Inductie en Monitoring van Adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten

Ik ben Christine Beaton. Ik ben assistent-onderzoeker in het laboratorium van George Chen in de afdeling Fysiologie en Biofysica van de University of California in Irvine. In de komende dagen ga ik u de procedure laten zien voor het induceren en meten van adaptieve DTH bij Lewis-ratten.

Deze procedure duurt vijf dagen. Ik ga u laten zien hoe u antigeenspecifieke T-cellen activeert en hoe u deze twee dagen later initieel injecteert in naïeve ratten. Vervolgens zullen we de ratten twee dagen later in de oren uitdagen met het antigeen waarvoor deze T-cellen specifiek zijn. Een dag later zullen we de mate van ontsteking bij deze ratten meten.

Om serum te verkrijgen voor mijn weefselkweek, moet ik bloed afnemen. Hiervoor voer ik een hartpunctie uit. Ik plaats mijn linkerwijsvinger op de plexus solaris en reik met mijn naald door de ribben, tussen de ribben door naar het hart, en aspireer zoveel mogelijk bloed.

En bij één afname kunnen we, afhankelijk van de dag en de efficiëntie, tussen de 2 en 10 ml bloed van een specifieke rat verkrijgen. De reden waarom we serum in de kweek nodig hebben, is dat we cellen willen kweken die Lewis-ratcellen zijn in serum, wat syngene is. Dit zal dus Lewis-ratserum zijn.

Vervolgens breng ik het bloed over naar een buis, waarbij ik er zorgvuldig op let de naald uit de spuit te verwijderen om hemolyse te voorkomen, omdat ik het serum later wil gebruiken voor mijn weefselkweek. Nu ga ik de thymus verwijderen, aangezien het hart is gestopt met kloppen en de rat is overleden.

Eerst spuit ik met 70% ethanol om ervoor te zorgen dat er geen losse haren in het orgaan terechtkomen, aangezien ik het nodig heb voor weefselkweek. Voor de dissectie gebruik ik gesteriliseerde instrumenten. Vervolgens snijd ik eerst de huid weg.

Zodra ik de huid heb verwijderd, snijd ik voorzichtig aan weerszijden van de borstkas om er zeker van te zijn dat ik de thymus, die direct boven het hart ligt, niet beschadig. De thymus is hier te zien als een bleek, bijna wit orgaan dat zich net boven het hart bevindt. Ik verwijder het orgaan, waarbij ik erop let dat ik het volledige orgaan meeneem, maar ik ben niet al te voorzichtig met het schoon verwijderen, omdat ik het later in de zuurkast verder zal schoonmaken.

Vervolgens plaats ik het in een buisje met PBS dat ik heb aangevuld met penicilline en streptomycine. Om bacteriële groei te voorkomen, ga ik nu een enkelcellesuspensie van mijn cellen maken. Hiervoor gebruik ik een cellenfilter van 70 micron.

Natuurlijk zal ik uitsluitend steriele apparatuur gebruiken. Ik breng de thymus over naar een Petrischaal. En zoals u kunt zien, is deze niet erg schoon.

De thymus is het witachtige orgaan en er bevinden zich lymfeklieren en bloedstolsels op. Deze ga ik verwijderen. Daarnaast voeg ik ongeveer 10 ml PBS, aangevuld met antibiotica, toe aan mijn cell screener, zodat deze klaar is om de thymus te ontvangen zodra deze is gereinigd.

Om het schoon te maken, verwijder ik simpelweg alle verontreinigingen van mijn thymus. Nu mijn thymus bijna volledig schoon is, pak ik deze op met mijn pincet en knip ik hem met mijn schaar in kleine stukjes boven de celltrainer, waarna ik alle kleine stukjes thymus in de celltrainer plaats. Wanneer ik hiermee klaar ben, gebruik ik de zuiger van een 1 mL spuit, die uiteraard steriel is, om een single cell suspensie te maken door de stukjes thymus door de celltrainer te drukken.

De enkelcellen zullen vervolgens doorstromen en zich in mijn PBS aan de buitenkant van de celltrainer bevinden. Nu ik mijn cellen door de celltrainer heb gedrukt, is te zien dat de PBS niet meer helder is. Deze is gevuld met mijn enkelcel-suspensie, die ik zal overbrengen naar een 50 ml buis die ik op ijs bewaar.

Vervolgens herhaal ik de procedure een paar keer door de celzeef opnieuw te vullen met PBS, harder op de zuiger van de spuit te drukken en het vloeistof naar mijn buis over te brengen, totdat ik tussen de 30 en 40 ml PBS in mijn buis heb. Zo ziet de celzeef eruit wanneer ik klaar ben. Nu ik alle cellen heb verzameld, zal ik deze ongeveer 10 minuten centrifugeren bij 1200 RPM.

