Name: Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Childrens Krukken Door Taqman een stap RT-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Leer een kosteneffectieve RT-PCR-methode voor detectie en genogroepidentificatie van Norovirus in kinderstools. Dit protocol verbetert de diagnostiek van virale gastro-enteritis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag naar het Nationaal Calicivirus Laboratorium Center for Disease Control and Prevention (CDC) bedanken voor de vriendelijke gift van een standaard en controle positieven voor de NOV, en de laboratoria van de School of Public Health aan de Johns Hopkins voor het leveren van de reagentia.

1. Kruk Monsters <ol><li> Kruk stalen worden bevroren om het RNA te behouden. Om een ​​10% fecale suspensie te maken, duurt ongeveer 0,1 g ontdooide stoelgangstaal en vul tot 1 ml met PBS. </li><li> Aliquot in 200 ul om te voorkomen dat Herhaald invriezen en ontdooien. Bewaar de monsters bij -70 ° C </li><li> Ontdooien en centrifugeer aliquots bij 4.000 g gedurende 10 minuten voor gebruik in extractie. </li></ol> 2. Voorbereiding van de silica deeltjes voor de extractie met Guanidine &amp; Silica <ol><li> Bij kamertemperatuur, schorten 30 g siliciumdioxide en compleet met dH 2 O 250 ml. </li><li> Na 24 uur van sedimentatie verwijderen 215 ml van de supernatant door afzuigen. Voeg dH 2 O tot 250 ml, en hang de silica pellet door schudden. </li><li> Na nog 24 uur, de bovenstaande vloeistof door afzuigen en de pH van de silica suspensie op pH 2,0 met zoutzuur (HCl). Aliquot de silica suspensie in glazen botrust is gekomen en autoclaaf. </li></ol> 3. Voorbereiding van L6 buffer voor Extractie met Guanidine &amp; Silica <ol><li> Bij KT, bereid door oplossen L6 buffer 60 g guanidiniumthiocyanaat (GuSCN) en 1,3 g Triton X-100 in 50 ml 0,1 M Tris-hydrochloride, pH 6,4 en 11 ml van een 0,2 M EDTA, pH 8,0 oplossing. </li></ol> 4. Voorbereiding van de L2-buffer voor Extractie met Guanidine &amp; Silica <ol><li> Bij KT, bereid door oplossen L2 buffer 180 g guanidiniumthiocyanaat (GuSCN) in 150 ml 0,1 M Tris-hydrochloride, pH 6.4. </li></ol> 5. Extractieprocedure <ol><li> In elke extractie een NoV positief stoelgangstaal, als positieve controle, en DEPC behandeld water, als negatieve controle, moeten worden opgenomen. </li><li> In een micro-centrifugebuis mengen volgende: 1 ml buffer L6, 20 pi van silicadeeltjes en voeg 200 pi van 10% faecale extract suspensie. Vortex kort en laat bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 6000 g gedurende 10 s en was de pellet met 1 ml buffer L2 tweemaal gevolgd door twee wasbeurten met 70% ethanol en eenmaal met aceton. Droog de pellet in een droge verwarmingsblok bij 56 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Hydraat het RNA in de silica pellet door toevoeging van 50 ul van RNAse-vrij dH 2 0. Voeg 1 ul van RNAsin, meng door de buis en incuberen bij 56 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Centrifugeer 3 min op volle snelheid, in een tafelblad centrifuge, en verzamelen 40 pl van de supernatant die de RNA. </li><li> Kwantificeer de geëxtraheerde RNA monsters met behulp van NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo wetenschappelijke). Dan slaan bij -70 ° C tot gebruik, tot 6 maanden. (Opmerking: Een betere manier om totaal RNA te behouden intact wordt omgezet in cDNA). </li></ol> 6. Alternatief extractie met behulp van het Handelsregister RNA QIAamp Viral RNA kit Volledige instructies zijn te vinden in het boekje provzijdig de QIAGEN kit. Kort de procedure als volgt: <ol><li> Pipetteer 560 pi buffer AVL met de drager RNA in een 1,5 ml buis en voeg 140 pi 10% kruk suspensie. Mix van puls-vortexen gedurende 15 sec. Incubeer bij RT gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 560 ul van ethanol (96-100%) aan het monster en meng door de puls-vortexen 15 sec, dan kort centrifugeren. </li><li> Breng 630 pi van deze oplossing een spin kolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifugeer 1 min bij 6000 g; dan spin kolom te plaatsen in een schone buis 2 mL. </li><li> Was de kolom met gebonden RNA met 500 pl van