Toepassing van een muis geligateerd Peyer's Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen
December 17th, 2011
M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door M-cellen In vivo. Deze methode biedt een methode om de M-cel functie te begrijpen in het immuunsysteem.
Het algemene doel van deze procedure is om de opname van bacteriën door M-cellen, die zich in het mucosale immuunsysteem van de darm bevinden, te onderzoeken. De eerste stap van deze procedure is om de darmpijlen van een verdoofde muis bloot te leggen en te binden. Fluorescente bacteriën worden vervolgens geïnjecteerd in het gebonden gebied.
Een uur later worden de pijlen uitgesneden. De cellen in het weefsel worden vervolgens gepermeabiliseerd en gekleurd voor de M-celmarker, GP twee. Ten slotte worden de monsters onder een confocale microscoop waargenomen en kunnen bacteriën die door M-cellen worden getranscytoseerd, worden gevisualiseerd.
Naast het bieden van inzicht in de moleculaire basis van de bacteriële transcytose door m-cellen, kan ontslag worden toegepast op andere systemen. Bijvoorbeeld, dit protocol zou kunnen worden gebruikt om de celpermeabiliteit en het geframeerde darm te ondersteunen met behulp van chloor en microben. Gebruik een steriele glazen verspreider om de fluorescente bacteriën op een LB-borstelplaat te strijken en de plaat te incuberen bij 37 graden Celsius tot er enkele kolonies zichtbaar zijn. Neem een enkele kolonie van de vaste boor en inoculeer deze in twee milliliter verse LB-media.
Kweek vervolgens de bacteriën overnacht op een shaker bij 37 graden Celsius. Zodra de startcultuur is gegroeid, brengt u 500 microliter bacteriën over in 4,5 milliliter LB-medium en incubeert u deze nieuwe cultuur bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vier uur of totdat de optische dichtheid bij 600 nanometer één bereikt, wat aangeeft dat de bacteriegroei in de log-fase is. Op dit punt centrifugeert u de cultuur gedurende vijf minuten bij 3000 keer G bij vier graden Celsius om de bacteriën te oogsten. Gooi na centrifugatie de snat weg en was de pellet met vijf milliliter steriele PBS. Na het herhalen van de wasstap schorsuit de bacteriën in vijf milliliter PBS.
Nadat de muis onder continue isoflurine-anesthesie is geplaatst, gebruik steriele hulpmiddelen om het abdomen van de muis asseptisch te openen. Begin met het blootleggen van de dunne darm en lokaliseer de PI-patches. Zodra een PI-patch is gevonden, gebruik steriele naaigaren om de darm ongeveer vijf millimeter aan één kant van de patch te binden.
Zorg ervoor dat u bloedvaten tijdens de procedure niet doorknipt. Zodra de darm is gebonden, gebruikt u een spuit om 50 microliter bacteriesuspensie van ongeveer 10 tot de zevende CFU in de gebonden pijlenpatch te injecteren op de losse kant van de darm. Gebruik vervolgens garen om de andere kant van de darm te binden.
Sluit het abdomen van de muis met een clip en houd de muis een uur onder anesthesie voordat u hem euthaniseert. Om de pijlenpatch te oogsten, snijdt u de pijlenpatch voorzichtig uit. Spoel vervolgens krachtig PBS door het geoogste deel van de darm meerdere keren om de apicale kant van de PI-patch te wassen en overtollig mucosaal vocht en bacteriën te verwijderen.
Zodra de PI-patch is gewassen, plaatst u deze in een put van een 24-welplate en voegt u cyto-effecten of cyto-permoplossing toe. Incubeer het monster op ijs gedurende een uur. Zodra de P'S-patch is gefixeerd, weekt u deze in één milliliter perm-wasbuffer gedurende vijf minuten.
Herhaal deze wasstap drie keer. Plaats vervolgens het monster in één milliliter blokkeringsbuffer en incubeer het op ijs gedurende 30 minuten. Na de blokkeerstap voegt u anti-muis GP twee monoklonaal antilichaam toe tot een eindconcentratie van vijf microgram per milliliter en incubeert u het monster een nacht bij vier graden Celsius om de M-cellen te kleuren.
Was vervolgens het monster zoals eerder. Voeg een secundair vloer voor geconjugeerd antilichaam toe en incubeer het monster op ijs in het donker gedurende twee uur. Zodra het monster is gekleurd, wast u het monster voorzichtig in PBS.
