Name: Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer de voorbereiding van biologische specimens voor Knife-Edge Scanning Microscopie (KESM) met fixatie, kleuring en inbedding van weefsel. Deze methode visualiseert neuronale en vasculaire netwerken in muizenhersenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd gefinancierd door NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), de Texas Advanced Technology Program (ATP-# 000512 tot 0.146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A &amp; M Research Foundation, Department of Computer Science and Engineering aan de Texas A &amp; M University, en 3Scan. We willen graag Bernard Mesa (Micro Star Technologies) bedanken voor technisch advies en ondersteuning voor KESM instrumentatie. Grote delen van het ontwerp en de uitvoering van de KESM werd gedaan door Bruce H. McCormick, die stierf in 2007.

1. Prepareren: Golgi-Cox <ol><li> Dit protocol sluit nauw aan bij het ​​protocol van Mayerich et al.. 7. </li><li> De C57BL/6J muis is diep verdoofd met isofluraan inhalatie-anesthesie en vervolgens onthoofd. </li><li> De hersenen is verwijderd en geplaatst in een Golgi-Cox fixatie-oplossing (1% kalium chromaat, 1% kaliumdichromaat, en 1% kwikchloride in gedeïoniseerd water). </li><li> De hersenen zijn nog in de Golgi-Cox-oplossing in het donker, bij kamertemperatuur, voor 10 tot 16 weken. </li><li> De hersenen zijn gespoeld in gedemineraliseerd water 's nachts in het donker. </li><li> De hersenen gespoeld wordt ondergedompeld in een 5% ammoniumhydroxideoplossing in gedeïoniseerd water voor 7 tot 10 dagen in het donker bij kamertemperatuur. Deze lange voorbereidingstijd was om infiltratie van de hele hersenen zorgen, zodat de zwarte neerslag een kans om geheel vormen in het weefsel had. </li><li> De hersenen zijn weer gespoeld in gedemineraliseerd water bij kamertemperatuur gedurende 4 uur en tkip gedehydrateerd door middel van een gegradeerde reeks van ethyl alcohol: 50% en 70% in de koelkast (4 ° C), en 85%, 95% (3 veranderingen), en 100% (4 tot 5 veranderingen) in de kamertemperatuur. De hersenen zijn nog in elke oplossing voor 24 uur. </li><li> De gedroogde hersenen wordt vervolgens in aceton (3 tot 4 veranderingen, elk voor een dag), gevolgd door een Araldite-aceton-mengsel met Araldite-to-aceton-verhouding van 1:2, 1:1, 2:1, en tenslotte in 100% Araldite (3 verandert, elke keer 's nachts), in de koelkast (4 ° C). </li><li> Tenslotte wordt de behandelde hersenen zijn ingebed in 100% Araldite en verwarmd tot 60 ° C gedurende 3 dagen (cf. inbedding protocol in de Abbott en Sotelo 2). Indien monsters zijn ingebed in LR White dan de specimens worden overgedragen van de laatste 100% ethanol-oplossing door middel van drie veranderingen van LR White oplossing die elk bewaard nacht in de koelkast, dat is een standaard procedure, voorafgaand aan polymerisatie. Drie wijzigingen zijn doen om de volledige infiltratie te verzekeren. Het monster is tkip overgezet op vers LR White, dat is gepolymeriseerd in een ongeopende verpakking bij 60 ° C gedurende 24 uur, dat is de benodigde hoeveelheid tijd en temperatuur voor een goede polymerisatie. </li><li> Fig. 1 toont een Golgi-Cox-lood hersenen ingebed in Araldite. </li><li> De uitgeharde monster blok is vervolgens gemonteerd op de metalen ring met behulp van epoxy monster, en de zijkanten van het blok gesneden als nodig is (zie Fig. 2). </li></ol> 2. Prepareren: Nissl <ol><li> De muis is diep verdoofd met behulp van ketamine en xylazine (1,7 mg ketamine / 0,26 mg xylazine per 20 gram lichaamsgewicht) intraperitoneaal geïnjecteerd en vervolgens doorbloed transcardially met behulp van 50 ml van de ruimtetemperatuur fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4), gevolgd door 250 ml room temperatuur 10% neutraal gebufferde formaline (pH 7,4). en ten slotte met 3,0 cc van onverdunde Oost-Indische inkt. </li><li> Hele lichaam perfusie