Name: Inductie en Monitoring van Adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Leer adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid induceren en monitoren bij Lewis-ratten. Deze methode activeert antigeen-specifieke TEM-cellen en meet de inflammatoire respons gedurende vijf dagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Alexander Flugel (Martinsried, Duitsland) voor het verstrekken van ons de GFP-gelabelde, ovalbumine-specifieke T-cel lijn die in dit protocol.

1. Stimulatie van de ovalbumine-specifieke T-lymfocyten Resting ovalbumine-specifieke T-cellen worden gestimuleerd met ovalbumine in de aanwezigheid van bestraalde Lewis rat thymocyten (30 Gy) als antigeen presenterende cellen (APC&#39;s), in Stimulatie Medium (Bereid in DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitaminen + + 2ME Rat Serum + ovalbumine, op de uiteindelijke concentraties vermeld in de materialen lijst.) Rat serum voorbereiding <ol><li> Wij nemen serum van de ratten we offer als thymus donoren. </li><li> Ratten zijn diep verdoofd door halothaan inademing en zo veel bloed als mogelijk wordt getrokken door cardiale perfusie (5-10 ml per rat) met behulp van 10 ml spuiten en 23 G 1 &quot;naalden, waarna de ratten onmiddellijk onthoofde tot de dood te verzekeren. </li><li> Het bloed mag stollen gedurende 10 min bij 37 ° C, gevolgd door 10 min op ijs. </li><li> Het stolsel wordt verwijderd en de resterende vloeistof gesponnen. </li><li> Het serum wordt verzameld, steriel gefiltreerd en opgeslagen bij -20 ° C. </li></ol> Voorbereiding van het antigeen presenterende cellen <ol><li> Neem de thymus van een onthoofde rat met behulp van steriele instrumenten en plaats deze in PBS met penicilline en streptomycine (PBS-PS), op ijs. </li><li> Neem de zwezerik op een weefselkweek kap, schoon te maken uit de vorming van bloedstolsels en andere contaminerende weefsel en snijd deze in kleine stukjes in een cel zeef (Fisher # 08-771-2), geplaatst in een 10 cm petrischaal met 10 ml PBS- PS. </li><li> Elk stuk wordt gedrukt door de cel zeef met behulp van de achterkant van een steriele 1 ml spuit zuiger. Verzamel de enkele celsuspensie in een 50 ml buis op ijs. </li><li> Spoel de cel zeef met 20-40 meer ml PBS-PS. Centrifugeer de suspensie bij 1250g en resuspendeer de pellet in PBS-PS, 5 ml / thymus, op het ijs. </li><li> Bestralen deze opschorting (30 Gy) in een gamma bestraler en meteen twee keer wassen met 50 ml PBS-PS. Opmerking: De beste thymus donoren zijn jong volwassen ratten, 5-7 weken oud. Ratten tot 10 weken kan worden gebruikt, maar het aantal cellen neemt af met de tijd. Gender is niet belangrijk, hoewel sommige mensen zeggen dat mannen beter zijn thymus donoren. Wij gebruiken altijd vrouwtjes omdat al onze dieren zijn gehuisvest in dezelfde kamer en we hebben geen mannen en vrouwen wil in dezelfde ruimte. </li></ol> Stimulatie <ol><li> Een keer was de T-lymfocyten en tel ze. </li><li> Tel de antigeen-presenterende cellen. </li><li> Mix 3 x 10 6 ovalbumine-specifieke T-cellen met 150 x 10 6 APC&#39;s in een 10 cm petrischaal met 10 ml van de stimulatie medium. </li><li> Incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° C. </li></ol> 2. Adoptieve overdracht van de ovalbumine-specifieke T-lymfocyten <ol><li> De ratten die we gebruiken als ontvangers zijn vrouwen 7-10 weken oud. </li><li> Tel de T-lymfocyten, moeten zij worden groot en rond. Het antigeen-presenterende cellen zullen dood zijn. </li><li> Centrifugeer de T-lymfocyten en resuspendeer ze op 10 x 10 6 cellen / ml in PBS. </li><li> Injecteer 1 ml intraperitoneaal gebruik van 3 ml spuiten en 23 G 1 &quot;naalden. </li></ol> 3. Uitdaging met antigeen in het oor <ol><li> Twee dagen na de adoptieve overdracht, injecteer 20 ui van een 1 mg / ml ovalbumine-oplossing (= relevante antigeen) in een oor en zout (of irrelevante antigeen) in het andere oor. NIET filter het antigeen-oplossing als je kan verliezen aggregaten die de ontstekingsreactie te versterken. Opmerking: De ratten moeten worden verdoofd om bewegingen te voorkomen. Als u rechtshandig bent, houdt het oor tussen je linker duim en wijsvinger, de wijsvinger wordt in het oor en de rat naar u toe. </li><li> Injecteer de oplossing in de oorschelp van het oor met behulp van 27G ½ &quot;naalden. Probeer om precies te injecteren alle ratten op dezelfde plaats. </li></ol> 4. Meting van DTH <ol><li> Het oor zal gaan draaien rood en zwellen als een teken van ontsteking. Meet de dikte van elk oor met een veerbelaste micrometer (bijvoorbeeld model PK-0505 van Mitutoyo). </li><li> Neem 5-6 metingen voor elk oor op elk tijdstip-point en bereken het gemiddelde. </li><li> De maximale zwelling moet plaatsvinden tussen 24 en 72 uur. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

