Longitudinale Evaluatie van de muis Hind Limb botverlies na ruggenmergletsel met behulp van nieuwe, In vivo Methodologie

Deze procedure demonstreert een nieuwe methode die wordt gebruikt om het tijdsafhankelijke verlies van de botdichtheid van de achterpoten bij de muis na een dwarslaesie te detecteren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een spinale transectie uit te voeren bij een geanestheseerde muis onder steriele en door de ALAC goedgekeurde omstandigheden. Na een herstelperiode wordt het dier opnieuw geanestheseerd en worden röntgenfoto's gemaakt van de tibia en fibula van zowel de rechter- als de linkerachterpoot.

Dit wordt wekelijks uitgevoerd tot 40 dagen na het letsel. Vervolgens wordt een beeldanalyse van de röntgenfoto's uitgevoerd. De laatste stap is het uitvoeren van een post-mortem beoordeling van de botdichtheid van de weggesneden botten uit de achterpoten.

Uiteindelijk laten de resultaten zien hoe een dwarslaesie leidt tot een snelle en progressieve afname van de botdichtheid in de achterpoten van de muis. Deze nieuwe methode biedt een hoge ruimtelijke en temporele resolutie met lagere röntgendoses dan die worden gebruikt bij andere beeldvormingsmodaliteiten. Osteoporose is een levensbedreigende aandoening die mensen met een dwarslaesie treft.

Wat wij voorstellen is een nieuwe methode voor gebruik in dierstudies naar ruggenmergletsel, waarmee een onderzoeker over langere perioden longitudinaal het botverlies dat geassocieerd is met osteoporose kan volgen. Dit is om twee redenen belangrijk. Ten eerste biedt dit de mogelijkheid om de mechanismen te bestuderen die de ontwikkeling van osteoporose vormgeven.

Ten tweede biedt het ons een manier om nieuwe interventies te testen die zijn ontworpen om de ontwikkeling van osteoporose bij patiënten met een dwarslaesie te voorkomen of mogelijk terug te draaien. Hoewel deze methode inzicht kan geven in door dwarslaesie geïnduceerde osteoporose, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals ouderdomsgerelateerd botverlies bij postmenopauzale vrouwen, evenals andere trauma-geïnduceerde afnames in botdichtheid; ongebruik van ledematen als gevolg van immobilisatie na een fractuur of andere beschadigingen kan leiden tot aanzienlijk botverlies tijdens het genezingsproces. Het toepassen van longitudinale röntgenbeeldvorming met een lage dosis bij het gehele dier kan nieuwe wegen openen voor de ontwikkeling van therapieën die bedoeld zijn om deze problemen te minimaliseren of te voorkomen.

Voer de operatie voor ruggenmergletsel uit volgens de procedures van sander en in overeenstemming met de lokale richtlijnen van de commissie voor dierexperimenten. Begin vervolgens op dag 10 na de operatie aan het ruggenmerg en ga verder in intervallen van 10 dagen tot dag 40. Beoordeel de rechter- en linkerfemurs en tibiae van levende, geanestheseerde dieren met een transectie van het ruggenmerg en niet-gelette, leeftijd-gematchte controledieren door te scannen met het ivus Lumina XR-systeem; initialiseer vóór het scannen het Lumina XR-apparaat zodat de interne camera de operationele temperatuur van minus 90 °C kan bereiken.

Plaats een geanesthetiseerd dier op het platform in de Lumina xr. Plaats vervolgens een lens met hoge vergroting om focus op zowel de femur- als de tibiaregio's mogelijk te maken. Controleer of het subject correct is gepositioneerd in het gezichtsveld.

Open indien nodig de deur en positioneer het dier opnieuw. De juiste positionering van het dier wordt hier getoond. Zodra het dier correct is gepositioneerd, kan de röntgenfunctie worden uitgevoerd.

Maak een selectie uit de vervolgkeuzelijst voor energie die geschikt is voor dieren. Open vervolgens het bedieningspaneel. Activeer de röntgenfunctie door röntgen aan te vinken en neem het röntgenbeeld op.

Het gehele femur en de tibia moeten zichtbaar zijn, zoals hier getoond. Aangezien de software voor live-beelden standaard getransformeerde röntgenbeelden weergeeft, dient u ervoor te zorgen dat de onbewerkte röntgenbeelden worden weergegeven door naar het menu met correctiefiltertools te gaan en het selectievakje naast röntgenabsorptie uit te vinken. Onbewerkte beeldata worden automatisch op de harde schijf opgeslagen.

Er worden ook representatieve TIFF-bestanden opgeslagen. Na de beeldvorming wordt de muis teruggestuurd naar de thuiskooi en krijgt deze de gelegenheid om te herstellen onder toezicht van de onderzoeker. Het proces wordt vervolgens herhaald bij de volgende muis.

Open eerst de software door dubbel te klikken op het Living Image-pictogram in het dialoogvenster dat verschijnt. Selecteer de gewenste map en klik op ok. Laad een röntgenbeeld door op de knop bladeren te klikken.

