Name: Toepassing van een muis geligateerd Peyers Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Leer een verbeterde muis Peyer's patch intestinale lus assay om bacteriële opname door M-cellen te evalueren met fluorescentielabeling en confocale microscopie. Deze methode visualiseert transcytose voor mucosale immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag alle EIB-leden bedanken voor het ontwikkelen van deze techniek. Dit onderzoek werd mede ondersteund door Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek op prioritaire gebieden &quot;Membrane Traffic&quot; (HO), en de &quot;Matrix van infectieuze Phenomena&quot; (KH), Young Scientists (SF en KH), en Wetenschappelijk Onderzoek (HO ), en Wetenschappelijk Onderzoek over innovatieve Areas &quot;Intracellulaire Logistics&quot; (HO), van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.

1. Voorbereiding van de bacteriële cellen <ol><li> Streak glycerol gevulde fluorescerende bacteriën (zoals GFP uiten van S. Typhimurium) op LB-agar een plaat met 100 ug / ml ampicilline. </li><li> Cultuur een enkele kolonie van LB agar &#39;s nachts in 2 ml van de nieuwe LB-medium. </li><li> Voeg 0,5 ml van de bacteriecultuur tot 4,5 ml van de nieuwe LB medium en incubeer tot de optische dichtheid van 1.0 bij 600 nm is bereikt. </li><li> Oogst bacteriële cellen door centrifugeren (3000 xg, 5 min, 4 ° C). </li><li> Verwijder het supernatant en was tweemaal met 5,0 ml van de steriele fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). </li><li> Resuspendeer bacteriële pellet met 5 ml PBS en 50 ui het gebruik van de suspensie die ongeveer 10 7 kolonie vormende eenheid (CFU) als het inoculum. </li><li> In het geval van het gebruik van fluorescent gelabelde bacteriën werden de bacteriële cellen gelabeld met behulp van fluorescentie labeling reagens volgens standaard protocol. </li></ol> 2. Eennesthesia <ol><li> Vul een klein plastic doosje (10 x 10 x 5 cm) met 5% (v / v) verdampt isofluraan gemengd met lucht (debiet: 200 ml / min). </li><li> Verdoven acht-tot zestien-zwakke-oude mannelijke of vrouwelijke muizen in de doos. </li><li> Verplaats de muizen om een ​​autopsie tafel na de anesthesie. </li><li> Continu de muizen verdoven met 2% (v / v) verdampt isofluraan gemengd met lucht (debiet: 200 ml / min) (figuur 1). Dit is een terminal procedure. </li></ol> 3. Geligeerde Peyer&#39;s patch loop-test <ol><li> Incise 1 cm van de buikhuid en snijd de buik buikvlies van een verdoofde muis en nemen de dunne darm met de Peyer&#39;s patch. </li><li> Afbinden van de darm met naaigaren en zorg ervoor dat de bloedvaten te voorkomen. Let op: slechts binden de ene kant van de darm, en los laat de andere kant. </li><li> Injecteer 50 ul van bacteriële schorsing of PBS (controle) met een spuit in patch geligeerde Peyer&#39;s loop op de losse side van de darm (figuur 2). </li><li> Bind losse kant, en sluit de muis buik met een clip. </li><li> Na 1 uur, verwijder de geligeerde Peyer&#39;s patch loop, en euthanaseren van de muis door cervicale dislocatie. </li><li> Accijnzen Peyer&#39;s patch van patch geligeerde Peyer&#39;s loop. </li><li> Knipperen de apicale kant van de pleister Peyer&#39;s door 1ml PBS met het gebruik van injectiespuit bevestigd aan een naald om het overtollige vocht mucosale en bacteriën te verwijderen. Knipperen van de Peyer&#39;s patch een extra twee keer. </li></ol> 4. Hele berg vlekken en confocale microscopische analyse van patch Peyer&#39;s <ol><li> Fix Peyer&#39;s vlek in BD Cytofix / Cytoperm oplossing op ijs gedurende 1 uur. </li><li> Was Peyer&#39;s patch drie keer met 1 ml van de BD Perm / Wash buffer voor 5 min, en dan blok met 1 ml van het blokkeren van buffer die 0,1% (w / v) saponine, 0.2% (w / v) BSA in PBS gedurende 30 minuten op ijs. </li><li> Voeg 200-voudig verdunde anti-muis GP2 monoklonaal antilichaam (5 pg / ml) met het model op te sporenM-cellen. </li><li> Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was driemaal uit met 1 ml koud PBS, voeg vervolgens 200-voudig verdunde anti-rat IgG antilichaam geconjugeerd met DyLight549 (20 pg / ml) met het model. </li><li> Incubeer het monster op ijs gedurende 2 uur. </li><li> Was driemaal uit met 1 ml koud PBS, voeg dan 50-voudig verdund Alexa 633 geconjugeerd Phalloidin met het model aan F-actine te detecteren. </li><li> Incubeer op ijs gedurende 2 uur. </li><li> Wassen lichtjes met 1 ml koud PBS. Dan plaats drie tot vier stukken van ronde deksel glas op een dia, en insluiten van de exemplaren in een 30% oplossing van glycerol in PBS op de dia (figuur 3). </li><li> Let op exemplaren met een DM-IRE2 confocale laser scanning microscoop of een DeltaVision Restauratie deconvolutie microscoop. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Het specimen voorbeeld van een muis geligateerd Peyer&#39;s patch loop test met GFP-S. typhimurium werd waargenomen met een DeltaVision Restoration deconvolutie microscoop (figuur 4). GFP-S. typhimurium is transcytosed door GP2 + M cellen. Een muis Peyer&#39;s patch intestinale loop test kan identificeren van de soort van commensale of pathogene bacteriën die kunnen worden transcytosed door M-cellen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig1.jpg" /> Figuur 1. Anesthesie van de muizen onder verdampt isofluraan voorwaarde. Verdampt isofluraan werd geleverd door een anesthesie-dedicated apparaat (linkerkant). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig2.jpg" /> Figuur 2. Samenvatting van de patch afgebonden Peyer&#39;s intestinale loop test. De fluorescerende bacteriële suspensie werd geïnjecteerd door de spuit in patch geligeerde Peyer&#39;s lus op de losse zijde van de darm. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig3.jpg" /> <sTrong&gt; Figuur 3. berg van de exemplaren. De monsters werden ingebed in een 30% oplossing van glycerol in PBS op een speciale dia waarin een geperforeerde plastic plaat (1mm dik) werd door hechtmiddel gebonden op een glasplaatje. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig4.jpg" /> Figuur 4. Voorbeeld van een muis geligateerd Peyer&#39;s patch loop test met GFP-S. Typhimurium. GP2, dat wordt gerapporteerd als M cel-specifieke marker 5, werd gekleurd met anti-muis antilichaam GP2 (rood). Het monster werd waargenomen met een DeltaVision Restoration deconvolutie microscoop. GFP-expressie S. Typhimurium was co-gelokaliseerde met GP2 op het apicale plasmamembraan van M cel en in de subapical cytoplasmatische blaasjes (pijlpunten). Top, apicale bekijken. Onder-en zijkant, lateraal uitzicht. Schaal bar: 10 micrometer.

