Name: Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer cardiomyocyten van neonatale ratten inkapselen in fibrinehydrogel voor hartweefselengineering. Deze methode genereert samentrekkingskrachten van 1,3 mN en biedt een waardevol model voor cardiaal onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health - National Heart, Lung and Blood Institute (Award # R00HL093358 naar LDB).

<ol><li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical%2C+biochemical%2C+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li>
<li>Guarnieri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+RGD+gradient+on+PEG+hydrogel+scaffold+influences+cell+migration+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters.</a> Acta. 6, 2532-2539 (2010).</li>
<li>Krebs, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+poly%28lactic-co-glycolic%29+acid+scaffolds+with+in+situ+pore+formation+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering.</a> Acta. 5, 2847-2859 (2009).</li>
<li>Zimmermann, W. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Three-Dimensional+Hyaluronic+Acid+Stem+Cell+Chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis.</a> Tissue engineering. 15, (2009).</li>
<li>Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+distension+of+fibrin-based+tissue+constructs%3A+evidence+of+adaptation+during+growth+of+engineered+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).</li>
<li>Jockenhoevel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+gel+-+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cardio-thoracic+surgery+%3A+official+journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).</li>
<li>Ryan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sourcing+and+culture+conditions+for+fibrin-based+valve+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs.</a> Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).</li>
<li>Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin-based+arterial+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+66+%28Part+A%22%5BJournal%5D)">A fibrin-based arterial media equivalent.</a> Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%3ELIVE%2FDEAD+Viability%2FCytotoxicity+Kit+%2Afor+mammalian+cells%22">>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells</a>. , Invitrogen. (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De inkapseling van neonatale cardiomyocyten van de rat in fibrine gels resulteert in een consistent en levensvatbare drie-dimensionaal in vitro model van het myocard-systeem. Fibrine is een voorkeur biomateriaal, want als de cellen worden ingesloten, ze zijn metabool actief en in staat verdichten, remodeling en opnieuw een extracellulaire matrix die consistent is met native hartweefsel 12. Omdat we toestaan ​​dat de cardiomyocyten zich aan te sluiten in deze omgeving, hun functionaliteit is meer karakteristiek van de hartspier resulteert in een grotere krimp van kracht ten opzichte van isotroop weefsels 6. Voor potentiële therapeutische toepassingen, is het noodzakelijk om cellen in te kapselen in een materiaal dat zowel de levensvatbaarheid en functionaliteit bevordert. De protocollen die hier aan te tonen een efficiënte en nauwkeurige wijze voor het creëren van een fibrine netwerk om cardiale cel gedrag in een driedimensionale micro-omgeving te controleren. Een paar mogelijke problemen zich kunnen voordoen tijdens het ontstaan ​​en de cultuur van deze constructen. Een potentieel probleem is de handhaving van de levensvatbaarheid van de cellen voorafgaand aan de inkapseling, die aanzienlijk van invloed op de functionaliteit van de constructie. Inspanning moet worden geleverd om celdood te beperken gevolg van het isolement door het verminderen van de tijd tussen de isolatie en de inkapseling van de cellen binnen de fibrine gel. Bouwt moet worden verstrekt media om de andere dag op een strak schema. Daarnaast is het belangrijk om homogeniteit in alle gebruikte oplossingen. Als het mengsel van fibrinogeen, trombine en cellen produceert een heterogene omgeving, het vermogen van de cellen naar de ECM renovatie, is mechanisch koppel en contract mogelijk belemmerd. Het is ook belangrijk om de vorming van luchtbellen te voorkomen tijdens de injectie van de constructen in om verstoringen in de continuïteit van de kunstmatige weefsel te voorkomen. Een manier om dit probleem te verlichten is trekken meer gel dan nodig is om de bouw te maken in de spuit en langzaam te injecteren. Ten slotte, zodra de fibrine matrix heeft ingesteld en is in kweekmedium gedurende 24 uur, is het essentieel om het construct los te maken van de zijkanten van de ring vorm van de cel-gebaseerde verdichting van de fibrine gel te bevorderen. Het houden van de constructie in het midden van de mal faciliteert gas-en voedingsstoffen uit te wisselen. Vasthouden aan de zijkanten van de ring schimmel kan ook verstoren de gewenste cellulaire uitlijning. Het is belangrijk op te merken dat bewuste onthoofding wordt gebruikt als de methode van euthanization in dit protocol, dat is een aanvaardbare methode volgens de richtlijnen van zowel de National Institutes of Health en de American Veterinary Medical Association. Echter, sommige instellingen bevelen verdoving gebruik gevolgd door onthoofding voor neonatale ratten. We hebben gekozen voor bewust onthoofding, omdat het zorgt voor de minimale hoeveelheid tijd onder hypoxische condities voor het hart weggesneden weefsel / cellen. Relatief kleine hoeveelheden van hypoxie kan leiden tot ischemie en mogelijk myocyte dood, die een aanzienlijke invloed kunnen zijn op de uitkomsten van dit protocol myocyte.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Kaliumchloride </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Dibasisch </td><td> Sigma </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Kalium monobasisch </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G5400 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> hemostat </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 91308-12 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> fijn pincet </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> grote schaar </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 91401-14 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> micro-schaar </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 91501-09 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> scalpel hanteren </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 10008-13 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> scalpel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 tot 918-5A </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> Absorberende bank underpad </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> steriel laken </td><td> Fisher Scientific </td><td> GM42526 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> autoclaaf tas </td><td> Visser </td><td> 01-812-54 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> gaasje </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-761-52 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Purdue Producten </td><td> 67618-150-01 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> steriele handschoenen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-020 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> steriele transferpipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 9962 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> collagenase </td><td> Worthington </td><td> CLS2 </td><td> Isolatie </td></tr><tr><td> Teflon staaf 1 / 4 inch diameter </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> Matrijsdeel </td></tr><tr><td> Teflon buis 1 / 4 inch ID, 1 / 2 inch OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> Matrijsdeel </td></tr><tr><td> Silicone O-ring 1 / 4 inch ID, 1 / 2 inch OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> Matrijsdeel </td></tr><tr><td> Teflon buis 1 / 4 inch-ID, 5 / 16 inch OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> Matrijsdeel </td></tr><tr><td> Kendall monoject spuiten 6cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-561-41 </td><td> Matrijsdeel </td></tr><tr><td> BD spuit 3CC </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td> Matrijsdeel </td></tr><tr><td> Runderen Fibrinogeen </td><td> Sigma </td><td> F8630 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> Runderen Trombine </td><td> Sigma </td><td> T7513 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> Natrium Chloride </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> Calcium Chloride </td><td> Sigma </td><td> 383147 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> 0,2 micron filter </td><td> Fisher Scientific </td><td> SCGVT05RE </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> 40 micron cel zeven </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-363-547 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> 0,45 micron fles top filter </td><td> Corning </td><td> 430627 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> glas pre-filter </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 inch lange naald </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-5D </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> 21G 1 inch naald </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826C </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> construeren potten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2116 </td><td> Construeren </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Media </td></tr><tr><td> paardenserum </td><td> Sigma </td><td> H1138 </td><td> Media </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> Media </td></tr><tr><td> aminocapronzuur </td><td> Acros Organics </td><td> 103305000 </td><td> Media </td></tr><tr><td> ascorbinezuur </td><td> Sigma </td><td> A5960 </td><td> Media </td></tr><tr><td> insuline </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td><td> Media </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, 16% </td><td> Electron Microscopy Wetenschappen </td><td> 15710 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Optimale snijden temperatuur (LGO) </td><td> Ted Pella </td><td> 27050 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> 2-methylbutaan </td><td> Visser </td><td> 03551-4 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Muis MYH1/2/4/6 primair antilichaam </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-+32.732 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Konijn connexine 43 primair antilichaam </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 3512 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Dylight 549-geconjugeerd ezel anti-muis secundair antilichaam </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories </td><td> 715-505-151 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Dylight 488-geconjugeerde Donke anti-konijn secundair antilichaam </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories </td><td> 711-485-152 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Live / dead-test </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> Analyse </td></tr></tbody></table>

