Toepassing van een muis geligateerd Peyer's Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

Het algemene doel van deze procedure is om de bacteriële opname door M-cellen in het mucosale immuunsysteem van de darm te onderzoeken. De eerste stap van deze procedure is het blootleggen en afbinden van de Peyerse platen van een geanestheseerde muis. Vervolgens worden fluorescente bacteriën in het afgebonden gebied geïnjecteerd.

Een uur later worden de pyres-patches weggesneden. De cellen in het weefsel worden vervolgens gepermeabiliseerd en gekleurd voor de M-celmarker GP2. Tot slot worden de monsters geobserveerd met een confocale microscoop, waarbij bacteriën die door M-cellen worden getranscytozeerd gevisualiseerd kunnen worden.

Naast het bieden van inzicht in de moleculaire basis van bacteriële transcytose door M-cellen, kan deze methode worden toegepast op andere systemen. Bijvoorbeeld, dit protocol zou kunnen worden gebruikt om de celpermeabiliteit in een ontstoken darm te bestuderen met behulp van cholera en microben. Gebruik een steriele glazen spreider om de fluorescerende bacteriën uit te strijken op een LB-agarplaat en incubeer de plaat bij 37 °C totdat individuele kolonies zichtbaar zijn. Neem één enkele kolonie van de vaste agar en inoculeer deze in 2 mL vers LB-medium.

Kweek vervolgens de bacteriën overnacht op een schudder bij 37 °C. Zodra de startcultuur is gegroeid, brengt u 500 µL bacteriën over in 4,5 mL LB-medium en incubeert u deze nieuwe cultuur bij 37 °C gedurende drie tot vier uur, of totdat de optische dichtheid bij 600 nm één bereikt, wat aangeeft dat de bacteriële groei zich in de logfase bevindt. Centrifugeer de cultuur op dit punt bij 3000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C om de bacteriën te oogsten. Verwijder na centrifugatie het supernatant en was de pellet met vijf mL steriele PBS. Na het herhalen van de wasstap resuspendeert u de bacteriën in vijf mL PBS.

Nadat de muis onder continue isofluoraan-anesthesie is geplaatst, opent u met steriele instrumenten aseptisch de buikholte van de muis. Begin met het blootleggen van de dunne darm en lokaliseer de Peyerse platen. Zodra de Peyerse platen zijn gevonden, gebruikt u steriel hechtgaren om de darm ongeveer vijf millimeter naast de plaat af te binden.

Zorg ervoor dat u tijdens de procedure geen bloedvaten doorsnijdt. Zodra de darm is afgebonden, gebruikt u een spuit om 50 µL bacteriële suspensie van ongeveer 10⁷ CFU in de afgebonden pyres-patch-lus aan de losse zijde van de darm te injecteren. Bind vervolgens de andere zijde van de darm af met garen.

Sluit de buikholte van de muis met een klem en houd de muis gedurende één uur onder anesthesie voordat deze wordt geëuthanaseerd. Om het pyres-stukje te oogsten, exciseert u dit stukje voorzichtig. Spoel vervolgens meerdere keren krachtig PBS door het geoogste darmsegment om de apicale zijde van het PI-stukje te reinigen en overtollig slijmvliesvocht en bacteriën te verwijderen.

Zodra de patch van de PI is gewassen, plaatst u deze in een putje van een 24-wells plaat en voegt u cyto effects- of cyto perm-oplossing toe. Incubeer het monster gedurende één uur op ijs. Zodra de patch van de PI is gefixeerd, laat u deze vijf minuten weken in één milliliter perm wash-buffer.

Herhaal deze wasstap drie keer. Plaats het monster vervolgens in één milliliter blokkeringsbuffer en incubeer dit gedurende 30 minuten op ijs. Voeg na de blokkeringsstap anti-muis GP2 monoklonaal antilichaam toe tot een eindconcentratie van 5 µg/mL en incubeer het monster een nacht bij 4 °C om de M-cellen te kleuren.

Was vervolgens het monster zoals eerder beschreven. Voeg een secundaire oplossing met geconjugeerd antilichaam toe en incubeer het monster gedurende twee uur op ijs in het donker. Zodra het monster is gekleurd, wordt het monster voorzichtig gewassen in PBS.

Plaats vervolgens drie of vier ronde dekglasplaatjes op een objectglas en bedel het pires-fragment in 200 µL van een 30% glyceroloplossing in PBS. Gebruik op het objectglas een DM IRE two confocale laserscanmicroscoop of een Delta vision restoration deconvolution-microscoop om het monster te observeren. In dit beeld is te zien dat groen GFP-gelabelde Salmonella typhimurium wordt omringd door GP twee, weergegeven in rood op het apicale plasmamembraan.

In deze geroteerde afbeelding zijn bacteriën zichtbaar binnen de subapicale cytoplasmatische blaasjes. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe de bacteriële transcytose door M-cellen kan worden beoordeeld met behulp van de geligeerde pys intestinale Lu-assay.