<ol><li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+IgA+synthesis%3A+regulation+of+front-line+body+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).</li>
<li>Hapfelmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+microbial+colonization+of+germ-free+mice+reveals+the+dynamics+of+IgA+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses.</a> Science. 328, 1705-1709 (2010).</li>
<li>Owen, R. L., Jones, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+specialization+within+human+Peyer%27s+patches%3A+an+ultrastructural+study+of+intestinal+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles.</a> Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).</li>
<li>Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues.</a> Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).</li>
<li>Hase, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+through+glycoprotein+2+of+FimH%28%2B%29+bacteria+by+M+cells+initiates+mucosal+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response.</a> Nature. 462, 226-230 (2009).</li>
<li>Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteropathogenicity+of+Escherichia+coli.+I.+Evaluation+of+mouse+intestinal+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops.</a> Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).</li>
<li>Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M+cell+transport+of+Vibrio+cholerae+from+the+intestinal+lumen+into+Peyer%27s+patches%3A+a+mechanism+for+antigen+sampling+and+for+microbial+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration.</a> J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).</li>
<li>Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M+cells--entryways+of+opportunity+for+enteropathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">M cells--entryways of opportunity for enteropathogens.</a> J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).</li>
<li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer%27s+patch+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).</li>
<li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium%2C+Listeria+monocytogenes%2C+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).</li>
<li>Nagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Peyer%27s+patches+in+the+induction+of+Helicobacter+pylori-induced+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

