Monitoring Equilibrium veranderingen in RNA structuur door 'Peroxidative' en 'Oxidatieve' hydroxyl radicaal Footprinting
October 17th, 2011
Dit protocol beschrijft hoe het kwantificeren van de Mg (II)-afhankelijke vorming van RNA tertiaire structuur door twee methoden van hydroxyl-radicaal voetafdruk.
Het algemene doel van het volgende experiment is om vast te stellen hoe RNA-moleculen zich vouwen met behulp van hydroxylradicaal-footprinting. Dit wordt bereikt door het RNA aan te merken, het te zuiveren en vooraf te vouwen in een gel, waardoor de conformationele integriteit van het RNA wordt gewaarborgd vóór magnesium-gemedieerde vouwing als volgende stap. De Fenton-reagentia worden gemengd om hydroxylradicalen te genereren, die vervolgens de RNA-ruggengraat kunnen splitsen op basis van zijn oplosbaarheid. Vervolgens worden de RNA-splitsingsproducten gescheiden door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese en gevisualiseerd door autoradiografie.
De bandintegralen worden gekwantificeerd door semi-automatische footprintinganalysesoftware. Het uiteindelijke doel is om vouwingsisotherms te genereren die de tertiaire structuurvorming van RNA weerspiegelen. Dit wordt bereikt door de genormaliseerde bandintegralen te schalen naar fractionele verzadiging.
De isotherms kunnen vervolgens worden aangepast aan de hill-vergelijking. Het grote voordeel van hydroxyfootprinting is dat u tertiaire structuurinformatie van RNA verkrijgt met behulp van goedkope chemicaliën vanwege de hogere activiteit in kleine hydroxyradicalen, die perfecte sondes zijn om onderscheid te maken tussen oplosbaar toegankelijke en begraven nucleotiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van RNA-structurele biologie.
Hoe bijvoorbeeld gebruiken ribosomen metaalionen om hun actieve bevestiging te bereiken? Hydroxylradicaal-footprinting kan worden gebruikt om de grondbeginselen van RNA-specificiteit en -herkenning te begrijpen. Naast het onthullen van informatie over de tertiaire structuur van RNA, kan deze methode worden gebruikt om de precieze eiwitbindingsplaatsen in RNA of DNA-moleculen te bepalen.
De belangrijkste uitdagingen van deze methode zijn het voorkomen van monsterdegradatie door ribonuclease en het optimaliseren van de ijzerconcentratie om de juiste hoeveelheid RNA-splitsing te verkrijgen. Ook kan de gedetailleerde analyse van de bandintervallen behoorlijk lastig zijn. Het belangrijkste voordeel van deze video is om het publiek te helpen de planningsfasen en de succesvolle uitvoering van het hydroxyradicaal-footprintingexperiment te begrijpen. Bereid voor het begin van dit protocol alle footprint-reagentia voor zoals beschreven in het geschreven protocol.
Bij deze video kan RNA worden geproduceerd DFOs vier gerelateerd en end-labeled zoals daar geschetst. Zuiver het radioactief gelabelde RNA met behulp van denaturerende gelelektroforese. Herstel het gezuiverde RNA door middel van twee opeenvolgende gelextracties met behulp van 0,3 molair natriumacetaat.
Bezink vervolgens het RNA door 0,5 milliliter van de waterige oplossing te mengen met één milliliter ethanol. Incubeer het mengsel gedurende één minuut op droog ijs Na het spinnen van het monster, gooi de supernatant weg. Was het RNA-pellet met 70% ethanol.
Verwijder de supernatant na aanvullende centrifugatie en droog het pellet in een vacuüm. Los vervolgens de gezuiverde P 32-gelabelde RNA-monsters op. Pipet 30 microliter van de RNA-oplossing in een nieuwe reactiebuis in 330 microliter van één keer reactiebuffer.
