Name: Imaging Leukocyt Hechting aan het vasculair endotheel bij High intraluminale druk (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Leer hoe leukocyten hechten aan het vasculair endotheel onder hoge intraluminale druk met behulp van geïsoleerde halsslagaders. Deze methode maakt real-time visualisatie van celadhesie mogelijk voor onderzoek naar hypertensie en vasculaire ontsteking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd mede ondersteund door OIS de Victoriaanse regering Program, de National Health en Medical Research Council van Australië programma en projectsubsidies (JPF Chin-Afstoffen) en de postdoctorale beurs (D Michell).

1. Isoleren van halsslagaders <ol><li> Euthanase10 week oud Sprague Dawley ratten via CO 2 / O 2 stikken. </li><li> Accijnzen links en rechts gemeenschappelijke halsslagaders met aorta en het hart zorgen voor een minimale rek van de schepen. </li><li> In ijskoud Krebs buffer gescheiden van de halsslagaders van de aorta en het hart en uit te voeren dicht dissectie. </li><li> Houden geïsoleerde schepen in Krebs op het ijs voor de montage. </li></ol> Ca. tijd = 45 min. 2. Priming van het schip kamer <ol><li> Op de proximale en distale aansluitingen van het schip kamer flush Krebs buffer gehandhaafd op fysiologische pH door het inbrengen van carbogen gas (95% O 2, 5% CO 2) door de buffer bij 37 ° C. </li><li> Zorg ervoor dat slangen en canules zijn volledig gespoeld en worden uitgelijnd. </li><li> Spoel Krebs buffer door de P1 (proximale) en P2 (distale) transducers. Dicht kranen geen luchtbellen in de transducers te verzekeren. </li><li> Sluit de sensoren aan de overeenkomstige connectors en weer spoelen meer Krebs buffer zodat er geen luchtbellen. Af te sluiten kranen naar de kamer. </li></ol> Ca. tijd = 15 minuten 3. Onder druk van het schip kamer <ol><li> Zet drukapparatuur: druk servo, druk monitor, peristaltische pomp (figuur 1). </li><li> Met de peristaltische pomp op druk en de druk servo op de automatische lopen Krebs buffer via de slang bij 20 mmHg (dial op 1), zodat er geen luchtbellen. </li><li> Sluit de slang aan de gesloten P2 transducer. Druk zal worden stabiel. </li><li> Open P2 tik op om het schip kamer uit te spoelen eventuele luchtbellen vervolgens af te sluiten. </li><li> Vul het bad met Krebs buffer (5 - 7 ml). </li></ol> Ca. tijd = 10 minuten 4. Montage van het schip <ol><li> Onder een dissectiemicroscoop plek zwart polyester banden op elke canule (figuur 2). </li><li> Uit elkaar bewegen canules en canule houders en montage ¼ vat (aortaboog einde) op de P1 canule. Zorg ervoor dat niet aan het schip scheuren. </li><li> Met behulp van een injectiespuit gevuld met Krebs buffer zachtjes spoelen overtollige bloed uit het vat via P1 transducer. Af te sluiten P1 naar kamer. </li><li> Veilig vaartuig naar de P1 canule met de polyester stropdas. </li><li> Bewegen canules / canule houders dichter voor montage op de P2 canule. </li><li> Mount distale uiteinde van het schip (~ ¼ van de lengte) op distale canule. Veilig met polyester stropdas. </li></ol> Ca. tijd = 20 minuten 5. Onder druk van het schip <ol><li> Stel de canule houders geen gebogen of gevouwen in de tank te verzekeren. </li><li> Met P1 en P2 gesloten om de kamer schakel de druk servo van automatisch naar handmatig. Controle van de druk servo is er geen continue daling van de druk binnen de 10 seconden. Als er is, is een lek optreedt en de verbindingen en transducers moeten worden vastgezet. </li><li> Terug Stel de druk servo om automatisch open P2 aan de kamer. Onder de microscoop te observeren het schip verwijden wanneer de kraan wordt geopend naar de kamer. </li><li> Schakel de druk servo naar handmatig. Nogmaals te controleren op continue daling van de druk binnen de 10 seconden. Als er een lek dan is het systeem niet strak druk en er is waarschijnlijk een gat in het vat te zijn. </li><li> Terugschakelen naar automatisch te openen P1 naar de kamer. Op de handmatige instelling te controleren dat de druk stabiel blijft. </li><li> Als er geen lekken, op handmatige instelling te verhogen draaiknop om 2 (40 