<html> De incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriële suspensie wordt meestal gedurende 1 uur om de bacteriële opname te observeren in de M-cellen. In het geval van 4 uur incubatie worden de bacteriën vaak gedetecteerd in de T cel zone van de plaques van Peyer. Omdat de verdampte isofluraan inhalatie-anesthesie kon houden muizen stabiel, de incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriesuspensie is uitbreidbaar naar de bacteriën die verhuizen naar T-cel-zone in patch Peyer te observeren. Het bela...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> LB agar Ampicilline- 100 </td><td> SIGMA </td><td> L5667 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 mono-Reactive Dye Pack </td><td> GE Healthcare </td><td> PA23001 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 carbonzuur, succinimidylester </td><td> Invitrogen </td><td> A10168 </td><td></td></tr><tr><td> Inhalatie-anesthesie apparaat </td><td> Shinano Seisakusho </td><td> SN-487 </td><td></td></tr><tr><td> Fixatie en Permeabilisatie Oplossing </td><td> BD </td><td> 554722 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-muis Glycoproteïne 2 antilichaam </td><td> MBL </td><td>D278-3 </td><td> 200-voudige verdunning (5μg/ml) </td></tr><tr><td> Geit anti-rat IgG, F (ab &#39;) 2 fragment specifiek </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 112-505-006 </td><td> 200-voudige verdunning (20μg/ml) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 633 Phalloidin </td><td> Molecular Probes </td><td> A22284 </td><td> 50-voudige verdunning </td></tr><tr><td> Confocale laser scanning microscoop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMIRE2 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Restauratie deconvolutie microscoop </td><td> Toegepaste Precision </td><td> DeltaVision Core </td><td></td></tr></tbody></table>

toepassing van een muis geligateerd peyer&#39;s patch intestinale loop assay om bacteriële opname evalueren door m-cellen

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

De binnenkant van onze darmen wordt bewoond met een enorm aantal van de commensale bacteriën. De mucosale oppervlak van het maag-darmkanaal is continu blootgesteld aan hen en af ​​en toe aan pathogenen. De darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) spelen een belangrijke rol voor de inductie van de mucosale immuunrespons op deze microben 1, 2. Tot inleiding van de mucosale immuunrespons, moet de mucosale antigenen worden vervoerd van de darm lumen over de epitheliale barrière in georganiseerde lymfoïde follikels zoals de plaques van Peyer. Dit antigeen transcytose wordt gemedieerd door gespecialiseerde epitheliale cellen M 3, 4. M-cellen zijn atypische epitheelcellen die actief fagocyteren macromoleculen en microben. In tegenstelling tot dendritische cellen (DC&#39;s) en macrofagen, die zich richten op antigenen te lysosomen voor degradatie, M cellen voornamelijk transcytose de geïnternaliseerde antigenen. Deze krachtige macromoleculaire transcytose door M cellen levert antigeen naar de onderliggende organisatie lymfoïde follikels eend wordt verondersteld essentieel te zijn voor het initiëren antigeen-specifieke mucosale immuunrespons. Echter, de moleculaire mechanismen ter bevordering van dit antigeen opname door M-cellen zijn grotendeels onbekend. We hebben eerder gemeld dat glycoproteïne 2 (GP2), in het bijzonder uitgedrukt op de apicale plasmamembraan van de M-cellen onder de enterocyten, dient als een transcytotic receptor voor een subset van commensale en pathogene enterobacteriën, waaronder Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium ), door het herkennen FimH, een component van type I pili op het bacteriële buitenste membraan 5. Hier presenteren we een methode voor de toepassing van de pleister een muis Peyer&#39;s intestinale loop-test voor bacteriële opname te evalueren door M-cellen. Deze methode is een verbeterde versie van de muis intestinale loop test eerder beschreven 6, 7. De verbeterde punten zijn als volgt: 1. Isofluraan werd gebruikt als een anestheticum. 2. Ongeveer 1 cm geligeerde darm-lus inclusiefING Peyer&#39;s patch werd opgericht. 3. Bacteriën door M cellen genomen werden fluorescent gelabeld door fluorescentie etikettering reagens of door overexpressie fluorescerend eiwit zoals groen fluorescerend eiwit (GFP). 4. M-cellen in de follikel-geassocieerde epitheel die Peyer&#39;s patch werden gedetecteerd door middel van volledige mount immunostainig met anti GP2 antilichaam. 5. Fluorescerende bacteriën transcytose door M-cellen werden waargenomen door confocale microscopische analyse. De muis Peyer&#39;s patch intestinale loop-test zou kunnen leveren is het antwoord wat voor soort commensale of pathogene bacteriën transcytosed door M-cellen, en kan ons naar het moleculaire mechanisme van hoe mucosale immuunsysteem te stimuleren door middel van M cellen te begrijpen leiden.

