Name: Cercarial Transformatie en In vitro Teelt van Schistosoma mansoni Schistosomules (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Leer de transformatie van cercariën naar schistosomula van Schistosoma mansoni in vitro. Deze methode omvat oogst uit Biomphalaria glabrata, concentratie en cultuur in RPMI-medium bij 37°C.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gefinancierd door de Case Western Reserve University opstarten fondsen verstrekt aan E. Jolly. Geïnfecteerde slakken werden verstrekt door de schistosome Resource Center, NIH-NIAID (NIAID Contract No HHSN272201000009I). We danken ook Chris King en Ronald Blanton voor ondersteuning bij het veiligstellen van geïnfecteerde schistosome slakken en voor nuttige discussies.

Veiligheidsmaatregelen: Schistosome cercariae kan direct doordringen in de huid zonder de behoeften van een gesneden of poriën, en de oorzaak van de chronische ziekte schistosomiasis. S. mansoni is een bioveiligheidsniveau twee organisme, dus de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en de juiste veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het ​​werken met infectieuze cercaria. Het merendeel van de apparatuur die nodig is om te groeien en te transformeren schistosomen is standaard, met een paar belangrijke uitzonderingen vermeld in de tabel aan het einde van het protocol. Alle cercarial werk moet worden gedaan in een geïsoleerde kamer. Schistosomules moet worden gekweekt in een steriele, goedgekeurd bioveiligheid kap. Twee lagen nitril of latex handschoenen worden gedragen, evenals een laboratoriumjas, een waterdichte paar schoenen, broek met geen gaten of scheuren, en waterdicht mouwbeschermers voor uw polsen en armen. In het geval van een ongeluk morsen, onmiddellijk spuiten verontreinigde plek met 70% ethanol of 10% bleekmiddel, wrijven krachtig als op uw persoon. Dit zal voldoende zijn om de parasiet uit te schakelen, maar alle mogelijke infecties moeten worden gemeld en serieus genomen. Hoewel schistosomules zijn niet aangeboren besmettelijk, institutionele richtlijnen variëren, en dient te worden geraadpleegd om te bepalen of BSL2 voorzorgsmaatregelen nodig zijn tijdens de niet-infectieuze levensfasen. Desinfecteer alle oppervlakken die in contact komen met potentieel besmettelijke stof na het experiment wordt uitgevoerd en gooi afval in een goedgekeurd biohazard container. LET OP: Cover slak gastheer bakken 1 tot 2 dagen voorafgaand aan de uitscheiding en bescherming tegen licht 1. Oogsten cercariae van de slak gastheer <ol><li> Vul een schone, 500ml beker vrij van detergenten de helft vol met gedestilleerd water op kamertemperatuur. Als het werken met host slakken geïnfecteerd met miracidia op verschillende data, gebruik dan een aparte beker voor elke infectie datum (Dit is vooral van belang als de slakken zal worden hergebruikt voor toekomstige experimenten). De grootte van de beker kan ook kleiner zijn, afhankelijk van de ervaring van de gebruiker. </li><li> Verzamel geïnfecteerde slak hosts die u wilt werpen en zorgvuldig deponeren ze in de beker met behulp van een standaard aquarium vissen net en voor algemene doeleinden tang als nodig is. </li><li> Plaats bekerglas op een spill ongeveer 8 tot 12 centimeter lade onder een gloeilamp. Laat staan ​​voor 1-2 uur onder het licht. Cercariae verlaten de slak gastheer wanneer ze worden blootgesteld aan fel licht. </li><li> Zorgvuldig te filteren slakken uit de cercariae mengsel. Neem extra voorzorgsmaatregelen, als mengsel is zeer besmettelijk. Onthoud cercariae direct kan de menselijke huid binnen te dringen! </li><li> Vervang mengsel onder lichtbron gedurende ongeveer 15 minuten, waardoor alle deeltjes afvalstoffen om zich te vestigen. </li><li> Transfer cercariae in een schone erlenmeyer met behulp van een pipet, het vermijden van het puin op de bodem van de beker. Plaats