mmHg). </li><li> Aan te passen aan de automatische en bekijk de vaartuigen die onder de microscoop. Indien nodig, de canule houder geen bocht in de vessel.Check op lekkage op de handmatige instelling te garanderen. </li><li> Herhaal de stappen 5,6 tot 5,7 het verhogen van de draaiknop om drie (60 mmHg), 4 (80 mmHg) en zo verder tot de gewenste druk is bereikt. </li></ol> Ca. tijd = 15 - 30 minuten 6. Het incuberen van de onder druk staande schip <ol><li> Sluit de temperatuurregelaar ingesteld op 37 ° C. </li><li> Met een tweede peristaltische pomp perfuseren Krebs buffer (1 ml / min) in het vat kamer bad. </li><li> Sluit aspirator naar kamer garanderen alleen de bovenste laag van het bad wordt verwijderd. </li><li> Incubeer druk vat bij 37 ° C gedurende 1 uur met de druk is ingesteld op automatisch. </li><li> Controleer de druk is niet lekt (te schakelen naar manuele) periodiek. </li><li> De effecten van verschillende farmacologische interventies kunnen worden waargenomen door simpelweg toevoegen van de verbinding om het bad tijdens de incubatie. </li></ol> Ca. tijd = 1 uur 7. Perfuseren de onder druk staande schip met volbloed <ol><li> Tijdens de incubatie te krijgen op zijn minst 7,5 ml humaan volbloed / vaartuig verzameld in 40 U heparine / ml bloed. Incubeer in een 50 ml falcon bij 37 ° C. </li><li> 10 minuten voor het einde van de thij incubatie label bloed met VybrantDil (1:1000) gedurende 10 minuten bij 37 ° C in het donker. </li><li> Na 10 minuten, het verzamelen van bloed in een spuit clearing eventuele luchtbellen en bevestig op een spuit pomp met een warmte-jasje ingesteld op 37 ° C. </li><li> Af te sluiten P1 transducer naar de kamer / vaartuig en sluit spuit en afval buizen. </li><li> Purge bloed bij 1000 pL / min door het afval slangetje om het even welke bellen te verwijderen. </li><li> Open P1 naar de kamer. De druk servo zal automatisch aanpassen aan de gewenste druk te handhaven. </li><li> Perfuseren bloed bij 100 pL / min. </li><li> Met behulp van een fluorescerende microscoop gekoppeld aan een digitale camera verslag twee velden van de geperfuseerde schip gedurende 15 seconden op 1, 3, 5, 7,5 en 10 minuten. </li><li> Na de perfusie endotheel integriteit en functie kan worden beoordeeld via farmacologische technieken zoals myograph en adhesiemoleculen expressie kan worden bepaald door immunohistochemie om verder te valideren de ontstekingsreactie. </li></ol> Ca. tijd = 15 minuten 8. Representatieve resultaten: Een schematisch diagram van de drukkamer setup is weergegeven in figuur 1. Met een digitale camera gekoppeld aan een fluorescentiemicroscoop resultaten kunnen direct worden gevisualiseerd via live video-opnames. Vertegenwoordiger van videobeelden zijn te zien in figuur 3, waar leukocyten worden beschouwd als aanhanger van het endotheel als ze bleven stil voor 10 seconden. Met de video-opnamen op een continue lus gehandeld cellen kan worden beschouwd als een gemiddelde per veld. Hoewel beide laag (figuur 3A) en hoge (figuur 3B) druk zal een bepaalde hoeveelheid van de hechting leiden tot een significante toename van leukocyten adhesie op het hogere intraluminale druk wordt gezien en dit is ook kwantitatief aangetoond (figuur 4). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Onder druk ex vivo schip kamer schema. Gecanuleerde Een vat aangesloten op een proximaal (P1) transducer en een distale (P2) transducers die de bloeddruk kan worden gemanipuleerd in het vat. Perfusie is door de P1 transducer en de druk wordt onderhouden via P2 transducer. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Cannuala met banden. Zwarte polyester banden zijn aan elke canule. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger van videobeelden. Dynamic cel adhesie (rode pijl) onder fluorescentie bij 80 mm Hg (A) en 120 mmHg (B) na 10 minuten van de perfusie. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Leukocyt hechting in Sprague Dawley halsslagaders na 1 uur incubatie bij lage (80 mmHg) en hoge druk (120 mmHg). *** P &lt;0.001, zoals geanalyseerd door de 2-weg herhaalde metingen ANOVA met Bonferroni post hoc test.