inkapseling van hartspiercellen in een fibrine hydrogel voor cardiac tissue engineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Het kweken van cellen in een driedimensionale omgeving hydrogel is een belangrijke techniek voor het ontwikkelen van concepten voor tissue engineering, alsmede het bestuderen van cellulaire reacties onder verschillende omstandigheden in vitro cultuur. De drie-dimensionale omgeving beter nabootst wat de cellen te observeren in vivo als gevolg van de toepassing van mechanische en chemische stimuli in alle dimensies 1. Drie-dimensionale hydrogelen kan worden gemaakt van synthetische polymeren zoals PEG-DA 2 en 3 PLGA of een aantal van de natuurlijk voorkomende eiwitten zoals collageen 4, hyaluronzuur 5 of fibrine 6,7. Hydrogels gemaakt van fibrine, een van nature voorkomende bloedstolling eiwit, kan polymeriseren tot een mesh dat deel uitmaakt van de natuurlijke lichaam wondgenezing processen acht te vormen. Fibrine is cell-afbreekbaar en mogelijk autologe 9, waardoor het een ideale tijdelijke steiger voor tissue engineering. Hier beschrijven we in detail de isolatie van neonatale cardiomyocyten van drie dagen oude rat pups en de voorbereiding van de cellen voor inkapseling in fibrine hydrogel constructen voor tissue engineering. Neonatale myocyten wordt een gemeenschappelijke cel bron gebruikt voor in vitro studies in hartweefsel vorming en techniek 4. Fibrine gel wordt gemaakt door het mengen van fibrinogeen met het enzym trombine. Trombine klieft fibrinepeptiden KPO en FPB van fibrinogeen, onthullend bindingsplaatsen die een interactie met andere monomeren 10. Deze interacties leiden tot de monomeren om zelf te monteren in de vezels die de hydrogel mesh formulier. Omdat de timing van deze enzymatische reactie kan worden aangepast door het veranderen van de verhouding van trombine op fibrinogeen, of de verhouding van calcium aan trombine, kan een spuitgietmatrijs constructen met een aantal verschillende geometrieën 11,12. Verder kunnen wij genereren uitlijning van de resulterende weefsel door de manier waarop we de gel beperken tijdens de cultuur 13. Na het kweken van de engineered hartweefsel bouwt gedurende twee weken onder statische omstandigheden, hebben de hartcellen begonnen met de bouw van verbouwen en kan een samentrekking van kracht onder elektrische pacing voorwaarden 6 te genereren. Als onderdeel van dit protocol, hebben we ook een beschrijving van methoden voor het analyseren van de weefselmanipulatieproducten myocard na de cultuur periode met inbegrip van functionele analyse van de actieve kracht die door de hartspier te bouwen op elektrische stimulatie, alsook werkwijzen voor het bepalen van de definitieve levensvatbaarheid van de cellen (Live-Dead assay) en immunohistologische vlekken om de expressie en de morfologie van de typische eiwitten die belangrijk is voor contractie (myosine zware keten of MHC) en cellulaire koppeling (connexine 43 of Cx43) tussen myocyten te onderzoeken.

