Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om de voorbereiding van biologische monsters voor sectioen en beeldvorming onder de mesrandscanner, of KESM, en de visualisatie van de resulterende beeldstapelgegevens te demonstreren. Dit wordt bereikt door eerst het weefsel te fixeren, te kleuren en in te bedden om het voor te bereiden op beeldvorming onder de KESM. De tweede stap van de procedure is het configureren van de KESM en het uitvoeren van sectioen en beeldvorming met behulp van de geautomatiseerde besturingssoftware.

De resulterende beelden worden vervolgens geregistreerd en bijgesneden. De laatste stap is het laden en verkennen van de datasets in een webgebaseerde atlas en 3D-visualisatiesoftware. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die hersenorganisatie op het niveau van het hele brein, neuronale en vasculaire organisatie met een resolutie van minder dan een micrometer laten zien.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande Mesos, zoals de seriële blokbasis scanelektronenmicroscopie, is dat deze veel grotere volumes kan afbeelden, zij het met een lagere resolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van connectomics en neurowetenschappen in het algemeen. Deze methode kan inzicht geven in de structurele organisatie van de hersenen en kan ook worden toegepast op andere orgaansystemen zoals de long en de nier.

Om deze procedure te beginnen, wordt de gedissecteerde muishersens in een glazen pot met Golgi Cox-oplossing geplaatst. Plaats de glazen pot in een lichtdichte doos bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 16 weken. Een aparte fixatiestap is niet nodig omdat de Golgi Cox-oplossing als fixeermiddel werkt.

Na 10 tot 16 weken, spoel de hersenen overnacht in gedeïoniseerd water in het donker op de volgende dag, dompel de gespoelde hersenen in 5% ammoniumhydroxide-oplossing in gedeïoniseerd water gedurende zeven tot 10 dagen in het donker bij kamertemperatuur. Na zeven tot 10 dagen, spoel de hersenen opnieuw in gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur gedurende vier uur. Droog vervolgens de hersenen uit door middel van een gegradueerde reeks ethylalcoholen, waarbij u deze in elke oplossing gedurende 24 uur laat staan, 50% ethanol en 70% ethanol bij vier graden Celsius en 85% ethanol.

Drie veranderingen van 95% ethanol en vier tot vijf veranderingen van 100% ethanol bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de uitgedroogde hersenen in aceton en voer drie tot vier veranderingen per dag uit. Hierna plaatst u de hersenen een nacht in de koelkast in elk van deze acetonmengsels met een aceton-tot-acetonverhouding van een tot twee, een tot een en twee tot een.

Plaats tenslotte de hersenen in 100% aceton in de koelkast, voer elke keer drie veranderingen uit gedurende een nacht. De behandelde hersenen worden vervolgens in 100% aceton ingebed en gedurende drie dagen verwarmd tot 60 graden Celsius. Ten slotte wordt de uitgeharde monsterblok op de metalen monsterschijf gemonteerd, met behulp van epoxy en de zijkanten van de blok worden indien nodig bijgesneden om deze procedure te beginnen.

Bevestig dat de muis diep verdoofd is en niet reageert op een teenprik. Perfundeer vervolgens de muis transcardiaal met fysiologisch zout op kamertemperatuur, gevolgd door koud 4% fysiologisch zout met paraformaldehyde. Perfundeer vervolgens de muis met een oplossing van 0,1% thi en kleurstof in gedeïoniseerd water.

Plaats daarna het lichaam gedurende 24 uur in een koelkast van vier graden Celsius. Na 24 uur, verwijder de hersenen uit de calver en plaats deze in een verse oplossing van 0,1% Thionine. Laat de hersenen gedurende zeven dagen bij vier graden Celsius staan.

Na zeven dagen, kleurt en droogt u de hersenen uit door middel van een gegradueerde reeks ethylalcoholen. Gedurende een periode van zes weken, drie tot vijf dagen in 50% ethanol, zeven tot 10 dagen in 70% ethanol ongeveer twee weken in 85 en 95% ethanol, en de rest van de tijd in 100% ethanol. Na drie veranderingen van aceton bij kamertemperatuur, worden de hersenen in erudite plastic in een oven van 60 graden Celsius ingebed.

Om de procedure voor het kleuren van het vasculaire netwerk met Indiase inkt te beginnen, bevestigt u door een gebrek aan teentrekreflex dat de muis diep verdoofd is. Perfundeer vervolgens de muis transcardiaal met fysiologisch zout op kamertemperatuur, gevolgd door fysiologisch zout op kamertemperatuur, 10% neutraal gebufferd formin. Hele lichaamsperfusie met fysiologisch zout en fixeermiddel is noodzakelijk om het bloed uit het cardiovasculaire systeem te verwijderen en de weefsels te fixeren.

Perfundeer vervolgens de muis met 3,0 cc onverdunde Indiase inkt. Met Indiase inkt is het noodzakelijk om het vaatstelsel van het cardiovasculaire systeem volledig te vullen. Na verwijdering uit de muis, worden de resulterende hersenen uitgedroogd door middel van een gegradueerde reeks ethylalcoholen en worden vervolgens in erudite plastic ingebed.

Volg het protocol dat eerder is getoond om de KESM voor beeldvorming in te stellen, zet de camera, verlichting en stage aan, verhoog het mes en objectief. Installeer vervolgens de monsterschijf. Verlaag vervolgens het objectief en mes.

Meet de monsterafmetingen. Maak vervolgens een configuratiebestand voor de KESM-stagecontroller. Twee toepassingen, verhoog het mes en het objectief van de KESM voorafgaand aan het initialiseren van de stage.

Start de KESM-stagecontroller twee en initialiseer de stage. Verlaag vervolgens het mes en objectief en zet de pomp aan. Focus het objectief en de camera door de focusknop op de optische trein te draaien en het beeldveld van de camera aan te passen ten opzichte van de mesrand.

Klik stap voor stap om de eerste paar stappen van de beeldvorming en sectioen te controleren. Klik vervolgens op gaan. Om beeldvorming en sectioen te starten voor beeldverwerking.

Voer de KESM-stackprocessor uit om verlichtingsartefacten te verwijderen en de achtergrondinten