de kolf op ongeveer een hoek van 45 ° op het ijs in het donker voor 45 - 60 minuten, waardoor cercariae zich te vestigen in een hoek. </li><li> Gebruik een 50 ml pipet tot 75 tot 90% van het supernatant te verwijderen en deze deponeren in bekerglas met 10% bleekmiddel of 70% ethanol, waarbij zorg niet te laten waterdruppels bevat cercariae druppelen uit de pipet. </li><li> Schud de erlenmeyer met cercariae zachtjes aan de cercariae in oplossing mengen. Gebruik een pipet om het monster over te dragen aan steriele 50 ml conische buizen. Weer plaats buizen op ijs gedurende 20 minuten in het donker. Cercariae zal regelen naar de onderkant van de buis in het donker. </li></ol> 2. Handmatige transformatie van cercariae aan schistosomules Voordat u begint: Zorg RPMI 1640 compleet (RPMI, 5% Fetal Bovine Serum, 1X Pen / Strep) en warm tot 37 ° C. (Het is cruciaal dat de foetale gebruikte bovine serum werd geïnactiveerd door incubatie een 56 ° C gedurende 1 uur als schistosomen kunnen gevoelig zijn aan te vullen). <ol><li> In een biohazard kap, verwijder supernatant tot 5 tot 10 ml van de oplossing in elk 50 ml conische met behulp van een pipet of vacuüm apparaat. </li><li> Bevestig een 22 gauge double-ended, Luer Lok emulgeren naald om een ​​juiste maat spuit. </li><li> Langzaam trekken mengsel in de spuit. Verzamel cercariae van alle 50 ml buizen in een spuit. Wees attent van druipen. </li><li> Draai spuit over zulke dat de losse naald einde is omhoog. Bevestig de andere spuit om deze kant van het emulgeren naald. </li><li> Passeren het mengsel door de naald in totaal 40 keer (20 keer heen en weer) naar de cercariae transformeren. </li><li> Plaats de spuiten verticaal zodanig dat het mengsel is opgenomen in de bodem spuit en de bovenkant spuit leeg is. Verwijder de top spuit en desinfecteren in 70% ethanol. </li><li> Borgsom mengsel druppelsgewijs in een schone hoog ommuurde 100mm x 50mm pyrex schotel of kristalliserende schotel. Desinfecteer naald en spuit in 70% ethanol. </li><li> Voeg 37 ° C RPMI 1640 complete media zodanig dat debodem van de petrischaal is volledig bedekt, als het gieten een Luria bouillon plaat. </li><li> Roer voorzichtig om schistosomules verzamelen in het midden van de petrischaal. Vermijd spatten. Opmerking: Het kan nuttig zijn uit te schakelen de motorkap licht voor deze stap om meer adequaat te visualiseren de schistosomules in het centrum. </li><li> Onmiddellijk storten geconcentreerd schistosomules in een frisse 12-well celkweek plaat goed af met een steriele pipet. </li><li> Herhalen 2.9 en 2.10 tot schistosomules niet meer aanwezig zijn in het centrum van de schotel (ongeveer 10 keer). Storting elk vervolgens wordt opgevangen in een frisse goed. </li><li> Vul elk putje tot halverwege (~ 1,5 ml) met een voorverwarmde RPMI complete media. </li><li> Visualiseren op een omgekeerde microscoop op de aanwezigheid van schistosomules en afwezigheid van cercariae te verifiëren. </li><li> Groeien de schistosomules in een CO 2 incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: In afwachting van de overdracht van getransformeerde schistosomules in cultuur media, visualisatie onder een omgekeerde bright-veld microscoop (zie tabel apparatuur voor een voorbeeld) moet opleveren een afbeelding lijkt op een, waarin alleen getransformeerd schistosomules aanwezig zijn in de goed figuur. Potentiële contaminanten kunnen zijn intact cercariae, doorgesneden cercarial staarten, of ander afval. Als er geen omgekeerde microscoop beschikbaar is, wordt een standaard microscoop of zelfs een dissectie ruimte zijn voldoende om de schistosomules visualiseren. Merk op dat deze procedure niet altijd 100% van de cercariae transformeren. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Transformed Schistosomulum <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: cercariae en Severed Tails