De antigene uitdaging kan ook worden uitgevoerd op andere locaties, bijvoorbeeld in de huid van de rug (2). We echter vinden dat een uitdaging. Met behulp van de oorschelp van het oor, zoals in deze video, zorgt voor de meest nauwkeurige meting van de DTH-reactie.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500ml</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM finaal, in stimulatiemedium</td></tr><tr><td>Penicilline &amp;#8211; Streptomycine &amp;#8211; L-Glutamine</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td> respectievelijk 100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM finaal, in stimulatiemedium </td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA, 1% finaal, in stimulatiemedium</td></tr><tr><td>RPMI-vitamines</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>1% finaal, in stimulatiemedium</td></tr><tr><td>beta-mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2ME, 50 &amp;#x03BC;M finaal, in stimulatiemedium</td></tr><tr><td>Syngene ratenserum</td><td></td><td></td><td>1% finaal. Zie toelichting in protocol.</td></tr><tr><td>Ovalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml finaal, in stimulatiemedium.</td></tr></tbody></table>

inductie en monitoring van adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector-geheugen T-lymfocyten die de plaats van de injectie van een antigen waartegen het immuunsysteem is gevuld te infiltreren. De ontstekingsreactie wordt gekenmerkt door roodheid en zwelling van de site van antigene uitdaging. Het is een handig model om vast te stellen de in vivo werkzaamheid van immunosuppressiva. Cutane DTH kan worden geïnduceerd door adoptieve overdracht van antigeen-specifieke T-lymfocyten of door actieve immunisatie met een antigeen, en de daaropvolgende intradermale uitdaging met het antigeen van de ontstekingsreactie in een bepaald huidgebied induceren. DTH reacties kunnen worden veroorzaakt aan verschillende antigenen, zoals ovalbumine, tuberculine, tetanustoxoïd of keyhole limpet hemocyanine. Dergelijke reacties kunnen ook worden geïnduceerd tegen autoantigen, bijvoorbeeld om basic protein (MBP) myeline in ratten met experimentele auto-immune encephalomyelitis geïnduceerd met MBP, een diermodel voor multiple sclerose (1). Hier laten we zien hoe een adoptie-DTH-reactie in Lewis ratten veroorzaken. We zullen eerst stimuleren ovalbumine-specifieke T-cellen in vitro en injecteer deze geactiveerde cellen intraperitoneaal toegediend aan ratten naïef. Na aftrek van de cellen in evenwicht in vivo voor twee dagen, zullen we tegen de ratten met ovalbumine in de oorschelp van een oor, terwijl het andere oor zul ontvangen zoutoplossing. De ontstekingsreactie is zichtbaar 3-72 uur later en oor de dikte wordt gemeten als een indicatie van de DTH ernst.

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector-geheugen T (TEM) lymfocyten. Hier laten we zien hoe de antigeen-specifieke TEM-cellen te activeren, te induceren adoptie-DTH bij Lewis ratten en toezicht op de ontstekingsreactie.

Inductie en Monitoring van Adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten

Vertraagde overgevoeligheidsreactie (DTH) is een inflammatoire reactie die wordt gemedieerd door CCR7- effector memory T-lymfocyten die infiltreren op de injectieplaats van ...

Ik ben Christine Beaton. Ik ben assistent-onderzoeker in het laboratorium van George Chen in de afdeling Fysiologie en Biofysica van de University of California in Irvine. In de komende dagen ga ik u de procedure laten zien voor het induceren en meten van adaptieve DTH bij Lewis-ratten.Deze procedure duurt vijf dagen. Ik ga u laten zien hoe u antigeenspecifieke T-cellen activeert en hoe u deze twee dagen later initieel injecteert in naïeve ratten. Vervolgens zullen we de ratten twee dagen later in de oren uitdagen met het antigeen waarvoor deze T-cellen specifiek zijn. Een dag later zullen we de mate van ontsteking bij deze ratten meten.Om serum te verkrijgen voor mijn weefselkweek, moet ik bloed afnemen. Hiervoor voer ik een hartpunctie uit. Ik plaats mijn linkerwijsvinger op de plexus solaris en reik met mijn naald door de ribben, tussen de ribben door naar het hart, en aspireer zoveel mogelijk bloed.En bij één afname kunnen we, afhankelijk van de dag en de efficiëntie, tussen de 2 en 10 ml bloed van een specifieke rat verkrijgen. De reden waarom we serum in de kweek nodig hebben, is dat we cellen willen kweken die Lewis-ratcellen zijn in serum, wat syngene is. Dit zal dus Lewis-

induction-monitoring-adoptive-delayed-type-hypersensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de inductie en de klinische scoren van een diermodel van multiple sclerose: chronisch-recidiverende experimentele auto-immune encephalomyelitis in DA ratten. De ziekte, veroorzaakt door het immuniseren van ratten met een emulsie met hele rat het ruggenmerg en de volledige Freund's adjuvans, presenteert klinische symptomen lijken op de menselijke ziekte.