Buffer AW1 en centrifugeer bij 6.000 g gedurende 1 minuut. Plaats kolom in een schone 2 ml verzamelbuis. </li><li> Was de kolom met 500 pi buffer AW2 en centrifugeer op volle snelheid (20.000 g of 14.000 rpm) gedurende 3 minuten. </li><li> Plaats spin-kolom in een schoon 1,5 ml micro-centrifugebuis, voeg 40 ul DEPC-behandeld water en elueer het RNA op volle snelheid. Herhaal dit aance een laatste 80 pi RNA geëlueerd. </li><li> Kwantificeer de geëxtraheerde RNA monsters met behulp van NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo wetenschappelijke). Dan slaan bij -70 ° C tot gebruik, tot 6 maanden. (Opmerking: Een betere manier om totaal RNA te behouden intact wordt omgezet in cDNA). </li></ol> 7. Detectie van Norovirus in geëxtraheerde RNA door een stap Real Time RT-PCR met specifieke Taqman Probes Instrument StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems). Methodologie <ol><li> Veeg-en Reinig alle werkvlakken, pipetten en centrifuges met RNase AWAY om mogelijke RNase verontreiniging te verwijderen. </li><li> Pipetteer de NOV GI en GII screening mastermengsels volgens tabel 1. Primers en Taqman probes staan ​​in tabel 2. </li><li> Aliquot 10 pi van een passende master mix aan elke reageerbuis. </li><li> Voeg 5 pi zuivere onbekend monsterRNA, DEPC behandelde water als negatieve controle, of GI respectievelijk GII positieve controle RNA aan de overeenkomstige reactie putten. Alle monsters moet worden uitgevoerd in tweevoud. Positieve controles en normen met een concentratie van 300 ug / ul en 500 ug / ul respectievelijk werden verstrekt door de Nationale Calicivirus Laboratorium Center for Disease Control and Prevention (CDC). </li><li> Centrifugeer de reactie plaat bij 6.000 g gedurende 10 sec. </li><li> In het experiment eigenschappen scherm te definiëren en selecteer een soort van experiment voor de run. Zorg ervoor dat TaqMan reagentia worden weergegeven als de reagentia type, en dat de Pre-PCR lezen en versterking zijn geselecteerd. </li><li> Voer 15 pi reacties met het thermische profiel in tabel 3. </li><li> Analyseer de resultaten. </li></ol> 8. Genotypering van NoV GI en GII met behulp van conventionele RT-PCR en Sequencing (Het is niet in deze video, omdat het een gebruikte en meest gebruikte methode.) Instrument. Applied Biosystems StepOne en StepOnePlus Real Time PCR-systemen met de Quantitec sjabloon. Methodologie <ol><li> Voor genotypering worden de genogroup (GI of GII) van de monsters door de screening RT-PCR zoals hierboven beschreven. GI NoV RNA moet worden versterkt met het GI-genotypering master mix en de GII NoV RNA met de GII genotypering master mix. </li><li> Pipetteer de NOV GI en GII genotypering mastermengsels volgens tabel 4. Primers GI SKF / SKR en G2 SKF / SKR staan ​​vermeld in tabel 5. </li><li> Aliquot 45 pl van de juiste master mix met 0,2 ml reageerbuisjes. </li><li> Voeg 5 pi DEPC-behandeld water elke negatieve controle buis en 5 pi gescreende, NoV (GI en / of GII) positief RNA de bijbehorende reactiebuis. </li><li> Voer 50 pL reacties met het thermische profiel in tabel 6. </li><li> Stuur PCR-producten containing ten minste 100 ng / pl van de versterkte capside regio Company Macrogen voor de zuivering en sequencing. (9700 Grote Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 en $ 10 per monster per sequencing). </li></ol> 9. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 toont representatief resultaat van de Taqman een-staps RT-PCR assay gebruikt als RNA, geëxtraheerd uit ontlasting van diarree kinderen. De drempel cyclus (Ct) voor een positief monster werd vastgesteld op minder of gelijk aan Ct 37 voor gastro-intestinale en Ct 39 voor GII. De Ct-waarden voor de positieve controles bleken te zijn minder dan 27 en 18 van het ORF1-ORF2 knooppunt voor GI en GII, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 <table border="1"><tbody><tr><td> Master Mix </td><td> Laatste Conc </td><td> Volume (pi) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2,875 </td></tr><tr><td> Quantitect RT-PCR Master Mix </td><td> 1x </td><td> 6,250 </td></tr><tr><td> RT Mix </td><td> 1x </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 pM Cog R primer </td><td> 1 pM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 50 pM Cog F primer </td><td> 1uM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> Ring 10 uM probe </td><td> 1 pM </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10,00 </td></tr></tbody></table> * 0,250 pi van elke probe werd gebruikt voor testen GI, terwijl 0,125 pi van elke probe werd gebruikt voor testen GII. Tabel 1. Qiagen Quantitect master mix voor screening GI en GII (Trujillo et al., 2006). 