Het uitvoeren van op maat MicroRNA microarray experimenten

Het algemene doel van deze procedure is om een micro RNA-microarray-experiment uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst bedrukte microarray-slides te verwerven die een bibliotheek van micro RNA-probes bevatten en RNA-monsters te bereiden met een geschikte kwaliteit en hoeveelheid. Vervolgens worden de RNA en een gecontroleerd DNA-monster gelabeld met fluorescerende kleurstoffen.

Vervolgens worden de gelabelde nucleïnezuren toegevoegd aan een microarray-slide voor hybridisatie. Uiteindelijk worden de microarray-slide gewassen en gescand en wordt de slide geregenereerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de genoombrede expressie van microRNA's laten zien door analyse van de slide voor hybridisatie-intensiteiten van de individuele micro RNA-probes.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van genexpressie, zoals hoe normale fysiologische omstandigheden of pathologische omstandigheden op een globaal niveau verschillend de expressie van micro-behoeften beïnvloeden. De kwaliteit van de microarray-fabricage is een van de meest cruciale factoren voor het succes van een microarray-experiment. Na het isoleren van RNA met behulp van een methode die kleine RNA's behoudt en het opnieuw op te schorten in een concentratie van twee milligram per milliliter of hoger, labelt u het RNA in een reactievolume van 20 microliter door eerst ongeveer 25 microgram totaal RNA te mengen met 0,5 microgram van vijf prime P-C-U-D-Y 5 4 7 3 prime in een X HEPs-buffer aangevuld met T vier RNA Ligase 1D TT en een TP. Als er minder RNA beschikbaar is, verminder dan de hoeveelheid RNA en de reactie.

Als het RNA erg verdund is, voeg dan een carrier toe zoals gist, TRNA om te helpen bij precipitatie, incubeer de reactie op ijs in een koelkast gedurende twee tot 24 uur. Voeg vervolgens natriumacetaat toe tot 0,3 molair en vervolgens drie volumes ethanol en laat de RNA overnacht bij minuus 20 graden Celsius bezinken. Om de slides voor de eerste keer te gebruiken, pre-hybridiseer ze in een gefilterde oplossing van drie XSSC, 0,1% SDS en 0,2% BSA gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius.

Dompel vervolgens de slides een paar keer in water. Droog vervolgens in isopropanol de slides met behulp van een centrifuge met een slide-adapter bij 100 keer G gedurende vijf minuten bij 22 graden Celsius. Spoel lifter strips in water.

Plaats vervolgens in ethanol voor het drogen in de lucht een slide in een microarray-hybridisatiekamerbasis en een lifterslip op de slide zodat de lifterslip het sondegebied en de witte strips bedekt. Laat de slide in het donker contacteren, centrifugeer het geprecipiteerde gelabelde RNA, was het eenmaal met 70% ethanol en droog het pelletje in de lucht. Het pelletje moet roodachtig van kleur zijn.

Bereid een hybridisatieoplossing voor met een hoeveelheid van een vijftiende tot een honderdste in volume van de gezuiverde gelabelde referentie-DNA per RNA-monster. Los het RNA-pelletje volledig op met ongeveer 60 microliter van de hybridisatieoplossing om ervoor te zorgen dat de hybridisatieoplossing niet uitdroogt. Tijdens incubatie voegt u 20 microliter water toe aan elk van de bevochtigingsputjes. In de microarray-hybridisatiekamerbasis.

Voeg een mengsel van gelabeld RNA en referentie-DNA toe aan de slide. Gebruik een dunne pipettentip om voorzichtig de rand van de lifterslip aan te raken en door middel van zuiging. Laat de oplossing het ruimte tussen de lifterslip en de slide binnendringen.

Plaats de hybridisatiekamerdeksel over de basis. Vervolgens verzegelt u de kamer met metalen clips. Plaats de gehele kamer in de plastic zak die bij de kamercassette wordt geleverd.

Plaats tenslotte de kamercassette in een container met een vochtige papieren handdoek. Bedek vervolgens de container met plasticfolie en plaats deze in een 37 graden Celsius vochtige celkweekincubator gedurende ongeveer 24 uur. Om de slides na hybridisatie te verwerken, demonteert u de kamercassettes een voor een, dompelt u een slide en de lifterslip in twee XSSC bij 22 graden Celsius onder.

De lifterslip zal vanzelf van de slide vallen, was de slides twee keer in 0,8 XSSC, vervolgens drie keer in 0,4 XSSC gedurende in totaal een tot twee minuten. Droog de slides met behulp van een centrifuge met een slide-adapter. Scan vervolgens de slides met een microarray-scanner en gebruik een programma zoals blue fuse om de intensiteiten in de beeldbestanden te kwantificeren.

Inspecteer individuele spots om abnormale spots uit te sluiten die meestal ontstaan door poreuze slide-printing of slide-verwerking na hybridisatie. Voor data-analyse en presentatie, gebruik programma's zoals gene springing en excel om de microarray opnieuw te gebruiken. Strip de slide door het in water te spoelen en vervolgens gedurende 10 tot 20 minuten in een steriele schaal van voorverwarmde 1 millimolaire NAOH en 0,1 XSSC bij 62 graden Celsius te onderdompelen.

Herhaal de incubatie een tweede keer. Was de slides verscheidene keren in water gedurende maximaal 60 minuten met zacht schudden bij 22 graden Celsius. Droog de slides met behulp van een centrifuge en bewaar ze bij 22 graden Celsius.

De slides kunnen worden gebruikt zonder pre-hybridisatie. Deze figuur toont een gescande afbeelding van een microarray die zeer nauwkeurige en sterke hybridisatiesignalen demonstreert. Rode spots resulteerden uit hybridisatie van de referentie-DNA, groene spots van het DY 5 47 gelabelde RNA-monster en de gele spots waren van hybridisatie van zowel het DNA als RNA aan dezelfde probes.

De Pearson-correlatiecoëfficiënten tussen technische replica's van microarray-hybridisatie zijn ongeveer 0,99, wat duidt op uitstekende reproduceerbaarheid. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een aangepast microray-experiment uitvoert, niet alleen voor het kwantificeren van micronase, maar ook voor het kwantificeren van andere soorten nucleïnezuur zoals mRNA's.