Hier zijn de cellen die ik uit de centrifuge heb gehaald; de pellet is vrij groot, wat verwacht wordt aangezien ik nu het supernatant verwijder. De pellet blijft uiteraard onderin de buis. Om het resuspenderen te vergemakkelijken, ga ik de pellet opbreken terwijl deze nog bijna droog is.

Daarna tik ik er stevig met mijn vinger tegenaan tot u ziet dat het PT volledig is gedisaggregeerd en we terug zijn naar een enkelcel-suspensie. Ik ga mijn cellen nu resuspenderen in mijn steriele PBS en ik voeg 5 mL PBS per timer toe. Aangezien ik slechts één timer heb, voeg ik 5 mL toe.

En dit is de suspensie die ik naar de irrigator breng om te beginnen. De irrigatietemperatuur die ik gebruik is 30 °C om ervoor te zorgen dat de cellen nog leven, maar binnen enkele uren zullen afsterven. Zo kunnen ze het antigeen nog wel verwerken, maar zullen ze mijn cultuur niet contamineren.

Als we kijken naar de T-cellen die we willen activeren, zien we dat ze er helemaal niet gezond uitzien. Sommige zijn al begonnen af te sterven. Ze hebben vreemde vormen en zijn niet meer terug te vinden.

Deze cellen zijn nu klaar om geactiveerd te worden. Na de incubatieperiode zijn ze eigenlijk wanhopig op zoek naar antigenen. Het is uiterst belangrijk om ze snel te wassen, omdat sommige cellen zijn afgestorven en toxische verbindingen in de oplossing zullen vrijgeven.

Vervolgens vul ik de buis aan tot 50 ml met mijn PBS-oplossing. Tegelijkertijd zal ik de T-cellen die wachten op stimulatie overbrengen. Ik breng ze over naar een andere buis van 50 ml, zodat ik beide buizen tegelijkertijd kan centrifugeren.

Hier is het bloed dat ik enige tijd geleden heb afgenomen; ik heb het 10 minuten op 37 °C laten staan en daarna op ijs geplaatst. Zoals u kunt zien, is het volledig gestold. Ik moet nu het serum uit dit bloed winnen.

Om het in de eerste stap te verzamelen, zal ik met een steriele Pasteurpipet het stolsel losmaken van de buis en alle vloeistof opnemen die het serum bevat waarin ik geïnteresseerd ben, samen met enkele cellen die niet in het stolsel waren gevangen. Deze vloeistof zal ik overbrengen naar een andere buis. Tijdens de overdracht komen er soms kleine stukjes stolsel mee, maar dat is geen probleem, omdat ik de cellen die nog in die vloeistof zitten sowieso moet verwijderen.

Ik ga nu mijn kleine buisje met de vloeistof centrigeren. Dit verwijdert de cellen en eventuele stukjes stolsel; ik spin nu het vloeibare deel van het bloed om de cellen van het serum te scheiden. Centrifugeren gedurende twee minuten is voldoende.

Nu is het serum gecentrifugeerd, dus ga ik het serum van de cellen scheiden. Dit is geen perfect voorbeeld, want het serum zou gelig moeten zijn en dit exemplaar is roodachtig, wat aantoont dat er hemolyse is opgetreden. Dit is dus niet helemaal optimaal, maar ik ga u sowieso laten zien hoe ik het filter.

Ik gebruik een spuit met een filter van 0,2 micron en ik ga mijn serum filteren om er zeker van te zijn dat het steriel is. Maar aangezien er hemolyse is opgetreden, zal ik deze batch serum niet gebruiken voor mijn stimulatie. Ik zal Louis-rattenserum gebruiken dat was ingevroren tijdens een vorig experiment.

Hier zijn de PT's van de T-cellen links en de antigeenpresenterende cellen rechts. Ik ga nu het supernatant uit beide buisjes verwijderen. En zoals eerder, ga ik de pellets opbreken door er met mijn vinger tegenaan te tikken om er zeker van te zijn dat de cellen weer in een enkelcellesuspensie zijn.

En dat ga ik doen voor beide sets cellen, de T-cellen en de antigeen-presenterende cellen. Daarna ga ik ze resuspenderen en tellen. Vervolgens meng ik 3 miljoen van de T-cellen met 150 miljoen van de antigeen-presenterende cellen, en breng ik deze over in petrischalen met een diameter van 10 centimeter.