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Geno-groep </td><td> Gebruiken </td><td> Sequentie (5 'naar 3') </td></tr><tr><td> Cog 1R </td><td> GI </td><td> Grondverf </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td> Cog 1F </td><td> GI </td><td> Grondverf </td><td> CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA </td></tr><tr><td> Cog 2R </td><td> GII </td><td> Grondverf </td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td></tr><tr><td> Cog 2F </td><td> GII </td><td> Grondverf </td><td> CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td> Ring 1A </td><td> GI </td><td> Sonde </td><td> FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring 1B </td><td> GI </td><td> Sonde </td><td> FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td> Sonde </td><td> FAM-TGG GAG GAT GGC CGC AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Primer en probe-oligonucleotiden gebruikt voor real-time kwantitatieve RT-PCR voor genogroepen I, II (Kageyama et al..,2003). 8 <table border="1"><tbody><tr><td> Stap </td><td> (° C) </td><td> Tijd (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA synthese </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart Taq polymerase activering </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td> 00:15 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 01:00 </td><td> 45X cycli </td></tr></tbody></table> Tafel3. Thermische profiel voor een stap Taqman Real-time RT-PCR (Trujillo et al., 2006). 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Master Mix </td><td> Laatste Conc </td><td> Volume (pi) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29,50 </td></tr><tr><td> 5x Qiagen RT-PCR-buffer </td><td> 1x </td><td> 10,00 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP Mix </td><td> 0,4 mM </td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> Enzymmengsel </td><td></td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> 40 U / ul RNAsin </td><td> 20 U / ul </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 uM SKF </td><td> 0,1 uM </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 uM SKR </td><td> 0,1 uM </td><td> 0,50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45,00 </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master Mix voor genotypering GI en GII. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Geno-groep </td><td> Gebruiken </td><td> Sequentie (5 'naar 3') </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> GI </td><td> Grondverf </td><td> 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT-GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> GI </td><td> Grondverf </td><td> 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td> Grondverf </td><td> 5'-CNT GGG GCG AGG ATC GCA A - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td> Grondverf </td><td> 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> Tabel 5. Primers gebruikt voor amplificatie van gebied C van capside Region (Kojima et al.. 2002) 5. <table border="1"><tbody><tr><td> Stap </td><td> (° C) </td><td> Tijd (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> cDNA synthese </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart Taq polymerase activering </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td> 00:030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 01:00 </td><td> 40X cycli </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 00:30 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10:00 </td><td> Gloeien </td></tr></tbody></table> Tabel 6. Thermische profiel voor Taqman One-Step RT-PCR.