M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door M-cellen<em&gt; In vivo</em&gt;. Deze methode biedt een methode om de M-cel functie te begrijpen in het immuunsysteem.

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

De binnenkant van onze darm wordt bewoond door een enorm aantal commensale bacteriën. Het slijmvliesoppervlak van het maag-darmkanaal staat continu bloot aan ...

Het algemene doel van deze procedure is om de bacteriële opname door M-cellen in het mucosale immuunsysteem van de darm te onderzoeken. De eerste stap van deze procedure is het blootleggen en afbinden van de Peyerse platen van een geanestheseerde muis. Vervolgens worden fluorescente bacteriën in het afgebonden gebied geïnjecteerd.Een uur later worden de pyres-patches weggesneden. De cellen in het weefsel worden vervolgens gepermeabiliseerd en gekleurd voor de M-celmarker GP2. Tot slot worden de monsters geobserveerd met een confocale microscoop, waarbij bacteriën die door M-cellen worden getranscytozeerd gevisualiseerd kunnen worden.Naast het bieden van inzicht in de moleculaire basis van bacteriële transcytose door M-cellen, kan deze methode worden toegepast op andere systemen. Bijvoorbeeld, dit protocol zou kunnen worden gebruikt om de celpermeabiliteit in een ontstoken darm te bestuderen met behulp van cholera en microben. Gebruik een steriele glazen spreider om de fluorescerende bacteriën uit te strijken op een LB-agarplaat en incubeer de plaat bij 37 °C totdat individuele kolonies zichtbaar zijn. Neem één enkele kolonie van de vaste agar en inoculeer deze in 2 mL vers LB-medium.Kweek vervolgens de bacteriën overnacht op een schudder bij 37 °C. Zodra de startcultuur is gegroeid, brengt u 500 µL bacteriën over in 4,5 mL LB-medium en incubeert u deze nieuwe cultuur bij 37 °C gedurende drie tot vier uur, of totdat de optische dichtheid bij 600 nm één bereikt, wat aangeeft dat de bacteriële groei zich in de logfase bevindt. Centrifugeer de cultuur op dit punt bij 3000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C om de bacteriën te oogsten. Verwijder na centrifugatie het supernatant en was de pellet met vijf mL steriele PBS. Na het herhalen van de wasstap resuspendeert u de bacteriën in vijf mL PBS.Nadat de muis onder continue isofluoraan-anesthesie is geplaatst, opent u met steriele instrumenten aseptisch de buikholte van de muis. Begin met het blootleggen van de dunne darm en lokaliseer de Peyerse platen. Zodra de Peyerse platen zijn gevonden, gebruikt u steriel hechtgaren om de darm ongeveer vijf millimeter naast de plaat af te binden.Zorg ervoor dat u tijdens de procedure geen bloedvaten doorsnijdt. Zodra de darm is afgebonden, gebruikt u een spuit om 50 µL bacteriële suspensie van ongeveer 10⁷ CFU in de afgebonden pyres-patch-lus aan de losse zijde van de darm te injecteren. Bind vervolgens de andere zijde van de darm af met garen.Sluit de buikholte van de muis met een klem en houd de muis gedurende één uur onder anesthesie voordat deze wordt geëuthanaseerd. Om het pyres-stukje te oogsten, exciseert u dit stukje voorzichtig. Spoel vervolgens meerdere keren krachtig PBS door het geoogste darmsegment om de apicale zijde van het PI-stukje te reinigen en overtollig slijmvliesvocht en bacteriën te verwijderen.Zodra de patch van de PI is gewassen, plaatst u deze in een putje van een 24-wells plaat en voegt u cyto effects- of cyto perm-oplossing toe. Incubeer het monster gedurende één uur op ijs. Zodra de patch van de PI is gefixeerd, laat u deze vijf minuten weken in één milliliter perm wash-buffer.Herhaal deze wasstap drie keer. Plaats het monster vervolgens in één milliliter blokkeringsbuffer en incubeer dit gedurende 30 minuten op ijs. Voeg na de blokkeringsstap anti-muis GP2 monoklonaal antilichaam toe tot een eindconcentratie van 5 µg/mL en incubeer het monster een nacht bij 4 °C om de M-cellen te kleuren.Was vervolgens het monster zoals eerder beschreven. Voeg een secundaire oplossing met geconjugeerd antilichaam toe en incubeer het monster gedurende twee uur op ijs in het donker. Zodra het monster is gekleurd, wordt het monster voorzichtig gewassen in PBS.Plaats vervolgens drie of vier ronde dekglasplaatjes op een objectglas en bedel het pires-fragment in 200 µL van een 30% glyceroloplossing in PBS. Gebruik op het objectglas een DM IRE two confocale laserscanmicroscoop of een Delta vision restoration deconvolution-microscoop om het monster te observeren. In dit beeld is te zien dat groen GFP-gelabelde Salmonella typhimurium wordt omringd door GP twee, weergegeven in rood op het apicale plasmamembraan.In deze geroteerde afbeelding zijn bacteriën zichtbaar binnen de subapicale cytoplasmatische blaasjes. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe de bacteriële transcytose door M-cellen kan worden beoordeeld met behulp van de geligeerde pys intestinale Lu-assay.

