Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de preparatie van biologische monsters voor doorsneden en beeldvorming met de knife edge scanning microscope, oftewel KESM, en de visualisatie van de resulterende image stack-gegevens. Dit wordt bereikt door het weefsel eerst te fixeren, te kleuren en in te bedden om het voor beeldvorming met de KESM voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het configureren van de KESM en het uitvoeren van de doorsneden en beeldvorming met behulp van de geautomatiseerde aansturingssoftware.

De resulterende beelden worden vervolgens ontruist, geregistreerd en bijgesneden. De laatste stap is het laden en verkennen van de datasets in een webgebaseerde atlas en 3D-visualisatiesoftware. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de organisatie van het gehele brein, neuronen en vaten op submicrometerresolutie tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande mesoscopische methoden, zoals seriële blok-base scanning elektronenmicroscopie, is dat er veel grotere volumes kunnen worden afgebeeld, zij het met een lagere resolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van connectomics en neurowetenschappen in het algemeen. Deze methode kan inzicht verschaffen in de structurele organisatie van de hersenen en kan ook worden toegepast op andere orgaansystemen, zoals de longen en de nieren.

Om deze procedure te starten, wordt de gedisseceerde muizenhersenen in een glazen pot met Golgi-Cox-oplossing geplaatst. Plaats de glazen pot in een lichtdichte doos bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 16 weken. Een aparte fixatiestap is niet nodig, aangezien de Golgi-Cox-oplossing als fixatief fungeert.

Spoel de hersenen na 10 tot 16 weken de volgende dag gedurende de nacht in het donker met gedeïoniseerd water, en dompel de gespoelde hersenen vervolgens zeven tot 10 dagen in het donker bij kamertemperatuur onder in een 5% ammoniumhydroxide-oplossing in gedeïoniseerd water. Spoel de hersenen na zeven tot 10 dagen opnieuw vier uur lang met gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur. Dehydrateer de hersenen vervolgens via een oplopende reeks ethylalcoholen, waarbij ze 24 uur in elke oplossing blijven: 50% ethanol en 70% ethanol bij vier graden Celsius en 85% ethanol.

Drie wissels van 95%ethanol en vier tot vijf wissels van 100%ethanol bij kamertemperatuur. Plaats daarna het gedehydrateerde brein in aceton en voer drie tot vier wissels uit van elk één dag. Plaats het brein vervolgens gedurende één nacht in de koelkast in elk van deze aite-acetonmengsels met een aite-acetonverhouding van één op twee, één op één en twee op één.

Plaats de hersenen tot slot in 100% aite in de koelkast en voer drie wisselingen uit, telkens gedurende één nacht. De behandelde hersenen worden vervolgens ingebed in 100% aite en drie dagen lang verhit tot 60 °C. Ten slotte wordt het gefixeerde monsterblok met behulp van epoxy op de metalen monsterring gemonteerd en worden de zijkanten van het blok naar behoefte bijgesneden om met deze procedure te beginnen.

Bevestig dat de muis diep geanestheseerd is en niet reageert op een kneepje in de teen. Perfuseer de muis vervolgens transcardiaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing op kamertemperatuur, gevolgd door koude 4% fosfaatgebufferde paraformaldehyde. Perfuseer de muis daarna met een oplossing van 0,1% thioflavine T in gedeïoniseerd water.

Plaats het lichaam daarna gedurende 24 uur in een koelkast op 4 °C. Verwijder na 24 uur de hersenen uit het kalf en plaats deze in een verse oplossing van 0,1% Thionine. Bewaar de hersenen zeven dagen lang bij 4 °C.

Na zeven dagen wordt het brein gefixeerd en gedehydrateerd via een graduele reeks ethylalcoholen. Over een periode van zes weken wordt dit als volgt uitgevoerd: drie tot vijf dagen in 50% ethanol, zeven tot 10 dagen in 70% ethanol, ongeveer twee weken elk in 85% en 95% ethanol, en de resterende tijd in 100% ethanol. Na drie wisselingen van aceton bij kamertemperatuur wordt het brein ingebed in erudite plastic in een oven van 60 °C.

Om te beginnen met de procedure voor het kleuren van het vaatstelsel met India-inkt, moet via de afwezigheid van de terugtrekkingsreflex van de tenen worden bevestigd dat de muis diep onder narcose is. Perfuseer de muis vervolgens transcordiaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing op kamertemperatuur, gevolgd door 10% neutraal gebufferde formaline op kamertemperatuur. Een volledige lichaamsperfusie met zoutoplossing en fixatief is noodzakelijk om het bloed uit het cardiovasculaire systeem te verwijderen en de weefsels te fixeren.