Plaats vervolgens drie of vier stukken rond glas op een dia en begraaf de pires-patch in 200 microliter van een 30% glyceroloplossing in PBS. Gebruik op de dia een DM IRE twee confocale lasermicroscoop of een Delta Vision Restauratie Deconvolution-microscoop om het monster te observeren. In deze afbeelding kunnen groene GFP-gelabelde salmonella typhimurium worden gezien omringd door GP twee dat in rood op het apicale plasmamembraan wordt getoond.
In deze gedraaide afbeelding zijn bacteriën zichtbaar binnen de sub-apicale cytoplasmatische vesikel. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bacteriële transcytose door M-cellen kunt beoordelen met behulp van een geligade pys-intestinale Lu-asay.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op M-cellen in het immuunsysteem van het darm slijmvlies, met name hun rol bij bacteriële transcytose. De beschreven methode maakt de evaluatie van de M-celfunctie in vivo mogelijk, wat bijdraagt aan ons begrip van mucosale immuunbewaking.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Microbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- M-cellen zijn gespecialiseerde epitheelcellen in de Peyer'se patches.
- Ze spelen een cruciale rol in de immuunrespons van de darm.
- Het begrijpen van hun functie kan inzichten geven in darmgezondheid en ziekte.
- Bacteriele transcytose is een sleutelproces in immuunbewaking.
Doel van de studie
- Om bacteriële opname door M-cellen in vivo te evalueren.
- Om een methode te ontwikkelen voor het bestuderen van de M-celfunctie.
- Om het begrip van mucosale immuunbewakingsmechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het ligeren van intestinale Peyer'se patches bij anesthetiseerde muizen.
- Het injecteren van fluorescerende bacteriën in het geligeerde gebied.
- Het excideren van de Peyer'se patches na een uur.
- Het kleuren van weefselmonsters voor de M-cel marker GP2 en observeren met confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van bacteriële transcytose door M-cellen.
- Demonstratie van de haalbaarheid van de evaluatiemethode.
- Inzichten in de immuunfunctie van M-cellen verschaft.
- Bijgedragen tot het begrip van darm-geassocieerd lymfoïde weefsel.
Conclusies
- De methode maakt een gedetailleerde studie van de M-celfunctie mogelijk.
- Het begrijpen van M-cellen kan strategieën voor darmgezondheid informeren.
- Verder onderzoek zou de implicaties voor immuuntherapieën kunnen verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of bacterial transcytosis by M cells in Peyer’s patches addresses a critical gap in understanding mucosal immune surveillance and host-microbe interactions. This assay enables mechanistic de-risking of antigen uptake pathways, supporting predictive confidence in early immunology and microbiome-targeted discovery. The method’s ability to distinguish bacterial species transcytosed by M cells informs target validation and portfolio triage for mucosal immunomodulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of M cell-mediated antigen uptake mechanisms in a physiologically relevant system.
- Supports functional target validation for molecules modulating mucosal immune responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the role of Gp2 and bacterial ligands in transcytosis.
- Provides predictive confidence for advancing immunomodulatory or microbiome-based candidates.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated ex vivo platform for quantifying bacterial uptake by M cells using fluorescence and confocal microscopy.
- Enables reproducible measurement of transcytosis events across bacterial strains and experimental conditions.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators affecting M cell function or permeability.
- Facilitates reliable evaluation of candidate compounds targeting mucosal immune pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying host-microbe interactions in the gut mucosa.
- Provides translational continuity from discovery to preclinical validation of mucosal immune targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions for immunotherapeutic and vaccine candidates targeting gut immunity.
- Supports identification of translational biomarkers linked to M cell-mediated antigen uptake.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing of antigen uptake, supporting lead identification, and informing preclinical validation of mucosal immune modulators.
- Discovery Biology: Quantifies M cell-mediated transcytosis to clarify antigen uptake pathways and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for comparing bacterial uptake across strains and interventions.
- Analytics: Delivers confocal imaging and fluorescence-based measurements to support statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical models of gut immunity and host-microbe interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse bacterial species and candidate modulators in mucosal immunology workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mucosal immune target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes bacterial uptake quantification and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunomodulatory and microbiome-targeted programs, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting gut immune pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and confocal microscopy.
- Demands access to fluorescence labeling reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different bacterial species or model systems.
- Throughput is limited by surgical and imaging workflow constraints.