<ol><li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li>
<li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis+and+water+resources+development%3A+systematic+review%2C+meta-analysis%2C+and+estimates+of+people+at+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li>
<li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Int%22%5BJournal%5D)">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li>
<li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection%3A+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li>
<li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae%3A+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li>
<li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+within+host+tissues%3A+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li>
<li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li>
<li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+cercarial+responses+to+irradiance+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li>
<li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula%2C+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li>
<li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li>
<li>Yoshino, T. P. &amp, Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li>
<li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li>
<li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li>
<li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een aantal mogelijke problemen kunnen ontstaan ​​tijdens de transformatie procedure, maar dit protocol is ontworpen om de meeste van deze problemen te voorkomen. Een potentieel gevaar is de verstopping van de naald emulgeren, die meestal ontstaat door puin dat overbleef van de oogst in stap 1.3. Zorg ervoor om alle deeltjes om zich te vestigen in stap 1.5 en de cercariae zorgvuldig overdracht in stap 1.6 om dit probleem te voorkomen. Ook, zoals eerder beschreven, het werken in een biologisch veiligheidskabinet, gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (zelfs gelaatsschermen) en het vermijden van overmatige druk op het spuiten is aan te raden. Vrijstaande cercarial staarten kunnen worden gevisualiseerd in de media, die wijzen op een slechte scheiding is bij stap 2.9. De staarten vertonen een spasme-achtige beweging en hebben een aparte vorm (zie figuur 2), wat zich dus gemakkelijk te onderscheiden van de schistosomules. De staarten kunnen worden verwijderd door het wassen van de schistosomules dan RPMI te voltooien zodat de schistosomules om zich te vestigen. De staarten blijft drijven en kan worden gestofzuigd uit. Als intact cercariae aanwezig zijn in de media, was de transformatie in stap 2.5 niet goed uitgevoerd. Een beeld van een intacte cercaria is afgebeeld in figuur 3b ter referentie. Als dit probleem zich voordoet, zorgen dat het emulgeren naald wordt gebruikt is van de juiste grootte. Ook kan het aantal keren dat de cercarial mengsel wordt doorgegeven via de naald worden verhoogd, ook al 40 keer is meestal veel meer dan genoeg om 100% afschuiven van de cercarial staarten aanpak. Transformatie van cercaria in schistosomules werd voor het eerst beschreven in 1974 door Colley en Wikel (13). Sindsdien is de voorbereiding van schistosomules is gedaan met behulp van de afschuiving strategie met een naald en een spuit, zoals beschreven in dit protocol, of met behulp van een vortex aanpak en gescheiden met hellingen van Percoll (14, 15) of wervelende zoals blijkt in dit artikel. Deze twee technieken voor het bereiden van schistosomules zijn prachtig beschreven door Fred Lewis (16) en meer informatie voor de verdere kweken van schistosomules voor groei op lange termijn kan worden gevonden op de NIAID schistosome Resource Center ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;Emulgeren naald </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 tot 825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 medium 1X (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) warmte geïnactiveerd </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Kristalliseren Dish (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> General Purpose pincet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco Aquarium net voor artemia </td><td> Petco </td><td> SKU: 1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformatie en in vitro teelt van schistosoma mansoni schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma parasieten zijn de verwekkers van schistosomiasis, een chronisch invaliderende ziekte die meer dan 200 miljoen mensen lijden wereldwijd en op de tweede plaats om malaria onder de parasitaire ziekten op het gebied van de volksgezondheid en de sociaal-economische gevolgen (1-4). Schistosome parasieten zijn trematode wormen met een ingewikkelde levenscyclus verwisselen tussen een parasitaire leven in weekdieren en zoogdieren gastheren met tussenliggende vrij zwemmende stadia. In het kort, vrij zwemmende cercariae infecteren van een zoogdier gastheer door het penetreren van de huid met behulp van afgescheiden proteasen, gedurende welke tijd de cercariae hun staart verliezen, verandert in schistosomules. De schistosomules moet nu ontwijken de gastheer immuunsysteem, het ontwikkelen van een darm voor de vertering van rode bloedcellen, en migreren hoewel de longen en de portale circulatie op weg naar hun eindbestemming in de lever portal systeem en uiteindelijk de mesenteriale aderen (voor S. mansoni) waar de mannelijke en vrouwelijke wormen paren en paren, het produceren van honderden eitjes per dag. Een deel van de eieren worden uitgescheiden uit het lichaam in zoet water, waar de eieren uitkomen in het vrije-zwemmen miracidia (5-10). De miracidia infecteren specifieke slakkensoorten en te transformeren tot moeder en dochter sporocysts, die op hun beurt, produceren infectieuze cercariae, het voltooien van de levenscyclus. Helaas kan de hele schistosome levenscyclus niet worden gekweekt in vitro, maar infectieuze cercariae kunnen worden omgezet in schistosomules, en de schistosomules kunnen worden gekweekt voor de week voor de analyse van schistosome ontwikkeling van in vitro of microarray analyse. In dit protocol, bieden wij een visuele beschrijving van cercarial transformatie en in vitro kweken van schistosomules. We werpen besmettelijk cercariae van de slak gastheer Biomphalaria glabrata en ze handmatig omzetten in schistosomules door het losmaken van hun staart met behulp van een emulgerende overloopnaald. De in vitro cercarial transformatie en schistosomules cultuur technieken beschreven vermijden het gebruik van een zoogdier gastheer, die visualisatie van schistosomen vereenvoudigt en vergemakkelijkt de verzameling van de parasiet voor experimentele analyse. Transformatie en in vitro kweken technieken van schistosomen zijn gedaan voor de jaren (11, 12), maar geen visuele protocollen ontwikkeld die beschikbaar zijn voor de gehele gemeenschap.

