentie van de uitstulpingen te schatten.

Deze analyse beeldt de bewegingen van stressvezels af die zich vormen nabij de celperiferie en naar het centrum van de cel bewegen, waar ze uiteindelijk worden afgebroken. Op de kymograaf verschijnen de stressvezels als continue lijnen in het cytoplasmatische gebied, die vaak naar beneden en naar rechts bewegen richting het centrum van de cel. Wanneer de vezels moeilijk te zien zijn op de oorspronkelijke kymograaf, scherpt het unsharp mask-filter de afbeelding aan. Lijnen die over de stressvezels worden getrokken, vergemakkelijken de verzameling van pixelgegevens met behulp van de meetfunctie. Alternatief kunnen lijnen vanaf het begin tot het einde van de geïdentificeerde stressvezel worden getrokken om een gemiddelde van de pixelgegevens over de periode te verkrijgen waarin de vezel is waargenomen.

Deze presentatie demonstreerde hoe gegevens uit een time-lapse beeldenreeks kunnen worden geanalyseerd via grafiekanalyse met software zoals Image J. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de dynamiek van het actine-cytoskelet als reactie op inflammatoire mediatoren kan worden bestudeerd met behulp van live-cell imaging van getransfecteerde endotheelcellen.