Name: Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer de isolatie van primaire muis trofoblastcellen uit placenta op zwangerschapsdag 10,5. Dit protocol omvat dissectie, enzymatische vertering en een matrigel-invasieassay om celgedrag te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de Creative Services team bedanken van de Universiteit van Missouri Academic Support Center, die geproduceerd deze video. Dit werk werd ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health &amp; Human Development van de National Institutes of Health, licentienummer HD055231

1. Dissectie van de muis placenta <ol><li> Stel paring paren van muizen. </li><li> Op elk van de volgende dagen, te controleren op de aanwezigheid van een copulatory stekker. De dag waarin een plug wordt gedetecteerd wordt beschouwd als 0,5 dagen na de coïtus (dpc) 7. </li><li> Placenta kunnen worden verzameld bij de gewenste fase van de zwangerschap met een schone ontleding van de placenta mogelijk begin met de ontwikkeling van de placenta van rijpe d 10.5. Hier laten we zien 14,5 dpc. Bij de opgegeven volumes is 40-60 placenta op 10,5 dpc, en 10-20 placenta op 14,5 dpc leveren een duidelijk zichtbare trofoblast cellaag. </li><li> Euthanaseren de zwangere muis, en verwijder de baarmoeder, het snijden in de baarmoederhals, en langs de mesometrium. </li><li> Met behulp van een scherpe schaar, knip tussen elke conceptie (Figuur 1A). </li><li> Gebruik van twee paar tang, pakt u de baarmoederwand aan de snijkant en trek uit elkaar, het verwijderen van het myometrium (Figuur 1B) . Een paar gekartelde, matig fijn (gebogen of rechte) tang plus een paar zeer fijne tang (# 5, bijvoorbeeld) wordt aanbevolen. </li><li> Tegenover de placenta, opent u de decidua met een tang of schaar, het blootstellen van placenta. Baarmoederweefsel grijpen met een paar pincetten, schuift een forceps onder de placenta te scheiden (figuur 1C). Eventueel aparte foetus en foetale membranen van placenta. Het is niet mogelijk om alle deciduale weefsel dissectie verwijderen zonder verlies ook placentaweefsel, maar extra deciduale weefsel (licht) worden verwijderd van het oppervlak van de placenta voorzichtig peeling met forceps. Wij vertrouwen op de Percoll-gradiënt voor verdere zuivering. </li><li> Plaats elke placenta ontleed in 25 ml ijskoude buffer dissociatie in een 50 ml conische buis totdat alle secties zijn voltooid. In een later stadium, grof placenta weefsel voorafgaand gehakt met een schaar of scheermesje om te zetten in dissociatie buffer. </li></ol>TLE "&gt; 2. Isolatie van trofoblast cellen <ol><li> Losjes cap conische buis en plaats in een 37 ° C bad voor 45-60 minuten. Meng krachtig de dissociatie oplossing pipetteren ongeveer elke 10 minuten. De totale destructietijd moeten nauwgezet worden gevolgd en zal waarschijnlijk vereist wat trial and error om een ​​optimale cel herstel te bereiken. Weefsels moeten kunnen worden door een 10 ml pipet, maar zichtbare stukjes weefsel blijft. Overdigestion zal slechte celoverleving en plating efficiency. Optimale celoverleving en plating efficiency zal gebeuren wanneer groepjes van enkele cellen aanwezig zijn, dan wanneer volledige dissociatie wordt bereikt. Omgekeerd zal underdigestion leiden tot minder zuiverheid na Percoll scheiding. Wanneer de goede vertering bereikt is, plaats buis op ijs stoppen collagenase activiteit. </li><li> Laat de oplossing door een celzeef te onverteerd materialen te verwijderen, en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Te wassen, te verwijderensupernatant en resuspendeer cellen in 10 ml wasoplossing. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Tijdens het centrifugeren, bereid door het mengen Percoll oplossing 9,6 ml Percoll, 13,4 ml wasoplossing en 1,1 ml 10x medium 199 in een 50 ml buis geschikt voor hoge snelheid te centrifugeren. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in 2 ml wasoplossing. </li><li> Toevoegen cellen oplossing Percoll en @ 30.000 xg gecentrifugeerd gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de buis uit centrifuge zonder verstoring van het verloop. Om de gradiënt, plaats buis te visualiseren in de voorkant van een heldere lichtbron. Zoek de trofoblast band (figuur 2), en zuigen met een pipet, zorg ervoor dat u de rode bloedcel band onder verstoren. Volume van de trofoblast band zal 5 tot 8 ml. </li><li> Overdracht trofoblastcellen een 50 ml conische buis. Toevoegen wasoplossing tot een totaal volume van 45 ml. </li><li> Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer in cultuur medium (NCTC-135). Cellen kunnen worden gekweekt op dunnelaag matrigel of weefselkweek plastic bij 37 ° C en 5% CO2. Op dag 10,5, elke placenta levert ongeveer 50.000 levende cellen, waarvan 80-90% wordt cytokeratine positief. </li></ol> 3. Trofoblastinvasie Assay <ol><li> Voeg 1-2 ml kweekmedium (NCTC-135) elk matrigel kamer en incubeer bij 37 °, 5% CO2 gedurende 30-90 min. </li><li> Verwijder medium, en voeg 1,5 ml x 10 5 vers geïsoleerde cellen in 2 ml medium tot bovenste kamer. Voeg 1 ml medium aan onderste compartiment naar lagere membraanoppervlak bedekken. </li><li> Kweekcellen in inserts 18-24 uur. </li><li> Schraap cellen en Matrigel van het inzetstuk met behulp van een schuim wattenstaafje. </li><li> Spoel de top en bodem van de kamer in 2 ml PBS. </li><li> Oplossing voor 5 min in 1 ml 4% paraformaldehyde in PBS. </li><li> Vlek vult onderste kamer met 400 ui DAPI (300 nM) en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Spoel even driemaal in PBS. </li><li verwijder membranen van inzetstukken met een scherp scalpel.><li> Voeg 10 ul druppel fixeermiddel (50% glycerol in PBS) te glijden. Met behulp van een tang, leg membraan op drop. Voeg een 10 ul druppel medium, dan voorzichtig dekglaasje aan. </li><li> Foto en tellen cellen. Zorg ervoor dat u te oriënteren het membraan op de juiste wijze (cel naar boven of cel-kant naar beneden) voor de microscoop wordt gebruikt. Afbeelding J software (National Institutes of Health) een handmatige telling functie die kan worden gebruikt voor dit doel, evenals Adobe Photoshop of een handmatige teller. </li></ol> 4. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Dissectie van de muis placenta. (A) De baarmoeder verwijderd door snijden langs de eileiders (geel), langs het mesometrial oppervlak en de baarmoederhals (onder). Individuele conceptuses kan dan worden gescheiden door snijden met een schaar zijn. (B) De baarmoeder wand wordt verwijderd door twee forceps in de baarmoeder gesneden oppervlak en scheuren langs de anti-mesometrial kant bij de foetus en weg van de placenta. (C) De placenta wordt vervolgens geïsoleerd door grijpen met een forceps en glijden andere tussen de placenta en baarmoederweefsel. Navelstreng en andere extra-embryonale membranen kunnen dan gescheiden van de placenta. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Percoll scheiding van trofoblastcellen. Na centrifugeren wordt drie banden zichtbaar zoals in cartoon links ziet, foto rechts. De bovenste band bevat celresten en fibroblasten en het meest duidelijk. A tight (rood) band aan de onderkant met rode bloedcellen zichtbaar net onder de trofoblast diffuse band. Celaggregaten zal waarschijnlijk gezien in de trofoblast band, zoals in de twee getoonde net links van de pijl in de foto. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Invasieve trofoblast cellen (witte pijl) gaat door de Matrigel laag en het membraan poriën, die op het onderste oppervlak van het membraan. De poriën zijn ook zichtbaar (zwarte pijl). Het aantal cellen op het gehele membraanoppervlak of een representatief gebied kan worden geteld. Een afbeelding met grijswaarden van TL-DAPI nucleaire kleuring is omgekeerd om visualisatie van cellen te verbeteren. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Trofoblastcellen kunnen worden geïdentificeerd en de zuiverheid van de geïsoleerde populatie geëvalueerd door immuunkleuring voor cytokeratine 7 (midden, magenta). Cellen worden tegengekleurd met DAPI (boven, blauw). Samengevoegde afbeelding, onderaan.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