Bezink het RNA met ethanol en droog vervolgens het pellet in een vacuüm. Nadat het eenmaal is gedroogd, kan dit pellet worden gebruikt voor het genereren van de referentieladder zoals beschreven in de geschreven procedure om de resterende gebufferde RNA-oplossing te verwarmen bij 95 graden Celsius gedurende twee minuten. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 15 minuten en volg met een snelle spin om de condensaat weer op te lossen. Om het footprint-experiment te beginnen, stel 27 reactiebuizen in voor voldoende monsters om een 30-wel-elektroforese-gel te vullen.
Na het opnemen van de ladders en het gekloven controlemonster, bepaal de uiteindelijke magnesiumijzerconcentraties zodat ze gelijkmatig verdeeld zijn op een logaritmische schaal over meerdere ordes van grootte rond het titratiemiddelpunt. De bereiding van de magnesiumionen in één keer reactiebuffer wordt afzonderlijk in de tekst beschreven. Incubeer het RNA en de magnesiumionoplossingen gedurende vijf minuten bij 50 graden Celsius. Meng vervolgens 10 microliter van de RNA-oplossing met 90 microliter van de overeenkomstige hoeveelheid magnesiumijzeroplossing.
Om een eindvolume van 100 microliter te bereiken, incubeer elk mengsel gedurende 30 minuten bij 50 graden Celsius. Laat vervolgens de oplossingen gedurende één uur bij 25 graden Celsius gelijkwaardig worden terwijl RNA-vouwing optreedt. Terwijl ondertussen, onmiddellijk voordat de hydroxylradicaal-footprinting in reactie wordt gestart, bereid de fantoomreactiemix voor zoals beschreven in het geschreven protocol.
Bereid de peroxidatiereactie voor door twee microliter druppels ijzer-EDTA-natriumascorbinezuur en waterstofperoxide bovenaan in de reactiebuis met de RNA-oplossing te pipetten, zodat de druppels elkaar niet raken. Start de footprintingreactie door krachtig te mengen. Stop de reactie na 15 seconden door 300 microliter zuivere koude ethanol toe te voegen.
Draai de buisjes drie tot vijf keer om. Bezink, was en droog ten slotte het pellet zoals eerder uitgevoerd. Als alternatief voor de peroxidatiereactie zou de oxidatieve hydroxylreactie worden uitgevoerd door vijf microliter van de vers bereide Fenton-reactiemix toe te voegen aan de monsters. Incubeer de oxidatieve reactie gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius.
Voeg vervolgens 300 microliter zuivere koude ethanol toe om de reactie te doven en meng door de buisjes te draaien. Bezink nogmaals. Was en droog het pellet na voltooiing van de peroxidatieve of oxidatieve reactie.
Los de gedroogde RNA-pellets op in acht microliter gel-laadkleurstof twee. Bevestig dat het P 32-gelabelde RNA is geresuspendeerd met behulp van een geerteller. Bereid een denaturerende 8% polyacrylamide-sequencinggel voor volgens standaardprotocollen. Gebruik een 30-wel-kam om de monsters te laden, inclusief twee referenties en een gekloven controle.
Separeer de RNA-fragmenten gedurende twee en een half uur bij 60 tot 75 watt. Laat de gedroogd gel een nacht blootstellen aan een opslagfosforscherm. Scan de fosforscherm met een beeldvormingssyst
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft hoe de Mg(II)-afhankelijke vorming van RNA tertiaire structuur kan worden gekwantificeerd met behulp van hydroxyl radical footprinting. De methode omvat end labeling, gel zuivering en pre-folding van RNA om de conformationele integriteit te waarborgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Molecuulbiologie
- RNA structuuranalyse
Achtergrond
- Het begrijpen van RNA-vouwen is cruciaal voor het verduidelijken van zijn functionele rollen.
- Hydroxyl radical footprinting biedt inzichten in RNA tertiaire structuren.
- Mg(II) ionen spelen een belangrijke rol in RNA-vouwdynamica.