Beschrijven we een<em&gt; In vitro</em&gt; Methode voor het kweken van schistosomula van de platworm parasiet<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, Via het oogsten en de transformatie van infectieuze cercariae van het zoete water slak tussengastheer Biomphalaria glabrata.

Cercarial Transformatie en In vitro Teelt van Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosomaparasieten zijn de veroorzakers van schistosomiasis, een chronische debiliterende ziekte die wereldwijd meer dan 200 miljoen mensen treft en ...

Het algemene doel van deze procedure is om infectieuze CRC e om te zetten in shisom. Dit wordt bereikt door eerst infectieuze CRC uit de slakgastheer te oogsten. De infectieuze CRC wordt geconcentreerd en vervolgens met een tweesnijdende naald omgezet in niet-infectieuze shisom.Ten slotte worden de shisom geconcentreerd en verzameld in een kweekplaat en geïncubeerd in RPMI bij 37 °C en 5% CO2. Met deze methode kunnen getransformeerde shisom met FU cial of cial staartcontaminatie worden verkregen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien een transformatieprocedure moeilijk aan te leren en potentieel gevaarlijk kan zijn.Cica's zijn infectieus en komen in hoge concentraties voor; de isolatie ervan vereist een voorzichtige en nauwkeurige behandeling om veilig en effectief te kunnen werken. John, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Vul een schoon bekerglas van 500 milliliter voor de helft met gedistilleerd water op kamertemperatuur. Gebruik een standaard aquariumvisnet en een pincet om de geïnfecteerde slakken naar het bekerglas over te brengen.Plaats het bekerglas op een opvangbak voor lekken op een afstand van 20 tot 30 cm onder een gloeilamp en laat het daar één tot twee uur staan. Blootstelling aan fel licht zorgt ervoor dat de CRC de slakgast verlaat. Neem bij het verwijderen van de slakken extra veiligheidsvoorzorgsmaatregelen om elk contact met het infectieuze water te vermijden, aangezien dit CRC bevat die direct door de menselijke huid kunnen dringen.Verwijder de slakken en vervang vervolgens de oplossing onder een lichtbron gedurende ongeveer 15 minuten, zodat eventueel particulate afvalmateriaal naar de bodem van de kolf kan zinken. Zodra het afval is bezonken, gebruikt u een pipet om de circ over te brengen naar een schone erlenmeyerkolf, waarbij u het bezinksel op de bodem van het bekerglas vermijdt.Plaats de kolf in het ijs onder een hoek van 45 graden. Incubeer de oplossing in het donker gedurende 45 tot 60 minuten zodat de CRC zich in één hoek kan verzamelen. Zodra de parasieten zijn bezonken, gebruik dan een pipet van 50 milliliter om het grootste deel van het supernatant te verwijderen en gooi dit voorzichtig weg.Hussel de erlenmeyerkolf voorzichtig in een bekerglas met 10% bleekmiddel of 70% ethanol om de parasieten opnieuw te resuspenderen. Gebruik vervolgens een pipet om het monster over te brengen naar steriele conische buisjes van 50 milliliter. Plaats de buisjes op ijs en incubeer ze nogmaals 20 minuten in het donker om de CRC te laten bezinken.Zodra de parasieten zijn bezonken, gebruikt u een pipet om het grootste deel van de supernatanten af te voeren, waarbij vijf tot 10 milliliters vloeistof in elke buis achterblijft. Bevestig vervolgens een 22 gauge double-ended lure lock emulsienaald aan een spuit. Trek de oplossing met de parasieten langzaam vanuit elke buis in de spuit.Zorg ervoor dat het infectieuze mengsel niet in de zuigkast druppelt. Draai de spuit voorzichtig zodat de naald naar boven wijst en bevestig een tweede spuit aan het vrije uiteinde van de naald. Duw het mengsel ongeveer 20 keer heen en weer tussen de twee spuiten om de crc te transformeren.Plaats de spuiten vervolgens verticaal, zodat de lege spuit bovenaan staat. Verwijder de bovenste spuit voorzichtig en desinfecteer deze in 70%Ethanol. Breng de parasieten druppel voor druppel over in een schone Pyrex-crystallisatieschaal met hoge wanden.Desinfecteer vervolgens de naald en de spuit in 70% ethanol. Plaats daarna het schaaltje op een witte achtergrond om de parasieten beter te kunnen visualiseren en voeg voorverwarmd RPMI op 37 °C toe, zodat de bodem van het Pyrex-schaaltje volledig bedekt is.Wrijf voorzichtig om de shisom in het midden te verzamelen met behulp van een steriele pipet. Neem een deel van de geconcentreerde shisom op en breng de parasieten over naar een nieuwe 12-wells celkweekplaat. Herhaal deze spoelstap totdat er geen parasieten meer over zijn.Zodra de parasieten zijn overgebracht, vult u elke put voor ongeveer de helft met warm RPMI om de aanwezigheid van shisom te verifiëren. Visualiseer de plaat met een omgekeerde lichtmicroscoop. Op dit punt zouden de meeste parasieten getransformeerd moeten zijn tot shisom, die te onderscheiden zijn van CRC E omdat ze minder modaal zijn en de karakteristieke cial-staart missen.Een klein aantal intacte CRC-cellen, afgebroken CRC-staarten of ander debris kan mogelijk ook aanwezig zijn. De cellen kunnen vervolgens worden gekweekt en onderhouden in een incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende maximaal zes weken, met wekelijkse mediumverversingen. Houd er rekening mee dat werken met infectieuze materialen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van dubbele handschoenen, mouwbeschermers en het correct gebruik van faciliteiten en biohazard-zuirkasten.