met zoutoplossing en fixatief is nodig om het bloed uit het cardiovasculaire systeem en voor de ti vast PUNTEN. Perfusie met Oost-Indische inkt is nodig om volledig te vullen het vaatstelsel van het cardiovasculaire systeem. </li><li> De resulterende hersenen wordt vervolgens gedehydrateerd door een reeks van gesorteerde ethyl alcohol (25% -100%) en vervolgens ingebed in Araldite plastic na het protocol in 1.8-1.9 hierboven. Als LR wit is de inbedding medium dan het protocol in 1.10 hierboven is gevolgd. </li></ol> 4. Prepareren: Generic soorten, generieke organen <ol><li> Voor de generieke geval is, kan fixatie worden gedaan met ofwel 10% neutraal gebufferde formaline of 4% paraformaldehyde. </li><li> Voor kleine hoeveelheden weefsel, is diffusie plaats van de perfusie aanbevolen voor fixatie en kleuring. In het geval van kleine organismen of organen, kunnen vlekken ook worden gedaan tijdens het droogproces. </li><li> De inbedding protocol is hetzelfde als hierboven, maar de tijden voor oplossing infiltratie kan worden verminderd voor organen of organismen die veel kleiner zijn dan hele hersenen van muizen. </li></ol>jove_title "&gt; 5. KESM setup en imaging <ol><li> Zet de pomp, zet op het podium, zet de camera, zet verlichting. </li><li> Verhogen mes en objectief. </li><li> Installeer exemplaar ring. </li><li> Meten monster dimensie en maakt een configuratiebestand voor de KESM Stage Controller2 toepassing. </li><li> Start KESM Stage Controller2 en initialiseren podium. </li><li> Onderste mes / doelstelling, zet pomp. </li><li> Focus objectief en de camera, door te draaien aan de focus knop op de optische trein en het aanpassen van de camera's gezichtsveld van ten opzichte van het mes rand. </li><li> Druk op [Start] om beeldvorming te starten. </li><li> Zie Fig. 3-8. Zie 9, 7 voor technische details. </li></ol> 6. Beeldverwerking en data voorbereiding <ol><li> Kopieer de KESM Stack Processor executable in de map Data onder het configuratiebestand map (00000, 00001, etc.). </li><li> Voer de KESM Stack Processor tot verlichting artefact te verwijderen en de achtergrond intensiteit normaliseren in allebeelden. Herhaal dit voor alle gegevens submappen. </li><li> Bereid meerschalige tegels uit de dataset en uploaden en het opzetten van de bestanden in de KESM Brain Atlas webserver. </li><li> Zie Fig. 9. </li></ol> 7. Data visualisatie en analyse <ol><li> Visualisatie met behulp van de KESM Brain Atlas. Ga naar <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> en selecteer de gewenste atlas. <ol><li> Navigeren zoals bij Google maps. </li><li> In-en uitzoomen als in Google maps. </li><li> Als u naar een andere diepte, kiest u hoe diep je moet gaan op elke stap van het pull-down menu en klik vervolgens op beide [+] of [-] te verhogen of te verlagen z diepte. </li><li> Stel de overlay nummer met behulp van het pull-down menu. </li><li> Stel de overlay interval met behulp van het pull-down menu. </li><li> Zie Fig. 11. </li></ol></li><li> Visualisatie met behulp van MeVisLab. <ol><li> De lancering MeVisLab. </li><li> Maak een nieuw project. </li><li> In de volgende, kunnen nieuwe modules worden creëren door Typing in de module naam in de opdracht vak. </li><li> Maak een module [Compose3Dfrom2DFiles], en ga naar de gewenste map. Geef bestand string in en klik op in [GetFileList]. Zorg ervoor dat de geselecteerde beelden kunnen passen in het geheugen. Klik op [Create3D] om volume te creëren. </li><li> Maak een module [SetWorldMatrix], en zet de "Scale" onder "Elementary transformaties" x, y, z om de juiste voxel grootte (0,6, 0,7, 1,0 voor een 10x 0.45NA doelstelling). Link [Compose3Dfrom2DFiles] op [SetWorldMatrix]. </li><li> Stel Matrix en transformeert onder "Matrix Composition" naar "Negeren", "Negeer", "Forward". </li><li> Maak een module [Arithmetic1] en stel de "Function" naar "Invert (Max-IMG)". Link [SetWorldMatrix] op [Arithmetic1]. </li><li> Maak een module [View3D] en sluit [Arithmetic1]. </li><li> In View3D, terwijl de rechter muisknop wordt ingedrukt, bewegen met de muis om de drempel aan te passen. U kunt bijsnijden regio's, wijzigen van de oriëntatie (beweeg muis terwijl de linker muisknop wordt ingedrukt), wijzigt u verlichting (volume rendering of MIP), aan / uit achtergrond, enz. </li><li> Zie Fig. 10. </li></ol></li></ol> 8. Representatieve resultaten: Hier presenteren we whole-brain gegevens en details. Vijgen. 