En in een totaal volume van 10 ml zijn hier twee buisjes serum. Rechts is degene die ik vandaag heb klaargemaakt; deze is roodachtig vanwege hemolyse, terwijl links een buisje staat dat ik enkele dagen geleden heb klaargemaakt en bevroren heb bewaard. Deze is gelig, vertoont geen hemolyse en is veel beter.

Dat is de variant die ik vandaag voor mijn weefselkweek ga gebruiken. Ik heb voldoende cellen om zes Petrischalen te stimuleren, dus ik ga 30 ml medium toevoegen aan de antigeenpresenterende cellen en 30 ml van hetzelfde medium aan de T-cellen. Vervolgens voeg ik in de buis met antigeenpresenterende cellen het antigeen toe, in dit geval albumine.

Mijn voorraadoplossing heeft een concentratie van 1 mg/ml en ik wil een eindconcentratie van 10 µg/ml in mijn petrischalen. Aan de T-cellen ga ik Louis-ratenserum toevoegen. Ik voeg voldoende toe zodat er uiteindelijk 1% ratenserum in mijn petrischalen aanwezig is.

Ik ga mijn suspensie van antigeenpresenterende cellen homogeniseren en vervolgens vijf ml van deze celsuspensie overbrengen naar elk van mijn Petrischalen. Wanneer u uw suspensie van antigeenpresenterende cellen uitneemt, zult u merken dat er altijd een klein klompje vet en fibreus weefsel aanwezig is. Dit is volkomen normaal.

Dit komt altijd voor tijdens onze voorbereidingen van de site. Er is geen reden voor bezorgdheid. Daarom verwijder ik het, indien mogelijk, of laat ik het anders gewoon in de Petrischaal zitten.

Het heeft geen enkele invloed op mijn celcultuur. Zodra ik alle APC's in mijn petrischalen heb overgebracht, ga ik de procedure herhalen met de T-cel. Ik ga dus vijf ml T-cel-suspensie in elk van die petrischalen doen.

Nu bevinden al mijn cellen zich in de petrischalen en het is zeer belangrijk om ze goed te mengen, zodat alle T-cellen de kans krijgen om in contact te komen met een antigeenpresenterende cel. Hiervoor stapel ik mijn petrischalen op en meng ik ze door onzichtbare achten te beschrijven met de petrischalen. Dit doe ik een paar keer om er zeker van te zijn dat alle cellen goed gemengd zijn.

Zodra ik klaar ben met al het mengen, plaats ik deze schalen in een incubator in een vochtige atmosfeer bij 37 °C en 5% CO2. Ze zijn 48 uur in de incubator gebleven. Het medium is licht van kleur veranderd, het is nu meer oranje en de cellen zijn goed geactiveerd.

Ik controleer alle petrischalen één voor één onder de microscoop. De zeer grote cellen zijn de geactiveerde T-cellen en de zeer kleine cellen zijn de dode antigeenpresenterende cellen. De stimulatie is zeer goed, want te zien is dat de T-cellen enorm zijn.

En als ik de petrischaal een beetje beweeg, oeps, zie je hier aan de linkerkant, nu in het centrum, een grote klomp cellen; dit zijn actief delende cellen. Ik ga nu alle cellen in centrifugebuisjes doen om ze te kunnen centrifugeren, tellen en vervolgens 10 miljoen cellen in ratten te injecteren. De stimulatie was zo goed dat ik niet al die T-cellen nodig heb om in één rat te injecteren.

Wat ik nu ga doen, is dat ik alleen cellen van twee petrischalen gebruik. Ik ga deze centrifugeren om 10 miljoen cellen te injecteren bij de rat; de overgebleven cellen zal ik in kweek plaatsen om ze over een paar dagen te invriezen.

Het kweekmedium is het standaard T-celkweekmedium waaraan T-celgroeifactor en paardenserum zijn toegevoegd. De T-cellen zijn niet-adherent, dus ik hoef niet veel te doen. Ik zorg er alleen voor dat de meeste cellen samen met het medium worden overgebracht.

En aan het einde zal ik alle petri-schalen spoelen met nieuw medium om er zeker van te zijn dat ik alle cellen heb verzameld. 10 mL medium, hetzelfde als ik voor de stimulatie heb gebruikt, en ik denk dat voor elke petri-schaal de T-cellen al aanwezig waren toen ik de eerste keer het medium afnam. Normaal gesproken komt het medium al uit de schaal, het is niet absoluut noodzakelijk, maar aangezien deze cellen kostbaar zijn, wil ik er geen verliezen.

Ik ga ze nu centrifugeren. Daarmee worden sommige dode cellen verwijderd en kan ik grotendeels met die cellen beginnen. Vervolgens wil ik ze vers medium geven.