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De economische eigen methode voor het isoleren van nucleïnezuur uit ontlasting wij gelijke resultaten verkregen als bij de commerciële QIAmp Viraal RNA kit Qiagen, samen met de TaqMan RT-PCR ontwikkeld in ons laboratorium kunnen detecteren breed NoV genotypen die behoren tot de GI en GII genogroup. Een recente publicatie van de regio C-protocol gemeld genotypering tarieven van 78% 6. Omdat de diversiteit van de hedendaagse NoV stammen is toegenomen in de voorgaande jaren zal het succes afhankelijk is van de m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Guanidine isothiocyanaat </td><td> Sigma-Adrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td> Tris HCL </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Silica </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> BDH Chemicals </td><td> 14530 </td><td></td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp viraal RNA Mini Kit (250) </td><td> QIAGEN </td><td> 52906 </td><td></td></tr><tr><td> KwantitatieveTec Probe RT-PCR kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 204443 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen One Step RT-PCR kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-remmer 2000 stuks </td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 unids / flacon </td></tr><tr><td> Non-Stick Rnae-free microfuge Tubes </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose 1000 </td><td> Invitrogen </td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

detectie en genogrouping van norovirussen van children&#39;s krukken door taqman een stap rt-pcr

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Norovirussen (NoVs) zijn de belangrijkste oorzaak van het uitbreken van sporadische acute gastro-enteritis over de hele wereld bij mensen van alle leeftijden. Zij zijn belangrijke oorzaak van ziekenhuisopnamen bij kinderen met volksgezondheidseffect vergelijkbaar met die van Rotavirus. NoVs zijn RNA virussen grote verscheidenheid genetische en er een continue weergave van nieuwe stammen. Vijf genogroepen worden erkend; GI en GII met hun vele genotypen en subtypen het meest belangrijk zijn voor menselijke besmetting. Echter, de diagnose van deze twee genotypes blijft problematisch, het uitstellen van diagnose en behandeling. 1, 2, 3 Voor RNA-extractie uit ontlasting specimens de meest gebruikte methode is de QIAmp Viraal RNA commerciële kit Qiagen. Deze methode worden de bindende eigenschappen van een silicagel membraan buffers die controle RNAses, voor een optimale binding van de RNA de kolom met de snelheid van Microspin. Deze methode is eenvoudig, snel en betrouwbaar en is carrIED in een paar stappen die worden beschreven in de beschrijving van de fabrikant. Norovirus is de tweede alleen voor rotavirus de meest voorkomende oorzaak van diarree. Norovirus diagnose moet beschikbaar zijn in alle onderzoeken naar pathogenese van diarree en bij uitbraken of individuele diarree gevallen. Momenteel echter norovirus diagnose slechts een beperkt aantal centra door het ontbreken van eenvoudige technieken voor de diagnose. Dit vertraagt ​​de diagnose en behandeling 1, 2, 3. Daarnaast is vanwege de kosten en gereguleerde transport van corrosieve buffers binnen en tussen landen het gebruik van deze gefabriceerde kits stelt logistieke problemen. Hierdoor, in dit protocol beschrijven we een alternatieve, economisch eigen methode is gebaseerd op de originele Boom et al.. Methode 4 waarin het nucleïnezuur bindingseigenschappen van silicadeeltjes gebruikt samen met de anti-nuclease eigenschappen guanidiniumthiocyanaat . <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Voor de detectie en genogrouping (GI en GII) van NoVs isolaten van ontlasting exemplaren, een aantal RT-PCR-protocollen gebruik te maken van verschillende doelwitten zijn ontwikkeld. De consensus is dat een RT-PCR met behulp van TaqMan chemie zou de beste moleculaire techniek voor de diagnose te zijn, want het combineert een hoge gevoeligheid, specificiteit en reproduceerbaarheid met een hoge doorvoersnelheid en gebruiksgemak. Hier beschrijven een assay gericht op de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied; de geconserveerde regio van de NoV genoom en dus vooral geschikt voor diagnose. Voor verdere genetische analyse een conventionele RT-PCR is dat het zeer variabele N-terminal-shell richt de belangrijkste capside eiwitten van de (Region C) met primers oorspronkelijk beschreven door Kojima et al.. 5 is beschreven. Sequencing van het PCR-product van de conventionele PCR maakt de differentiatie van genotypes die tot GI en GII genogroepen.