12-15 tonen de hersenen als geheel India Ink, Golgi, en Nissl datasets 1, 4, 3. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vast, gekleurd, en embedded hersenen van muizen <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Embedded hersenen van muizen exemplaar gemonteerd op het monster ring. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. The Knife Edge Scanning Microscoop (KESM). Een foto van de KESM wordt getoond met de belangrijkste componenten gemerkt: (1) hogesnelheidslijn-scan camera, (2) microscoop doelstelling, (3) diamant mes montage en licht collimator, (4) SPEcimen tank (voor onderdompeling in water beeldvorming), (5) drie-assige nauwkeurige air-dragende fase (6) wit-licht microscoop verlichting, (7) water pomp (in de rug) voor de verwijdering van de doorsnede weefsel, (8) PC-server voor podium-controle en beeld acquisitie, (9) granieten basis, en (10) graniet brug. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Imaging principes van de KESM. Het principe van de werking van KESM wordt geïllustreerd. Het doel en het mes is op zijn plaats gehouden, terwijl het monster aangebracht op de positionering podium beweegt (pijl met vaste lijn) op de resolutie van 20 nm en rijsnelheid van 1-5, en krijgt schraapte tegen de diamant mes (5 mm breed voor het 10X objectief), het genereren van een dunne gedeelte stroomt over het mes (pijl met vaste lijn). Line-scan beeldvorming wordt gedaan bij het uiterste puntje van het mes. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. KESM camera en objectief scherpstellen controles. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. KESM mes montage en controles. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Initial richten via de observatie-poort. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8. KESM Stage Controller 2 applicatie (screenshot). <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 9"> Figuur 9. KESM stack processor applicatie (screenshot). <img alt="Figuur 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 10"> Figuur 10. MeVisLab applicatie (screenshot). <img alt="Figuur 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 11"> Figuur 11 KESM Brain Atlas:. Web-interface (screenshot). <img alt="Figuur 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 12"> Figuur 12. KESM de hersenen als geheel Oost-Indische inkt gegevens. Volume visualisaties van KESM gegevens stapels worden weergegeven voor de vasculaire data in te stellen. (A) Close-up van de vasculaire data. Breedte ~ 100 um. (Bd) Drie standaard uitzicht van de hele hersenen van muizen vasculatuur (subsampled van hoge-resolutie gegevens). Breedte ~ 10mm. <img alt="Figuur 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 13"> Figuur 13. KESM whole-brain muis Golgi gegevens. <img alt="Figuur 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 14"> Figuur 14. KESM Golgi data details. <img alt="Figuur 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 15"> Figuur 15. KESM whole-brain Nissl data. (A) Close-up van de Nissl gegevens. ~ 300 um 3. (Bd) Drie standaard uitzicht van de hele hersenen van muizen Nissl gegevens (subsampled van hoge-resolutie gegevens). Doorsnede getoond voor een duidelijk beeld van de interne structuren.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman is met 3Scan, een commercieel bedrijf dat produceert en verkoopt de KESM Technology (US patent # 6744572).