De browser voor levende beelden toont de geselecteerde gegevens samen met de gebruikers-id. Labelinformatie en cameraconfiguratie-informatie. Om gegevens te openen, dubbelklikt u op de gegevensrij. Het beeld en het toolpalet worden weergegeven.

De open data is blauw gemarkeerd in de browser. Klik vervolgens op ROI-tools. Open in het toolpalet van de ROI-tools de vervolgkeuzelijst voor het type en selecteer meet-ROI.

Om de drie ROI's te laden die in dit experiment worden gebruikt, klikt u op het vierkante pictogram en laadt u de vierkanten. Meet met een liniaal de lengte van het femur en pas de lengte van de twee vierkanten aan zodat deze één achtste van de totale femurlengte bedragen. Pas de breedte van de vierkanten aan zodat deze één 24ste van de totale femurlengte bedragen.

Meet nu met de liniaal een achtste van de afstand vanaf het proximale uiteinde van het femur en plaats één rechthoek zodanig dat deze op die positie gecentreerd is. Verplaats de tweede rechthoek naar het distale uiteinde van het femur en plaats deze zodanig dat deze gecentreerd ligt binnen het trabeculaire gebied van de knie. Meet vervolgens de lengte van de tibia.

Pas de lengte van het kader aan tot één achtste van de totale tibialengte. Pas de breedte aan tot één dertigste van de totale tibialengte. Plaats tot slot het kader zodanig dat het gecentreerd is en zich op een afstand van één achtste van de totale tibialengte van het proximale uiteinde van de tibia bevindt, zoals hier getoond.

Klik vervolgens op het meeticoon; de ROI-intensiteitsmetingen verschijnen in het röntgenbeeld en de tabel met ROI-metingen wordt weergegeven. Exporteer deze tabel naar de gewenste locatie als een CSV-bestand. Hierdoor kan de tabel in Excel worden geopend.

Herhaal deze stap met alle opgeslagen afbeeldingen die geanalyseerd moeten worden. Voeg vervolgens alle gegevens samen in één Excel-werkblad. De statistische significantie wordt bepaald met een student t-toets met behulp van software zoals Microsoft Excel of Sigma Plot 11.0 software; indien gewenst kunnen de resultaten worden vergeleken met die verkregen uit postmortale analyse van de botdichtheid middels dual energy x-ray absorbometrie door gebruik te maken van standaardprotocollen voor deze methode.

Het relatieve botdensiteitsverlies in de tibia en het femur van een muis na een dwarslaesie, vergeleken met naïeve muizen, is detecteerbaar met de bovengenoemde methode. Deze figuur toont het botdensiteitsverlies in de proximale tibia op 10, 20, 30 en 40 dagen na de letselopletting. Vergeleken met leeftijdsgenoten uit de naïeve groep is er na slechts 10 dagen een significante afname van 12% in de botdensiteit van de tibia, met een botdensiteitsverlies tot 15% op 40 dagen.

Hier zien we het verlies van botdichtheid in het proximale femur na een dwarslaesie, 10, 20, 30 en 40 dagen na het letsel. In vergelijking met leeftijd-gematchte naïeve dieren werd 40 dagen na het letsel een afname van 7% in de botdichtheid van het proximale femur waargenomen. Deze grafiek toont het verlies van botdichtheid in het distale femur 10, 20, 30 en 40 dagen na het letsel.

In vergelijking met leeftijd-gematchte naïeve controles kon verlies van botdichtheid in het distale femur al vanaf 10 dagen na het letsel worden waargenomen, wat gedurende de rest van het experiment aanhield. Deze representatieve afbeelding van dual energy x-ray abor geometriegegevens toont de output van de botmineralisatie en de botmineraaldichtheid. De geëxciteerde femurs werden 40 dagen na het ruggenmergletsel geanalyseerd.

Om de effectiviteit van de in dit protocol gedemonstreerde methode te vergelijken met andere momenteel beschikbare methoden, toont deze figuur de dual-energy x-ray absorptie-geometrie analyse van de botmineralinhoud in grammen in het dijbeen van muizen met ruggenmergletsel. 40 dagen na de operatie vergeleken met leeftijd-gematchte naïeve muizen. Er werd een significant verlies van 12% van de botmineralinhoud waargenomen bij de muizen met ruggenmergletsel in vergelijking met de naïeve groep.

Hier zien we een dual-energy X-ray absorptiometrie-analyse van de botmineraaldichtheid in mg/cm² in het dijbeen van muizen met een dwarslaesie 40 dagen na het letsel, vergeleken met leeftijd-gematchte naïeve muizen. Het verlies aan botmineraaldichtheid veranderde niet significant, maar volgde een vergelijkbare trend als de botmineraalinhoud. Zodra dit onder de knie is, kan dit in 20 tot 30 minuten worden voltooid, maar onthoud dat het belangrijk is om de achterpoten correct te positioneren.

Na het bekijken van deze video heeft u een idee van hoe u een longitudinale beoordeling van de botdichtheid bij levende dieren kunt uitvoeren na een dwarslaesie met behulp van het Caliper Instruments Lumina XR-apparaat.