<ol><li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li>
<li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.</li>
<li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li>
<li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li>
<li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+not+hemodynamic%2C+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li>
<li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li>
<li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li>
</ol>

Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Alfred Medical Research en Onderwijs Precinct Dier Ethische Commissie en het Alfred Hospital ethische commissie.

Dit is een aangepaste methode om leukocyt adhesie studeren aan het endotheel in intacte geïsoleerde bloedvaten onder druk omstandigheden in real time. Perfusie van het schip kamer alleen al maakt een snelle validatie van pro-inflammatoire stammen van de grote muizen en ratten schepen. Waardoor de druk manipulatie laat dynamische cel interacties in acht te nemen van laag tot zeer hoog intraluminale druk, dus beter na te bootsen-ing fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Diameter van de schepen kan ook worden gemeten met behulp van een voldoende cell-imaging-programma, zodat shear flow en snelheid kan worden bepaald en dus gemanipuleerd. Met zijn myograph mogelijkheden, farmacologische interventies in het bad nog een dimensie toe aan de experimentele omstandigheden mogelijk met dit model mogelijk studies van de mechanistische en signaalwegen. Terwijl endotheel bewaring kan niet worden bevestigd tijdens de druk van manipulatie, kunnen reacties op ACh en PE worden uitgevoerd na de perfusie 9. Opgemerkt moet worden dat deze opzet de effecten van de intraluminale druk op de cel-tot-cel interacties niet de effecten van de pulsatiele bloedstroom, noch systolische of diastolische druk toont. Bovendien, terwijl de druk acute veranderingen op leukocyt adhesie werden waargenomen, kan deze setup ook worden gebruikt om te kijken naar chronische druk-effecten (namelijk het vergroten incubatietijden en het gebruik van een chronische druk diermodel). Sprague Dawley gemeenschappelijke halsslagaders worden gedemonstreerd in deze set-up maar ook andere stammen en diersoorten kunnen worden gebruikt met de nodige aanpassingen aan de canule maat. Inderdaad, is het belangrijk op te merken dat de leeftijd en het gewicht van de dieren grootte van het vaartuig van invloed zijn en dus dat de set-up moet worden geïndividualiseerd voor elk vaartuig. Sluiten en een zorgvuldige dissectie van het bindweefsel kan verbeteren visualisatie van leukocyten enorm.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> STEREO Discovery V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 spuitpomp </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Digitale Camera en Controller </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentie verlichting System </td><td> Lumen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Vessel Kamer </td><td> Levende systemen Instrumentatie </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Druk Servo Controller en slangenpomp </td><td> Levende systemen Instrumentatie </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Perfusiedruk Monitor </td><td> Levende systemen Instrumentatie </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x Druk Transducer </td><td> Levende systemen Instrumentatie </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Temperatuurregelaar </td><td> Levende systemen Instrumentatie </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Slangenpomp </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil cel-labeling oplossing </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Gebruik 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyt hechting aan het vasculair endotheel bij high intraluminale druk