De KESM zorgt voor een submicrometer-level overzicht van grote hoeveelheden biologisch monster (~ 1 cm 3). Dit soort volume is voldoende om hele kleine dierlijke organen, zoals hersenen, longen, hart, nieren houden, etc. gescande beelden van dergelijke organen kunnen ongekende kwantitatieve informatie over de structurele organisatie van deze organen te bieden, en maken computationele modellering van verschillende functionele aspecten van deze organen, inclusief circuit en netwerk dynamiek, elektrische eigenschappen, vocht en luchtstroom dynamiek, en gespierd dynamiek. Het prepareren protocol en post-analyse protocol beschreven in dit artikel wordt verwacht dat zij buiten research groepen te helpen om gemakkelijker toegang tot de KESM en de daaruit voortvloeiende gegevens. De KESM operatie protocol zal helpen deze externe onderzoekers om de voordelen en beperkingen van deze unieke beeldvormingmodaliteit waarderen.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

specimen voorbereiding, imaging, en analyse protocollen voor knife-edge scanning microscopie

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Grote vooruitgang in high-throughput, hoge resolutie, 3D-microscopie technieken in staat hebben gesteld de aankoop van grote hoeveelheden gegevens op neuroanatomische submicrometer resolutie. Een van de eerste dergelijke instrumenten produceren de hersenen als geheel schaal data is het Knife-Edge Scanning Microscoop (KESM) 7, 5, 9, ontwikkeld en gehost in de auteurs &#39;lab. KESM is gebruikt om sectie en het imago hele muis hersenen op submicrometer resolutie, waaruit de ingewikkelde details van de neuronale netwerken (Golgi) 1, 4, 8, vasculaire netwerken (Oost-Indische inkt) 1, 4 en cellichaam distributie (Nissl) 3 . Het gebruik van KESM is niet beperkt tot de muis, noch de hersenen. We hebben met succes belicht de octopus hersenen 6, muis longen en hersenen van de rat. We zijn momenteel bezig met hele zebravis embryo&#39;s. Gegevens als deze kunnen veel bijdragen aan connectomics onderzoek 10, om de microcirculatie en hemodynamische onderzoek, en om stereology onderzoek door de bepalingenDing een exacte grond-waarheid. In dit artikel beschrijven we de pijplijn, waaronder prepareren (vaststelling, vlekken, en inbedding), KESM configuratie en installatie, snijden en beeldvorming met de KESM, beeldverwerking, data voorbereiding, en data-visualisatie en analyse. De nadruk zal liggen op prepareren en visualisatie / analyse van de verkregen KESM gegevens. We verwachten dat het gedetailleerd protocol in dit artikel om te helpen de toegang tot KESM en verhoging van het gebruik ervan te verbreden.

Het volledige proces van de hersenen prepareren op de seriële snijden beeldvorming met behulp van de Knife-Edge Scanning Microscope, om data visualisatie en analyse wordt beschreven. Deze techniek wordt momenteel gebruikt om de hersenen van muizen gegevens te verwerven, maar het is van toepassing op andere organen, andere soorten.

Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie

Belangrijke vooruitgang in high-throughput, hoge-resolutie 3D-microscopietechnieken heeft de acquisitie van grote hoeveelheden neuroanatomische data mogelijk gemaakt bij ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de preparatie van biologische monsters voor doorsneden en beeldvorming met de knife edge scanning microscope, oftewel KESM, en de visualisatie van de resulterende image stack-gegevens. Dit wordt bereikt door het weefsel eerst te fixeren, te kleuren en in te bedden om het voor beeldvorming met de KESM voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het configureren van de KESM en het uitvoeren van de doorsneden en beeldvorming met behulp van de geautomatiseerde aansturingssoftware.De resulterende beelden worden vervolgens ontruist, geregistreerd en bijgesneden. De laatste stap is het laden en verkennen van de datasets in een webgebaseerde atlas en 3D-visualisatiesoftware. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de organisatie van het gehele brein, neuronen en vaten op submicrometerresolutie tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande mesoscopische methoden, zoals seriële blok-base scanning elektronenmicroscopie, is dat er veel grotere volumes kunnen worden afgebeeld, zij het met een lagere resolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van connectomics en neurowetenschappen in het algemeen. Deze methode kan inzicht verschaffen in de structurele organisatie van de hersenen en kan ook worden toegepast op andere orgaansystemen, zoals de longen en de nieren.Om deze procedure te starten, wordt de gedisseceerde muizenhersenen in een glazen pot met Golgi-Cox-oplossing geplaatst. Plaats de glazen pot in een lichtdichte doos bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 16 weken. Een aparte fixatiestap is niet nodig, aangezien de Golgi-Cox-oplossing als fixatief fungeert.Spoel de hersenen na 10 tot 16 weken de volgende dag gedurende de nacht in het donker met gedeïoniseerd water, en dompel de gespoelde hersenen vervolgens zeven tot 10 dagen in het donker bij kamertemperatuur onder in een 5% ammoniumhydroxide-oplossing in gedeïoniseerd water. Spoel de hersenen na zeven tot 10 dagen opnieuw vier uur lang met gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur. Dehydrateer de hersenen vervolgens via een oplopende reeks ethylalcoholen, waarbij ze 24 uur in elke oplossing blijven: 50% ethanol en 70% ethanol bij vier graden Celsius en 85% ethanol.Drie wissels van 95%ethanol en vier tot vijf wissels van 100%ethanol bij kamertemperatuur. Plaats daarna het gedehydrateerde brein in aceton en voer drie tot vier wissels uit van elk één dag. Plaats het brein vervolgens gedurende één nacht in de koelkast in elk van deze aite-acetonmengsels met een aite-acetonverhouding van één op twee, één op één en twee op één.Plaats de hersenen tot slot in 100% aite in de koelkast en voer drie wisselingen uit, telkens gedurende één nacht. De behandelde hersenen worden vervolgens ingebed in 100% aite en drie dagen lang verhit tot 60 °C. Ten slotte wordt het gefixeerde monsterblok met behulp van epoxy op de metalen monsterring gemonteerd en worden de zijkanten van het blok naar behoefte bijgesneden om met deze procedure te beginnen.Bevestig dat de muis diep geanestheseerd is en niet reageert op een kneepje in de teen. Perfuseer de muis vervolgens transcardiaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing op kamertemperatuur, gevolgd door koude 4% fosfaatgebufferde paraformaldehyde. Perfuseer de muis daarna met een oplossing van 0,1% thioflavine T in gedeïoniseerd water.Plaats het lichaam daarna gedurende 24 uur in een koelkast op 4 °C. Verwijder na 24 uur de hersenen uit het kalf en plaats deze in een verse oplossing van 0,1% Thionine. Bewaar de hersenen zeven dagen lang bij 4 °C.Na zeven dagen wordt het brein gefixeerd en gedehydrateerd via een graduele reeks ethylalcoholen. Over een periode van zes weken wordt dit als volgt uitgevoerd: drie tot vijf dagen in 50% ethanol, zeven tot 10 dagen in 70% ethanol, ongeveer twee weken elk in 85% en 95% ethanol, en de resterende tijd in 100% ethanol. Na drie wisselingen van aceton bij kamertemperatuur wordt het brein ingebed in erudite plastic in een oven van 60 °C.Om te beginnen met de procedure voor het kleuren van het vaatstelsel met India-inkt, moet via de afwezigheid van de terugtrekkingsreflex van de tenen worden bevestigd dat de muis diep onder narcose is. Perfuseer de muis vervolgens transcordiaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing op kamertemperatuur, gevolgd door 10% neutraal gebufferde formaline op kamertemperatuur. Een volledige lichaamsperfusie met zoutoplossing en fixatief is noodzakelijk om het bloed uit het cardiovasculaire systeem te verwijderen en de weefsels te fixeren.Perfunde vervolgens de muis met 3,0 ccs onverdunde India-inkt perfusievloeistof. India-inkt is noodzakelijk om de vasculatuur van het cardiovasculaire systeem volledig te vullen. Na verwijdering uit de muis wordt de resulterende hersenen gedehydrateerd via een reeks graduele ethylalcoholen en vervolgens ingebed in erudite plastic.Volg het eerder getoonde protocol voor het instellen van de KESM voor beeldvorming, zet de camera, de verlichting en de tafel aan, en breng het mes en het objectief omhoog. Plaats vervolgens de specimenring. Breng daarna het objectief en het mes omlaag.Meet de afmetingen van het specimen. Maak vervolgens een configuratiebestand voor de KESM-tafelcontroller. Til het mes en het objectief van de KESM eerst op voordat u de tafel initialiseert.Start de KESM-tafelcontroller twee en initialiseer de tafel. Laat vervolgens het mes en het objectief zakken en schakel de pomp in. Stel het objectief en de camera scherp door aan de focusknop van de optische trein te draaien en het gezichtsveld van de camera ten opzichte van de mesrand aan te passen.Klik stap-voor-stap om de eerste paar stappen van de beeldvorming en doorsneden te controleren. Klik vervolgens op 'go' om de beeldvorming en doorsneden voor de beeldverwerking te starten.Voer de KESM-stackprocessor uit om verlichtingsartefacten te verwijderen en de achtergrondintensiteit in alle afbeeldingen te normaliseren. Herhaal dit voor alle submappen met gegevens. Om gegevens te visualiseren met behulp van de KESM-breinatlas, gaat u naar deze website en selecteert u de juiste atlas om naar een andere diepte te gaan.Selecteer in het vervolgkeuzemenu hoe diep u bij elke stap wilt gaan en klik vervolgens op plus om de Z-diepte te vergroten of op minus om deze te verkleinen. Andere opties zijn inzoomen of navigeren met behulp van de KESM-hersenas. Gebruik het vervolgkeuzemenu om het overlay-nummer en het overlay-interval aan te passen om gegevens te visualiseren met VIS lab.Start de applicatie en maak een nieuw project aan. Het project moet de volgende elementen bevatten: 'compose 3D from 2D files', 'set world matrix arithmetic one' en 'view 3D connected'. Stel in die volgorde de juiste parameters in zoals weergegeven in 'view 3D' terwijl u de rechtermuisknop ingedrukt houdt.Beweeg de muis om de drempelwaarden aan te passen zodat de regio's kunnen worden bijgesneden. De oriëntatie is gewijzigd, de verlichting is gewijzigd, of de achtergrond is ingeschakeld of uitgeschakeld. Representatieve KESM-resultaten worden geïllustreerd door de volgende videoclips; eerst worden volumevisualisaties van KESM getoond, met hele hersenen India-inkt datastacks voor de vasculaire dataset, beginnend met een close-up van de vasculaire data met een breedte van ongeveer 100 microns.Dit tweede fragment van KESM, met India-inktgegevens van het gehele brein, toont drie standaardweergaven van de vasculatuur van het volledige muizenbrein, ondergesampled uit gegevens met een hoge resolutie en een breedte van ongeveer 10 millimeter. De sagittale weergave, de coronale weergave en de horizontale weergave, evenals een fly-through van de coronale sectie. In dit videoclip worden KESM-Golgi-gegevens van het gehele muizenbrein geïllustreerd, waarin een fly-through langs de drie verschillende doorsnedevlakken wordt getoond, beginnend met het blokoverzicht, gevolgd door de sagittale weergave, de coronale weergave en de horizontale weergave.Vervolgens worden de details van de KESM whole brain mouse GoGy-data getoond. Dit eerste videoclipje is van het cerebellum en de purkinjecellen. Dit tweede clipje toont de cortex en parametale cellen.Ten slotte KESM. Gehele hersen-nle-gegevens worden geïllustreerd in deze twee videoclips. Eerst wordt een close-up van de NLE-gegevens getoond.Dit tweede fragment toont drie standaardweergaven van de Nle-gegevens van het gehele muizenbrein, die zijn ondergesampled uit gegevens met een hoge resolutie. Er wordt ook een dwarsdoorsnede getoond voor een duidelijk zicht op de interne structuren na deze ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen om neuronale en vasculaire netwerken in het muizenbrein te verkennen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de monstervoorbereiding, beeldvorming en data-analyse voor de knife edge scanning microscope.