Een stap RT-PCR voor de detectie en genogroup identificatie van Norovirus isolaten van kinderen ontlasting dat primers en TaqMan probes specifiek voor de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied, de geconserveerde regio van de Norovirus genoom gebruikt beschreven. Een niet-commerciële, kosteneffectieve RNA-extractie methode wordt beschreven.

Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children&#39;s Krukken Door Taqman een stap RT-PCR

Norovirussen (NoV's) zijn de belangrijkste oorzaak van uitbraken van sporadische acute gastro-enteritis wereldwijd bij mensen van alle leeftijden. Ze vormen een belangrijke oorzaak van ...

Detectie van Neurovirus in geëxtraheerd RNA via one-step real-time R-T-P-C-R met specifieke TECHMAN-probes. Vandaag gaan we het hebben over het neurovirus. Dit vindt plaats in Lima, Peru, door een groep van de universiteit en ook de Johns Hopkins University.Het blijkt dat het norovirus waarschijnlijk een van de meest verwaarloosde oorzaken van diarree is. Onze groep heeft ontdekt dat het norovirus, wat betreft ziekenhuisopnames van kinderen vanwege diarree en het aantal incidenten van diarree in de populatie, slechts wordt overtroffen door het coronavirus. Waarom is het norovirus dan voorheen niet gediagnosticeerd?De reden hiervoor is dat het een RNA-virus is en we het niet kunnen kweken, waardoor er speciale moleculaire biologische methoden nodig zijn voor de diagnose. De methoden die we hiervoor gebruiken zijn RT-PCR, en deze video zal demonstreren hoe RT-PCR wordt gebruikt om het norovirus te diagnosticeren. In-house Ciag GUINE-methode boom et al. 1989: we gebruikten een in-house G guine ATE-methode voor de extractie van viraal RNA uit ontlastingmonsters.Deze methode is een alternatief voor de commerciële ca amp viral RNA kit. Beide methoden zijn gebaseerd op de nucleicazuurbindende eigenschappen van silicadeeltjes. Gecombineerd met de antinuclease-eigenschappen van G Guad Dium Bio NA bereiding van silicasuspensie voor RNA-extractie.Om de silicadeeltjes voor te bereiden, neemt u 30 gram siliciumdioxide, voegt u 250 milliliter gedemineraliseerd water toe en resuspendeert u het silicium door te schudden. Na 24 uur sedimentatie verwijdert u 215 milliliter van het supernatant en voegt u via zuiging opnieuw 250 milliliter gedemineraliseerd water toe, waarna het silicium wederom door schudden wordt geresuspendeerd. Na nog eens 24 uur verwijdert u het supernatant via zuiging en stelt u de pH van de silica-suspensie in op pH 2.0 met behulp van zoutzuur. Breng de silica-suspensie over in glazen flessen en autoclaveer deze voor extractie met guin en silica.We bekijken nu de extractie van viraal RNA met behulp van de silicadeeltjes die in een vorige stap zijn voorbereid. Bewaar bij minus 70 °C tot gebruik. Om een fecesсусpensie van 10% te maken, neemt u ongeveer 0,1 gram ontlasting en vult u dit aan met één milliliter PBS vóór de extractie.Vortex de monsters met een lagere belading gedurende vijf seconden en centrifugeer deze vervolgens bij 4.000 RPM gedurende 10 minuten. Voeg in elke reactie een neurovirus-positief ontlastingmonster toe als positieve controle en DEPC-behandeld water in een microcentrifugebuisje. Meng het volgende: één milliliter L6-buffer, 20 µL van de bereide silicadeeltjes en 200 µL fecale extract.Vortex kortstondig en laat de monsters 15 minuten op kamertemperatuur staan. Centrifugeer gedurende 15 seconden. Was de pellet vervolgens tweemaal met buffer L twee, gevolgd door twee wasbeurten met 70% ethanol en één wasbeurt met acid on.Droog de pellet in een droog warmteblok bij 56 °C gedurende vijf minuten. Hydrateer het RNA in de silica-pellet door 50 µL RNA-vrij gedestilleerd water toe te voegen. Voeg één µL RNA sin toe, vortex en laat dit 15 minuten bij 56 °C staan.Centrifugeer drie minuten op maximale snelheid en verzamel het supernatant dat het RNA bevat. Kwantificeer de monsters met de nanodrop-techniek en bewaar het geëxtraheerde RNA bij -70 °C. Gebruik voor de extractie van viraal RNA een commerciële kit.We gaan nu de RNA-extractie uit ontlasting demonstreren met behulp van de commercieel verkrijgbare kay amp viral RNA-kit. De kit bevat de volgende onderdelen: silica gel MinPin-kolom, buffer A-V-L, A-W1, A-W2, A-VE en carrier-RNA. Kort samengevat is de procedure als volgt.Meng een deel van de buffer A VL met carrier RNA en vortex. Pipetteer de oplossing in 1,5 milliliter buisjes bij 114 microliters fecesсусpensie en meng door kortstondig te vortexen. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters kortstondig (pulse centrifuge).Voeg ethanol toe aan de monsters en meng deze door 15 seconden vortexen. Centrifugeer vervolgens kort en breng de oplossing over naar de spincolumn in een 2 mL opvangbuisje. Centrifugeer.Plaats de spincolumn vervolgens in een nieuwe opvangbuis. Was de column met gebonden RNA met buffer A W 1 zonder carrier RNA en centrifugeer. Plaats de column in een schone opvangbuis van 2 mL en was de column met buffer.Plaats de kolom in een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer op maximale snelheid in een W2 centrifuge. Elueer het RNA met buffer AE en bewaar het virale RNA bij -70 °C tot gebruik. Detecteer norovirus in het geëxtraheerde RNA via een one-step real-time PCR met specifieke TaqMan-probes. Maak een mastermix voor genogroep I en genogroep II; houd de RT-enzymmix tijdens de assay op ijs. De kit bevat de volgende componenten: PCR-water, mastermix, 2X primers en probes voor GII.Primers en probe voor groep één voor Dina groep twee. En ten slotte, de enzym RT mix, vortex het reagens vóór gebruik, qPCR-water, de mastermix 2X, primers COG G1 forward en reverse en probe ring 1 A en 1 B voor UniGroup. Een mastermix en primers COG G2 voor VA reverse en probe.Meng de mastermix voor Theo Groep twee. Voeg tot slot het enzym artix toe aan beide INO-groep mastermixen. Vortex en voeg 10 µL van de betreffende mastermix toe aan de reactieputjes.Voeg in een andere cassette vijf microliters onverdund RNA, vijf microliters G1 en G2 positieve controle-RNA en vijf microliters negatieve controle toe aan de overeenkomstige reactiewielen. Centrifugeer gedurende 10 seconden bij 6.000 g. De software voor stap één toont de geavanceerde configuratie.En in het scherm met de experimenteigenschappen wordt het experiment geïdentificeerd als norovirus. Het experimenttype op het doelscherm is aanwezigheid of afwezigheid. Voer de naam in van het doelwit dat u in de PCR-reactieplaat wilt detecteren.Selecteer Gina, reporter fam van groep één en twee en quencher Tamara op het scherm voor monsters en replica's. Voer het aantal monsters en de positieve en negatieve controles in die op de reactieplaat zijn opgenomen en selecteer vervolgens welke monsters of doelrichtingen moeten worden ingesteld in de run-methode. Voer eerst een reverse transcriptie uit bij 50 °C voor de synthese van complementair DNA.Verhoog vervolgens de temperatuur naar 95 °C om een hot-start polymerase te activeren. Start de cycli met een initiële denaturatie bij 95 °C, gevolgd door een gecombineerde annealing- en amplificatiestap bij 60 °C. Herhaal deze cyclus vier tot vijf keer en keer terug naar de plaatopstelling.Klik op 'slaat sjabloon op' en sla het experiment op. Klik op 'start run'. Het scherm met de amplificatieplot stelt u in staat om de amplificatie van het monster te bekijken terwijl uw instrument tijdens een run bevroren gegevens verzamelt, evenals het contrast van de plot.Genormaliseerde duikfluorescentie en cyclusaantal. In de begincycli van de PCR is er weinig verandering in het fluorescentiesignaal. Dit bepaalt de basislijn.Een toename in fluorescentie ten opzichte van de basislijn duidt op de detectie van geaccumuleerd target. Er moet een vaste fluorescentiedrempel worden ingesteld boven de basislijn. De parameter CT (threshold cycle) is gedefinieerd als het fractionele cyclusnummer waarop de fluorescentie de vaste drempel overschrijdt.Het scherm met de amplificatieplot is nuttig voor het identificeren en onderzoeken van abnormale amplificatie, zoals verhoogde fluorescentie in putjes met negatieve controles en het ontbreken van detecteerbare fluorescentie bij een verwachte cyclus. De methode van de kit is betrouwbaar, maar vereist een enorme hoeveelheid tijd en middelen. Hier hebben we een even betrouwbare methode getoond die kosteneffectief is en gebruikmaakt van in het land readily beschikbare reagentia, waardoor de afhankelijkheid van in het buitenland gekochte materialen wordt omzeild, wat uiteindelijk zal leiden tot een toegankelijkere diagnose en snellere behandeling van de meest voorkomende virale oorzaken van gastro-enteritis bij kinderen. Hierbij is de economische in-house methode voor het isoleren van nucleïnezuren gebruikt, die vergelijkbare resultaten opleverde als die.verkregen met de commerciële kit van Kerogen, samen met de TAC MAN, R-T-P-C-R, die in ons laboratorium is ontwikkeld. We kunnen een breed scala aan neurovirusinfecties detecteren. De assay is nuttig gebleken voor routinediagnostiek, omdat het de verwerking van het product na amplificatie elimineert, waardoor de doorlooptijd van de assay wordt verkort.Naast diagnostiek kan het protocol ook worden gebruikt voor het verduidelijken van de epidemiologie van neurovirusinfecties, waardoor het nuttig is voor de beheersing van deze ziekte binnen de volksgezondheid.