Perfunde vervolgens de muis met 3,0 ccs onverdunde India-inkt perfusievloeistof. India-inkt is noodzakelijk om de vasculatuur van het cardiovasculaire systeem volledig te vullen. Na verwijdering uit de muis wordt de resulterende hersenen gedehydrateerd via een reeks graduele ethylalcoholen en vervolgens ingebed in erudite plastic.

Volg het eerder getoonde protocol voor het instellen van de KESM voor beeldvorming, zet de camera, de verlichting en de tafel aan, en breng het mes en het objectief omhoog. Plaats vervolgens de specimenring. Breng daarna het objectief en het mes omlaag.

Meet de afmetingen van het specimen. Maak vervolgens een configuratiebestand voor de KESM-tafelcontroller. Til het mes en het objectief van de KESM eerst op voordat u de tafel initialiseert.

Start de KESM-tafelcontroller twee en initialiseer de tafel. Laat vervolgens het mes en het objectief zakken en schakel de pomp in. Stel het objectief en de camera scherp door aan de focusknop van de optische trein te draaien en het gezichtsveld van de camera ten opzichte van de mesrand aan te passen.

Klik stap-voor-stap om de eerste paar stappen van de beeldvorming en doorsneden te controleren. Klik vervolgens op 'go' om de beeldvorming en doorsneden voor de beeldverwerking te starten.

Voer de KESM-stackprocessor uit om verlichtingsartefacten te verwijderen en de achtergrondintensiteit in alle afbeeldingen te normaliseren. Herhaal dit voor alle submappen met gegevens. Om gegevens te visualiseren met behulp van de KESM-breinatlas, gaat u naar deze website en selecteert u de juiste atlas om naar een andere diepte te gaan.

Selecteer in het vervolgkeuzemenu hoe diep u bij elke stap wilt gaan en klik vervolgens op plus om de Z-diepte te vergroten of op minus om deze te verkleinen. Andere opties zijn inzoomen of navigeren met behulp van de KESM-hersenas. Gebruik het vervolgkeuzemenu om het overlay-nummer en het overlay-interval aan te passen om gegevens te visualiseren met VIS lab.

Start de applicatie en maak een nieuw project aan. Het project moet de volgende elementen bevatten: 'compose 3D from 2D files', 'set world matrix arithmetic one' en 'view 3D connected'. Stel in die volgorde de juiste parameters in zoals weergegeven in 'view 3D' terwijl u de rechtermuisknop ingedrukt houdt.

Beweeg de muis om de drempelwaarden aan te passen zodat de regio's kunnen worden bijgesneden. De oriëntatie is gewijzigd, de verlichting is gewijzigd, of de achtergrond is ingeschakeld of uitgeschakeld. Representatieve KESM-resultaten worden geïllustreerd door de volgende videoclips; eerst worden volumevisualisaties van KESM getoond, met hele hersenen India-inkt datastacks voor de vasculaire dataset, beginnend met een close-up van de vasculaire data met een breedte van ongeveer 100 microns.

Dit tweede fragment van KESM, met India-inktgegevens van het gehele brein, toont drie standaardweergaven van de vasculatuur van het volledige muizenbrein, ondergesampled uit gegevens met een hoge resolutie en een breedte van ongeveer 10 millimeter. De sagittale weergave, de coronale weergave en de horizontale weergave, evenals een fly-through van de coronale sectie. In dit videoclip worden KESM-Golgi-gegevens van het gehele muizenbrein geïllustreerd, waarin een fly-through langs de drie verschillende doorsnedevlakken wordt getoond, beginnend met het blokoverzicht, gevolgd door de sagittale weergave, de coronale weergave en de horizontale weergave.

Vervolgens worden de details van de KESM whole brain mouse GoGy-data getoond. Dit eerste videoclipje is van het cerebellum en de purkinjecellen. Dit tweede clipje toont de cortex en parametale cellen.

Ten slotte KESM. Gehele hersen-nle-gegevens worden geïllustreerd in deze twee videoclips. Eerst wordt een close-up van de NLE-gegevens getoond.

Dit tweede fragment toont drie standaardweergaven van de Nle-gegevens van het gehele muizenbrein, die zijn ondergesampled uit gegevens met een hoge resolutie. Er wordt ook een dwarsdoorsnede getoond voor een duidelijk zicht op de interne structuren na deze ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen om neuronale en vasculaire netwerken in het muizenbrein te verkennen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de monstervoorbereiding, beeldvorming en data-analyse voor de knife edge scanning microscope.