specimen-preparation-imaging-analysis-protocols-for-knife-edge

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Mukherjee, K., et. al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation, imaging, and analysis of mouse brain tissue using a serial block-face scanning electron microscope (SBFSEM) to visualize mitochondrial ultrastructure, enabling precise mapping of their morphology and spatial distribution in axonal and dendritic neuronal compartments.

 Imaging of Neuronal Mitochondria Using a Serial Block-Face Scanning Electron Microscope

Hier wordt een methode getoond voor het visualiseren van de ultrastructuur van de extracellulaire matrix in gedecellulariseerde hartweefsels.

Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Er wordt een methode beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor correlatieve immunocytochemische studies van in epoxy ingebed weefsel van menselijke pathologie. We gebruiken commerciële antilichaamfragment-geconjugeerde QD's die worden gevisualiseerd door breedveldfluorescentielichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

Dit rapport beschrijft een monstervoorbereidingsprotocol en specifieke beeldvormingscondities voor het uitvoeren van schuifende transmissie-elektronentomografie van dikke biologische monsters.

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

Deze studie geeft betrouwbare en eenvoudige procedures voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van een micro-organisme zonder dure apparatuur in transmissie-elektronenmicroscopie.

Een methode voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van micro-organismen in transmissie-elektronenmicroscopie

Dit protocol is gericht op specifieke cellen in weefsels voor beeldvorming op de nanoschaal resolutie met behulp van een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). Groot aantal seriële secties uit biologisch materiaal hars-embedded zijn eerste beeld in een lichte Microscoop te identificeren van het doel, waarna in een hiërarchische wijze in de SEM.

Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Hier presenteren we gedetailleerde verwerkingsprotocollen voor Imaging delicate weefselmonsters met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Drie verschillende verwerkingsmethoden, namelijk hexamethyl disilazana (HMDS) chemisch drogen, eenvoudige lucht drogen en het drogen van kritische punten worden beschreven voor het bereiden van stijve eierschalen, embryo's in vroege ontwikkelingsstadia en schimmel culturen respectievelijk.

Verwerking van embryo-, eierschaal-en schimmel cultuur voor het scannen van elektronenmicroscopie

Dit protocol schetst een routinemethode voor het gebruik van seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM), een krachtige 3D-beeldvormingstechniek. Succesvolle toepassing van SBF-SEM hangt af van de juiste fixatie- en weefselkleuringstechnieken, evenals zorgvuldige overweging van beeldvormingsinstellingen. Dit protocol bevat praktische overwegingen voor het gehele proces.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopie (SBF-SEM) van biologische weefselmonsters

We introduceerden een nieuwe beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die onbevooroordeelde beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters op mesoschaal mogelijk maakt en naadloos kan worden geïntegreerd in de beeldvormingsworkflow van tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopie op hetzelfde monster.

Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping

Leer de voorbereiding van biologische specimens voor Knife-Edge Scanning Microscopie (KESM) met fixatie, kleuring en inbedding van weefsel. Deze methode visualiseert neuronale en vasculaire netwerken in muizenhersenen.

Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie

Meer video's verkennen