Ik ga deze vervolgens opnieuw centrifugeren op 1.500 RPM gedurende ongeveer acht minuten. De rem laat ik aanstaan, omdat ik alleen de cellen pelletiseer. Daarna schenken we beide buizen af, waarbij ik in de ene kleine pellets heb.

Dit is afkomstig van de twee Petrischalen. En hier is het pellet van de vier Petrischalen. De pellets zijn groot omdat ze niet alleen de geactiveerde T-cellen bevatten, maar ook de data-antigeenpresenterende cellen.

Ik ga nu het supernatant afgieten en bij de cellen die ik ga injecteren voeg ik 1 mL medium toe, wat ik zal gebruiken voor de injectie. De overige cellen zal ik suspenderen in 100 µL kweekmedium met T-celgroeifactor en paardenserum. Dit zijn de cellen die ik ga injecteren.

En voor deze cellen ga ik ze in twee kolfjes van 50 ml elk plaatsen. In elk kolfje voeg ik 10% T-celgroeifactor toe, op basis van botmerg. Daarnaast voeg ik 10% hitte-geactiveerd paardenserum toe.

Vervolgens voeg ik het grootste deel van het benodigde medium toe. Ik pipetteer het niet herhaaldelijk op en neer, omdat T-cellen er niet tegen kunnen om te veel gepipetteerd te worden. Daarom pipetteer ik alleen de strikt noodzakelijke minimale hoeveelheden; ze houden daar niet van, dus ik voeg het laatste deel toe en ze zijn klaar.

Ze zijn klaar om in de incubator te gaan; ik controleer ze elke dag. Ik moet ze waarschijnlijk na 24 uur splitsen, zo niet dan zeker na 40 of 48 uur. Maar ik zal ze dagelijks controleren.

Ze hebben de neiging om zeer snel te groeien in T-celgroeifactor. Daarom moeten ze minstens elke 48 uur worden gesplitst, waarschijnlijk zelfs eerder. Ik zal ook de kleur van het cultuurmedium controleren.

Nu zijn ze geactiveerd, dus ze zijn volledig geactiveerd. Dat is het beste moment om ze in de rat te injecteren. En over twee dagen zullen we de rat in het oor uitdagen.

Als we wachten tot de cellen, als we een paar dagen wachten tot de cellen weer in rusttoestand zijn, keren ze niet zo snel terug naar de plaats van de ontsteking. Ik ga ze nu in de incubator plaatsen op 37 °C met 5% CO2; ik gebruik een naald van 25 gauge om ze in de rat te injecteren. Nu de cellen intraperitoneaal zijn geïnjecteerd, laat ik de rat hier en zal ik over 48 uur een challenge uitvoeren in de oren.

Enkele dagen geleden heb ik GFP-gelabelde albuminespecifieke T-cellen geïnjecteerd in een rat. Vandaag ga ik dezelfde rat in het oor uitdagen. In het rechteroor ga ik albumine injecteren.

En in het linkeroor ga ik gewoon wat PBS injecteren. De dosis volin die ik injecteer is 20 micrograms in 20 microliter. En het albumine dat ik gebruik is een mengsel van één op één Texas red-gelabeld albumine en ongelabeld albumine.

Dit is het toilet waarop ik zal laten zien hoe ik ga injecteren. Ik ben rechtshandig, dus met mijn linkerhand heb ik de handschoen uitgetrokken om één vinger onder het oor en de andere erboven te kunnen plaatsen; zo kan ik de huid strak trekken zodat ik precies kan zien waar ik met de naald ben en tussen de twee huidlagen in de lucht kan gaan, die erg dun is.

Hiervoor gebruik ik naalden van 27 gauge om iets extreem dunns naar binnen te brengen. Als ik het omdraai, zie je duidelijk waar de Texas red is gegaan en waar de PBS is gegaan. We zijn nu 42 uur na de uitdaging in het oor, en ik ga een veerbelaste micrometer gebruiken om de oordikte te meten.

Ik ga beide oren meten: het rechteroor dat is uitgedaagd met albumine en het linkeroor dat niet is uitgedaagd. Het verschil in oordikte geeft ons een indicatie van de intensiteit van de ontsteking. Wat ik u hier heb getoond, is de volledige procedure voor het uitvoeren van een adaptieve DTH bij ratten.

Ik heb u laten zien hoe u antigeenspecifieke T-cellen in vitro activeert, hoe u deze adoptief overdraagt naar ratten, en vervolgens hoe u die ratten uitdaagt en de mate van ontsteking meet. In het Chand-lab gebruiken we deze procedure routinematig om het effect van kaliumkanaalblokkers op de ontsteking bij ratten te testen.