detection-genogrouping-noroviruses-from-children-s-stools-taqman-one

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Een op macrofoam gebaseerde bemonsteringsmethodologie werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de detectie en kwantificering van norovirus op harde oppervlakken in het milieu.

Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie analyse gecombineerd met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR) is wijd verbeid gebruikt voor het meten van het niveau van de RNA-virusinfecties. Hier presenteren we een directe RT-qPCR assay, die niet een RNA-zuivering hoeft, ontwikkeld voor de kwantificering van verschillende RNA virussen, met inbegrip van dengue virus.

Meten van Dengue Virus RNA in het Supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen door Real-time kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

Dit protocol diagnose Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels met behulp van de RT-PCR methodes. De hele methode is beschreven van weefsel dissectie totaal RNA extractie, gevolgd door de cDNA synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve PCR dsDNA bindend een bindende fluorescerende kleurstof gebruiken.

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

Hier presenteren we twee protocollen, één voor het meten van de specifieke groeisnelheid en de andere voor het vermogen van de cel-bindende van rotavirus met behulp van de plaque assay en RT-qPCR. Deze protocollen zijn beschikbaar voor het bevestigen van de verschillen in fenotypen rotavirus stammen.

Tests voor de specifieke groeisnelheid en cel-bindend vermogen van Rotavirus

Het protocol maakt gebruik van een niet-invasieve ontlastingsbemonstering in combinatie met een kwantitatieve polymerasekettingreactie om een gemakkelijke en snelle diagnostische methode te bieden voor Helicobacter pylori-infectie en de resistentie tegen claritromycine en chinolonen.

Detectie van Helicobacter pylori-infectie en antibioticaresistentie via ontlasting Kwantitatieve polymerasekettingreactieanalyse

Kwantitatieve Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is een snelle en gevoelige methode om de expressie niveaus van verschillende microRNA (miRNA) moleculen te onderzoeken in tumor monsters. Met deze methode uitdrukking van honderden verschillende miRNA-moleculen kunnen worden versterkt, gekwantificeerd en geanalyseerd uit dezelfde cDNA sjabloon.

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

Leer een kosteneffectieve RT-PCR-methode voor detectie en genogroepidentificatie van Norovirus in kinderstools. Dit protocol verbetert de diagnostiek van virale gastro-enteritis.

Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children's Krukken Door Taqman een stap RT-PCR

Meer video's verkennen