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Wereldwijd, hypertensie is naar verluidt in ongeveer een kwart van de bevolking en is de toonaangevende biomedische risicofactor voor mortaliteit wereldwijd. In het vaatstelsel hypertensie wordt geassocieerd met endotheliale dysfunctie en verhoogde ontsteking leidt tot atherosclerose en diverse ziektebeelden zoals chronische nierziekte 2, beroertes 3 ​​en hartfalen 4. Een eerste stap in het vasculaire ontsteking leidt tot de atherogenese is de hechting cascade die de rollen, tethering, naleving en de daaropvolgende transmigratie van leukocyten door het endotheel inhoudt. Werving en accumulatie van leukocyten aan het endotheel wordt bemiddeld door een opregulatie van adhesie moleculen zoals vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellulaire cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) en E-selectine en toename van de cytokine en chemokine vrijkomen en een opregulatie van reactieve zuurstof species 5. In vitro-methoden zoals statische hechting testen helpen om mechanismen die betrokken zijn in cel-cel adhesie, alsook de analyse van celadhesie-moleculen te bepalen. Methoden die in eerdere in vitro studies hebben aangetoond dat acute stijging van de druk op het endotheel kan leiden tot monocyten hechting, een opregulatie van adhesiemoleculen en inflammatoire markers 6 echter, vergelijkbaar met een groot aantal in vitro-testen, deze bevindingen zijn niet uitgevoerd in real-time onder fysiologische omstandigheden stroom, noch met volbloed. Daarom worden in vivo testen steeds meer gebruikt in diermodellen om vasculaire ontsteking en plaque ontwikkeling aan te tonen. Intravitale microscopie is nu op grote schaal gebruikt om de leukocyten adhesie, walsen, migratie en transmigratie 7-9 te beoordelen. Bij het ​​combineren van de effecten van de druk op de leukocyten aan endotheel adhesie van de in vivo studies zijn minder uitgebreid. Een van deze studie onderzoekt de real-time effecten van de flow en afschuiving op arteriële groei en remodeling, maar inflammatoire markers werden alleen beoordeeld via immunohistochemie 10. Hier presenteren we een model voor het opnemen van leukocyten adhesie in real time in intacte onder druk bloedvaten met behulp van volbloed perfusie. De methodiek is een wijziging van een ex vivo schip kamer perfusie model 9, die real-time analyse van leukocyt-endotheliale lijm interacties in intacte schepen mogelijk maakt. Onze aanpassing maakt de manipulatie van de intraluminale druk tot 200 mmHg waardoor studeren niet alleen onder fysiologische stroming, maar ook druk omstandigheden. Terwijl de druk myography systemen zijn eerder aangetoond dat vaatwand en lumen diameter 11 en schip krimp zien is dit de eerste keer tonen leukocyten-endotheel interacties in real time. Hier laten we zien de techniek met behulp van halsslagaders geoogst van ratten en gecanuleerde om een ​​custom-made stroom kamer gekoppeld aan een fluorescentiemicroscoop. Het schip kamer is uitgerust met een groot dekglaasje bodem waardoor een grote diameter objectief met een korte werkafstand om de afbeelding van het schip. Bovendien kunnen geselecteerde agonist en / of antagonisten worden gebruikt om verder te onderzoeken van de mechanismen die celadhesie. Voordelen van deze methode meer dan intravitale microscopie zijn geen betrokkenheid van invasieve chirurgie en dus een hogere doorvoersnelheid kan worden verkregen. Deze methode maakt het ook mogelijk het gebruik van gelokaliseerde remmer behandeling om de gewenste schip terwijl intravitale alleen mogelijk systemische remmer behandeling.

Dit is een methode om leukocyt adhesie te visualiseren aan het endotheel in geoogste drukvaten. De techniek maakt het bestuderen van vasculaire adhesie onder afschuiving stroom met verschillende intraluminale druk tot 200 mmHg aldus de pathofysiologische omstandigheden van hoge bloeddruk na te bootsen-ing.