- Het kwantificeren van RNA-structuurvorming kan helpen bij de studie van verschillende biologische processen.
Doel van studie
- Om vast te stellen hoe RNA-moleculen vouwen met behulp van hydroxyl radical footprinting.
- Om vouwen-isotherms te genereren die de tertiaire structuurvorming van RNA weerspiegelen.
- Om de oplosmiddeltoegankelijkheid van RNA tijdens het vouwproces te analyseren.
Gebruikte methoden
- End labeling van RNA-moleculen.
- Gel zuivering om RNA te isoleren.
- Pre-folding van RNA om conformationele integriteit te behouden.
- Gebruik van Fenton reagentia om hydroxyl radicalen te genereren voor RNA splitsing.
Belangrijkste resultaten
- Scheiden van RNA splitsingsproducten via denaturerende polyacrylamide gel elektroforese.
- Visualisatie van RNA banden door middel van autoradiografie.
- Kwantificering van band integralen met behulp van semi-automatische footprinting analyse software.
- Generatie van vouwen-isotherms die RNA tertiaire structuurvorming weerspiegelen.
Conclusies
- Het protocol kwantificeert effectief RNA tertiaire structuurvorming.
- Hydroxyl radical footprinting is een waardevolle methode voor het bestuderen van RNA-vouwen.
- Resultaten kunnen het begrip van RNA's functionele rollen in biologische systemen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Hydroxyl radical footprinting enables biopharma R&D to probe RNA tertiary structure formation with single-nucleotide resolution, supporting target validation in RNA therapeutics. By quantifying Mg(II)-mediated folding isotherms, the method provides mechanistic de-risking for RNA-targeted small molecules and antisense oligonucleotides. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking structural changes to functional outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates RNA folding equilibria to clarify functional tertiary contacts relevant to target engagement.
- Operational Value: Uses inexpensive, accessible reagents (H2O2 or dissolved O2) for cost-effective structural screening.
- Predictive Value: Generates quantitative protection profiles that support hit-to-lead progression in RNA-targeting campaigns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces normalized band integrals suitable for high-resolution mapping of ligand-induced structural changes.
- Reproducibility: Single-hit kinetics ensure uniform nucleotide sampling, enabling reliable comparison across conditions.
- Scalability: Compatible with denaturing PAGE and phosphorimaging for medium-throughput fragment analysis.
Translational & Preclinical Research
- Mechanistic De-risking: Determines precise Mg(II) dependence of RNA folding, informing dose-response modeling for cellular efficacy.
- Translational Continuity: Folding isotherms derived from footprinting data can be correlated with cellular target modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Protection profile shifts help prioritize compounds that induce desired structural transitions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the RNA-targeted discovery continuum from target validation through lead optimization, providing structural feedback at each stage.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about RNA folding mechanisms and ion-dependent structural transitions.
- Screening: Delivers quantitative solvent accessibility readouts that guide compound selection.
- Analytics: Outputs protection curves fitted to Hill equation, yielding EC50 and cooperativity parameters for target modulation.
- Translational Research: Connects in vitro folding isotherms to cellular RNA functional states via mechanistic alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing RNA structural dynamics across multiple targets and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in RNA-ligand interactions by mapping protected nucleotides.
- Operational Value: Standardized workflow with dual oxidative/peroxidative protocols increases methodological flexibility.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions based on structural target engagement, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA-targeted candidates using structural fidelity as a decision criterion.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, radiolabeling, and hydroxyl radical safety protocols.
- Dependent on denaturing PAGE, phosphorimaging, and semi-automated quantification software (e.g., Safa).
- Necessitates RNase-free environments and careful titration of Fe2+/H2O2 to avoid over-degradation.
- Adaptation to alternative RNA models demands optimization of folding conditions and protection site identification.
- Practical limitation: Low-abundance RNAs may require extended exposure times, increasing background risk.