application-mouse-ligated-peyers-patch-intestinal-loop-assay-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the generation of an ileal loop model to study intestinal permeability in a mouse model. This method provides a live model to understand the epithelial barrier function and consequent immune response.

Mouse Ileal Loop Model: A Surgical Model to Study Intestinal Permeability in the Mouse

In this video, we describe a surgical procedure to generate mouse proximal colon loop or pcLoop segment followed by intraluminal injection of fluorescent markers into the segment to study the intestinal epithelial permeability.

Generation of Mouse Proximal Colon Loop Model: A Surgical Procedure to Generate Proximal Colon Loop and Measure Intestinal Permeability by Detection of Fluorescent Markers in Serum Following Intraluminal Injection

Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.

Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Dit protocol beschrijft het gebruik van uitgesneden darmweefselpreparaten of 'darmzakken' als een ex vivo model van de darmwandfunctie. Dit model kan worden gebruikt om de integriteit van zowel de epitheliale barrière als de slijmvlieglaag op specifieke darmlocaties in diermodellen van spijsverteringsziekten te beoordelen.

Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Hier presenteren we een protocol voor het vaststellen van belangrijke eindpunten en proliferatieve markers van kleine intestinale letsel en compenserende hyperproliferatie met behulp van een model van chemotherapie-geïnduceerde mucositis. We demonstreren de detectie van prolifererende cellen met behulp van een celcyclus specifieke marker en met behulp van kleine intestinale gewicht, crypte diepte, en villus hoogte als eindpunten.

Belangrijke eindpunten en proliferatieve markers om kleine darm letsel en aanpassing te beoordelen met behulp van een muis model van chemotherapie-geïnduceerde Mucositis

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Hier beschrijven we een nauwkeurige methode voor het verzamelen van thoracale kanaallymfocyten en het observeren van de migratie van darm-tropenlymfocyten in de patches van rat Peyer gedurende 3 uur met behulp van time-lapse fotografie. Deze techniek kan verduidelijken hoe de dynamiek van lymfocyten wordt beïnvloed onder inflammatoire omstandigheden.

Microscopische observatie van lymfocytendynamiek in rat Peyer's patches

Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

We beschrijven een muizenmodel van postoperatieve ileus gegenereerd via darmmanipulatie. De gastro-intestinale transitfunctie, pathologische veranderingen en activering van immuuncellen werden 24 uur na de operatie beoordeeld.

Postoperatief Ileus muizenmodel

Deze studie presenteert een 3D-beeldvormingsmethode met behulp van darmweefsel en multi-fotonmicroscopie om uitgescheiden slijm te kwantificeren, waardoor nauwkeurige volumetrische analyse en visualisatie van slijmdynamiek mogelijk is als reactie op stimuli zoals carbamoylcholinechloride.

Driedimensionale kwantificering van darmslijm met behulp van beeldvorming van het hele weefsel

Leer een verbeterde muis Peyer's patch intestinale lus assay om bacteriële opname door M-cellen te evalueren met fluorescentielabeling en confocale microscopie. Deze methode visualiseert transcytose voor mucosale immunologisch onderzoek.

Toepassing van een muis geligateerd Peyer's Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

Meer video's verkennen