Imaging Leukocyt Hechting aan het vasculair endotheel bij High intraluminale druk

Wereldwijd wordt gemeld dat hypertensie voorkomt bij ongeveer een kwart van de bevolking en het is de belangrijkste biomedische risicofactor voor mortaliteit wereldwijd. ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van de adhesie van leukocyten aan het endotheel in geoogste, onder druk gezette vaten. Dit wordt bereikt door eerst een arteria carotis te isoleren uit een rat of muis. Vervolgens wordt het vat gemonteerd in een drukkamer.Het vat wordt vervolgens onder druk gezet en gedurende één uur geïncubeerd bij de gewenste druk. Ten slotte wordt gelabeld volbloed door het onder druk gezette vat geperfuseerd. Hiermee kunnen uiteindelijk resultaten worden verkregen die de real-time adhesie van leukocyten aan het endotheel tonen via een aangepaste ex vivo vatkamer, gekoppeld aan een precisie-servo en een fluorescentiemicroscoop.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals statische adhesie-assays, is dat leukocytadhesie kan worden waargenomen in intacte functionele arteriën met gebruik van volbloed. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar hypertensie, zoals het effect van een hoge intraluminale druk op inflammatie en hoe dit kan bijdragen aan atherosclerose. Nadat de arteriae carotis zijn geïsoleerd uit 10 weken oude, spread dolly-ratten en de perfusiekamer is voorbereid en onder druk is gezet, wordt het vat onder een dissectiemicroscoop gemonteerd door eerst zwarte polyester bindbanden op elke canule te plaatsen, het vat naar het bad te verplaatsen en vervolgens een kwart van het vat op de P1-canule te monteren.Zorg ervoor dat het vat niet beschadigd raakt met een spuit gevuld met Krebs-buffer. Spoel voorzichtig overtollig bloed uit het vat via de P1-transducer. Sluit P1 af naar de kamer.Zet het vat met de polyester binddraad vast aan de P één canule. Verplaats de canules en canulehouders dichterbij om ze op de P twee canule te monteren. Monteer het distale kwartuiteinde van het vat op de P twee canule.Zet het vast met een polyester riem om het vat onder druk te zetten. Pas de canulehouders aan om er zeker van te zijn dat het vat niet buigt of uitrekt terwijl P één en P twee naar de kamer toe gesloten zijn. Schakel de drukservo over van automatisch naar handmatig.Controleer de drukservo om te verifiëren dat er binnen 10 seconden geen drukval optreedt. Een afname in druk duidt op de aanwezigheid van een lek, waardoor de verbindingen en de transducer steviger vastgezet moeten worden om drukdichtheid te garanderen. Zet de drukservo terug op automatisch, open vervolgens P twee naar de kamer onder de microscoop en observeer hoe het vat uitzet.Wanneer de kraan naar de kamer openstaat. Zet de drukservo op handmatig. Controleer opnieuw op eventuele drukverlagingen.Als de drukval aanhoudt, dan is het systeem niet luchtdicht en is er waarschijnlijk een lek in het vat. Schakel terug naar de automatische stand en open P1 naar de kamer. Controleer bij de handmatige instelling of de druk stabiel blijft.Indien stabiel, draai de schijf naar twee, waardoor het vat onder druk komt te staan tot 40 millimeter kwik. Schakel over naar de automatische stand en observeer het vat onder de microscoop. Pas indien nodig de canulehouder aan om er zeker van te zijn dat het vat bij de handmatige instelling niet geknikt is.Controleer op lekken. Verhoog vervolgens de draaiaanpassing in stappen van één, waarbij u tussentijdig overschakelt op automatisch, om het vat onder de microscoop te observeren totdat de gewenste druk is bereikt. Zodra de gewenste druk is bereikt, verplaatst u de kamer naar de stereomicroscoop.Sluit de temperatuurregelaar aan en stel deze in op 37 °C. Sluit vervolgens de peristaltische pomp en de aspirator aan om de Krebs-buffer in het bad vers te houden. Incubeer het onder druk gezette vat gedurende één uur bij 37 °C.Controleer periodiek op lekken. Label 7,5 milliliters pre-gecoat volbloed, verzameld met vitale kleurstof in het donker. Incubeer dit vervolgens gedurende 10 minuten bij 37 °C.Verzamel het bloed in een spuit, verwijder eventuele luchtbellen en bevestig deze op een spuitpomp met een verwarmingsmantel ingesteld op 37 °C. Sluit de P1-transducer naar de kamer af en sluit de spuit en de afvoerslang aan. Spoel het bloed met een snelheid van 1000 µL per minuut door de afvoerslang om alle luchtbellen te verwijderen en open vervolgens P1 naar de kamer.De drukservo zal zich automatisch aanpassen om de gewenste druk te handhaven; perfuseer het bloed met 100 µL per minuut en gebruik een fluorescentiemicroscoop gekoppeld aan een digitale camera om twee velden van het geperfuseerde vat gedurende 15 seconden op verschillende tijdstippen vast te leggen. Representatieve afbeeldingen van leukocyten worden hier getoond, waarbij leukocyten als adherent aan het endotheel worden beschouwd als ze 10 seconden stationair blijven. Met videopyopnames in een continue loop kunnen de cellen als gemiddelde per veld worden geteld, waarbij zowel lage als hoge druk een zekere mate van adhesie zullen veroorzaken.Er wordt een significante toename van de leukocytenadhesie waargenomen bij een hogere intraluminale druk. Dit wordt kwantitatief aangetoond in deze grafiek, waar een groter aantal cellen per veld adhereert bij 120 versus 80 millimeters kwik druk. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals PCR en immunohistochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de gen- en eiwitexpressie van adhesiemoleculen.