In deze video tonen we de isolatie van trofoblastcellen van de muis placenta. Vervolgens tonen een in vitro assay voor trofoblastinvasie. Met deze procedure een grotendeels, maar niet geheel, kan zuivere populatie trofoblastcellen worden verkregen. Als verdere zuiverheid vereist is, kan magnetische bead scheiding of flowcytometrie worden uitgevoerd, zoals is beschreven voor primaire humane trofoblastcellen. De juiste lengte van de collagenase dissociatiestap moet worden bepaald bij elk experiment en worden geleerd door ...

isolatie van primaire muis trofoblast cellen en trofoblastinvasie assay

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

De placenta is verantwoordelijk voor het transport van voedingsstoffen, gassen en groeifactoren voor de foetus, alsmede de verwijdering van afvalstoffen. Zo defecten in ontwikkeling van de placenta belangrijke gevolgen voor de foetus en moeder en zijn een belangrijke oorzaak van embryonale letaliteit. De belangrijkste celtype van de foetale deel van de placenta de trofoblast. Primaire muis placenta trofoblastcellen een nuttig hulpmiddel om normale en abnormale ontwikkeling van de placenta, en in tegenstelling cellijnen kunnen worden geïsoleerd en gebruikt om trofoblast studeren in specifieke stadia van de zwangerschap. Daarnaast kunnen primaire kweken van trofoblast uit transgene muizen worden gebruikt om de rol van bepaalde genen in cellen van de placenta te bestuderen. De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de beschrijving door Thordarson et al.. 1, waarbij een Percoll-gradiënt wordt gebruikt om een relatief zuivere trofoblast celpopulatie verkrijgen van geïsoleerde muis placenta. Het is vergelijkbaar met de meer algemeend methoden voor menselijke trofoblast celisolatie 2-3. Zuiverheid kan worden bepaald door immunocytochemisch kleuren van de geïsoleerde cellen voor cytokeratine 7 4. Hier worden de geïsoleerde cellen geanalyseerd met een matrigel invasie assay te beoordelen trofoblast invasiviteit in vitro 5-6. De binnengedrongen cellen geanalyseerd door immunocytochemie en gekleurd voor tellen.

In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

De placenta is verantwoordelijk voor het transport van nutriënten, gassen en groeifactoren naar de foetus, evenals voor de eliminatie van afvalstoffen.
Bijgevolg leiden defecten ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van primaire placentaire trofoblastcellen van muizen voor celkweek. We zullen ook een toepassing van deze cellen demonstreren, een Matrigel-invasie-assay. De uterus wordt verwijderd uit de drachtige muis en de placenta wordt gedissecteerd.Het placentawefsel zal enzymatisch worden verteerd om individuele cellen of kleine celklontjes te verkrijgen, waarna de cellen worden gescheiden via een protocol met een dichtheidsgradiënt. De band die de trofoblastcellen bevat, wordt geaspireerd, waarna de resulterende celpopulatie kan worden gewassen en uitgeplaat. Vervolgens demonstreren we de invasie-assay, waarbij cellen worden geplaatst op een laag matrigel die een dun membraan bedekt.Invasieve cellen zullen door de matrigellaag digesteren en door poriën van acht micrometer in het membraan passeren. De cellen worden vervolgens gefixeerd en het membraan wordt verwijderd. De geïnvadeerde cellen kunnen daarna worden gekleurd en geteld.Hallo, ik ben Kathleen Pennington van het Schultz Laboratory van de afdeling Verloskunde, Gynaecologie en Vrouwengezondheid aan de University of Missouri in Columbia, Missouri. Vandaag laten we u de procedure zi

isolation-primary-mouse-trophoblast-cells-trophoblast-invasion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, tonen we de isolatie van de muis blastocysten en de afleiding van trofoblast stamcellen uit blastocysten. We beschrijven ook de voorwaarden voor het onderhoud van de stamcel terrein en in de inductie van differentiatie in cultuur.

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het efficiënt siRNA transfectie van vers geïsoleerde menselijke villous cytotrofoblasten behulp microporatie en het identificeren van DNA-eiwitcomplexen in deze cellen. Getransfecteerde cellen kunnen worden gecontroleerd door Western blot en EMSA analyses gedurende de 4 dagen cultuurtijd.

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Dit manuscript presenteert een uniek in vitro model van immunogezuiverde humane villoze cytotrofoblastcellen gekweekt onder hypoxie/reoxygenatie. Dit model is geschikt om de beschermende effecten van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, op zwangerschapscomplicaties geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress en veranderde placentafunctie te bestuderen.

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

Hier presenteren we een protocol voor de directe omzetting van muis embryonale fibroblasten in volledig functionele en stabiele trofoblast-stamcellen door tien dagen overexpressie van Tfap2c, Gata3, Eomes en Ets2.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

Het huidige protocol maakt het herstel mogelijk van buisachtige structuren die zijn gevormd in de klassieke in vitro angiogenese-buisvormingstest waarbij cellen, zoals trofoblastcellen, zich organiseren in capillaire structuren over een laag extracellulaire basaalmembraanmatrix. De teruggevonden structuren worden gebruikt voor RNA- en eiwitisolatie voor verschillende biochemische analyses.

Trofoblastcelherstel van angiogenese-buisvormingstest voor analyse van differentiatiemarkerexpressie

Dit protocol maakt zuivering, karakterisering en kweek mogelijk van primaire HLA-G+ extravilleuze trofoblasten (EVT) uit de decidua basalis en het chorionmembraan van menselijke termplacenta's. Primaire EVT-culturen behouden de levensvatbaarheid gedurende 96 uur, waardoor co-kweek met monster-gematchte moederlijke immuuncellen en daaropvolgende flowcytometrische en moleculaire analyse van hun interacties mogelijk is.

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Leer de isolatie van primaire muis trofoblastcellen uit placenta op zwangerschapsdag 10,5. Dit protocol omvat dissectie, enzymatische vertering en een matrigel-invasieassay om celgedrag te bestuderen.

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

Meer video's verkennen