Inductie en Klinische Scoring van chronische-Relapsing experimentele autoimmune encefalomyelitis

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector geheugen T-lymfocyten. Hier laten we zien hoe actief DTH induceren in Lewis ratten en toezicht op de ontstekingsreactie.

Inductie en controle van Active Vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij ratten

Hier laten we zien een methode voor het induceren en het opnemen van de voortgang van een vertraagde type-overgevoeligheid (DTH) reactie in de rat oor. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van de voorbereiding van de rat oor weefsel voor twee-foton beeldvorming van de effector / geheugen T-cel-respons.

Imaging Effector geheugen T-cellen in het oor na inductie van Adoptieve DTH

Deze video laat zien hoe u auto-immune hypophysitis induceren in SJL muizen en hoe u de ernst ervan te beoordelen door de histopathologie.

Inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis in SJL Muizen

We beschrijven een waardevolle diagnostische test die zouden kunnen worden gebruikt om de terugtrekking van immunosuppressie na transplantatie beslist zo verhoogd risico op afstoting. De test maakt gebruik van de principes van Delayed Type Overgevoeligheid en biedt nauwkeurige beoordeling van zowel donor-specifieke effector en regulerende immuunreacties gemonteerd door de ontvangers.

Trans-vivo Vertraagd Type Overgevoeligheid Assay voor Antigen Specifieke Verordening

We beschrijven hier methoden voor de behandeling van neonatale capsaïcine ertoe atopische dermatitis bij ratten en blootstelling van gevaporiseerde formaldehyde te onderzoeken van de effecten van formaldehyde inhalatie op atopische dermatitis.

Effecten van blootstelling van Formaldehyde aan een Rat Model van atopische Dermatitis veroorzaakt door neonatale capsaïcine behandeling

Dit protocol maakt gebruik van G6PI gemengde peptiden om reumatoïde artritis modellen die dichter bij die van de menselijke reumatoïde artritis in CD4+ T cellen en cytokines construeren. Hoge zuiverheid invariant natuurlijke killer T cellen (voornamelijk iNKT2) met specifieke fenotypes en functies werden verkregen door in vivo inductie en in vitro zuivering voor adoptieve immunotherapie.

Adoptieve immunotherapie van iNKT-cellen in glucose-6-fosfaat-isomerase (G6PI)-Geïnduceerde RA-muizen

Contactovergevoeligheid (CHS) is een muizenexperimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD). CHS is gebaseerd op sensibilisatie met reactieve hapten door de geschoren huid van de borst en buik te schilderen, met een daaropvolgende oorhuiduitdaging met een verdunde hapten, waardoor een zwellingsreactie ontstaat die op verschillende manieren wordt beoordeeld.

Contactovergevoeligheid als een muizenmodel van allergische contactdermatitis

Hier presenteren we een beknopt protocol voor het maken van een te vroeg geboren rattenmodel, dat onderzoek naar vroege postnatale pijnbestrijding vergemakkelijkt. De methode omvat het uitvoeren van een keizersnede drie dagen voor de verwachte geboorte, het extraheren van premature rattenpups via hysterectomie en het integreren ervan met de biologische nakomelingen van een draagmoeder.

Een te vroeg geboren rattenmodel voor pijnstudies

Dit protocol beschrijft een meerkleurige immunofluorescentietechniek voor het evalueren van het rattenmodel van allergische rhinitis.

Immunofluorescerende etikettering in neusslijmvliesweefselsecties van allergische rhinitis-ratten via veelkleurige immunoassay

De studie toont de rol van de huid aan bij het moduleren van immuunresponsen bij muizen door middel van epicutane (EC) immunisatie. EC-immunisatie met een eiwitantigeen kan immuunresponsen bij contactovergevoeligheid onderdrukken of door de huid geïnduceerde onderdrukking omkeren in combinatie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. EC-immunisatie is veelbelovend als een effectieve, naaldvrije benadering van immunotherapie.

Muizenmodel van epicutaan geïnduceerde immunomodulatie

Leer adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid induceren en monitoren bij Lewis-ratten. Deze methode activeert antigeen-specifieke TEM-cellen en meet de inflammatoire respons gedurende vijf dagen.

Inductie en Monitoring van Adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten

Meer video's verkennen