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven hier een niet-invasieve twee-foton (2P) microscopie aanpak om te studeren leukocyten homing in de muis voetzool. We bespreken de technische aspecten van onze weefsels beeldvorming voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

This video demonstrates a laminar flow-based assay to characterize the interaction of leukocytes and cellular partners such as endothelial cells. This method provides dynamic insights into adhesion, deadhesion, and transmigration of leukocytes when perfused over an intact and confluent layer of vascular cells.

A Laminar Flow-Based Assay to Study the Interactions Between Leukocytes and Endothelial Cells

Leukocyten rekrutering naar de lever plaatsvindt binnen de gespecialiseerde kanalen van de lever sinusoïden die worden omzoomd door unieke lever sinusoïdale endotheelcellen. Fasecontrastmicroscopie van werving leukocyten over humane lever sinusvormige endotheel onder omstandigheden van fysiologische shear stress kan de ontrafeling van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces te vergemakkelijken.

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Hier presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker leukocytaantrekking dynamiek ex vivo evaluatie door er een kamer bekleed met endotheliaalverkregen adhesiemoleculen aan het circulatiesysteem van een muis. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen, omdat het zorgt voor leukocyten beoordeling op grond van de relatieve biologische omstandigheden.

Het beoordelen Leukocyte-endotheliale Interacties Onder stroomtoestanden in een Ex Vivo Autoperfused microflow Kamer Assay

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Dit manuscript beschrijft het gebruik van transgene reporter muizen en andere beheerprogramma routes van fluorescente kleurstoffen in angiotensine II-geïnduceerde hypertensie met behulp van intravital videomicroscopie van bloedvaten te evalueren van de activering van immune cellen en hun mogelijkheid te rollen en zich houden aan het endotheel.

Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Dit stapsgewijze protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van de experimentele opstelling en data-analyse voor de beoordeling van inflammatoire reacties in hiPSC-ECs en de analyse van leukocyten hechting onder fysiologische stroom.

Microfluidic Assay voor de beoordeling van leukocyten hechting op menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide endotheliale cellen (hiPSC-ECs)

In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

Leer hoe leukocyten hechten aan het vasculair endotheel onder hoge intraluminale druk met behulp van geïsoleerde halsslagaders. Deze methode maakt real-time visualisatie van celadhesie mogelijk voor onderzoek naar hypertensie en vasculaire ontsteking.

Imaging Leukocyt Hechting aan het vasculair endotheel bij High intraluminale druk

Meer video's verkennen