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Schistosoma mansoni eieren zijn krachtige stimulatoren van de T-helper type 2 (Th2) immuunrespons, kenmerk van parasitaire infecties, astma en allergische ontsteking. Dit protocol maakt gebruik van S. mansoni ei injectie om een CD4 Th2 cytokine-geïnduceerde ontstekingsreactie in de long, gekenmerkt door long granuloomvorming rond het ei, eosinofilie en macrofaag alternatieve activatie te genereren.

Het gebruik van eieren van<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als een<em&gt; In vivo</em&gt; Model van Helminth veroorzaakte longontsteking

Dit artikel beschrijft een protocol voor de grootschalige een isolatie en verzameling van vrijzwemmende miracidia van de menselijk bloed fluke Schistosoma mansoni en hun verdere verwerking voor in vitro cultuur binnenbrengen.

Massa isolatie en In Vitro kweek van Intramolluscan stadia van de menselijke bloed Fluke Schistosoma Mansoni

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van extracellulaire blaasjes (EVs) isolatie in in vitro gekweekte medium uit volwassen Schistosoma japonicum.

Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.

Nucleofection en in Vivo propagatie van kippeneimeria parasieten

Gedetailleerd onderzoek naar muggenstadia van malariaparasieten is van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve transmissieblokkeringsstrategieën. Dit protocol laat zien hoe infectieuze gametocyten effectief kunnen worden gekweekt en deze gametocyten vervolgens aan muggen kunnen worden gevoerd om muggenstadia van P. falciparumte genereren .

Plasmodium falciparum Gametocytencultuur en muggeninfectie door kunstmatige membraanvoeding

We beschrijven een snelle transiënte transductietechniek in verschillende ontwikkelingsstadia van Echinococcus granulosus met behulp van lentivirale vectoren van de derde generatie.

Voorbijgaande transductie van de gestrobileerde vormen van Echinococcus granulosus

Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis - en L. donovani-stammen die het gen voor eGFP tot expressie brengen als een stabiel geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. Getransfecteerde parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit in beide soorten werden geselecteerd voor verder gebruik in medicijnscreeningtests.

Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP

Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.

Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

Deze studie toont een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. We nemen de geoptimaliseerde techniek voor cytoskeletale eiwitten en pan-proteoomlabeling op.

Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Leer de transformatie van cercariën naar schistosomula van Schistosoma mansoni in vitro. Deze methode omvat oogst uit Biomphalaria glabrata, concentratie en cultuur in RPMI-medium bij 37°C.

Cercarial Transformatie en In vitro Teelt van Schistosoma mansoni Schistosomules

Meer video's verkennen