We beschrijven de isolatie van neonatale cardiomyocyten en de voorbereiding van de cellen voor inkapseling in fibrine hydrogel constructen voor tissue engineering. We beschrijven methoden voor het analyseren van de weefselmanipulatieproducten myocard na de cultuur periode met inbegrip van actieve kracht die op elektrische stimulatie en levensvatbaarheid van de cellen en immunohistologische vlekken.

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

Het kweken van cellen in een driedimensionale hydrogelomgeving is een belangrijke techniek voor de ontwikkeling van constructen voor weefseltechnologie, evenals voor het bestuderen van ...

Het algemene doel van deze procedure is om neonatale ratten-cardiomyocyten in een FI-hydrogel in te kapselen voor cardiac tissue engineering. Dit wordt bereikt door eerst de harten van twee tot drie dagen oude neonatale rattenpups te isoleren. Vervolgens worden de harten verteerd in collagenase.Om de hartcellen van de extracellulaire matrix te scheiden, worden de hartcellen vervolgens ingekapseld in een fibrine-hydrogel. Ten slotte worden de constructen gedurende twee weken gekweekt. Uiteindelijk tonen de resultaten aan dat de constructen in staat zijn om een twitch-kracht van ongeveer 1,3 milli Newtons te genereren als reactie op elektrische stimulatie.Bovendien kan de uitgelijnde structuur van het construct worden waargenomen via histologische kleuring van myocytenproteïnen. Engineered myocardiale constructen kunnen dienen als een potentiële therapie voor myocardinfarcten door herstel of vervanging van littekenweefsel door engineered weefsel mogelijk te maken, waardoor de hartfunctie na letsel of ziekte wordt verbeterd. Deze constructen kunnen dienen als een waardevol in vitro modelsysteem voor het bestuderen van de effecten van verschillende stimuli op contractiele krachten en normale en pathofysiologische hartontwikkeling.Nadat het medium is voorbereid en de chirurgische instrumenten voor elke persoon zijn gesteriliseerd, plaatst u een absorberende onderlegger op het werkoppervlak van de laminaire flowkast en bedekt u deze met een steriel afdekdoek. Plaats de steriele chirurgische instrumenten en een gaasje van 10 bij 10 cm op het steriele afdekdoek. Open, zonder de instrumenten aan te raken, een steriel scalpelblad nummer 20 en plaats dit op het afdekdoek.Nadat het pup is onthoofd, wordt de borst gedepsiseerd met gaas gedrenkt in Betadine. Fixeer het pup door de schouderbladen tegen elkaar aan te drukken. Voer een partiële thoracotomie uit om het hart bloot te leggen en verhoog de druk op de schouderbladen, waardoor het hart voorbij de ribben wordt geduwd.Voer voor de dissectie van de scapula het scalpellames achter het hart door om de grote vatenten doorsnijden en het orgaan te verwijderen. Plaats het hart op ijs in een Petrischaal met PBS-glucose. Zodra de harten zijn geïsoleerd, verwijdert u eventueel resterend bloed en bindweefsel door ze te spoelen met ijskoud PBS-glucose.Verwijder het bovenste derde deel van elk hart, zodat de onderste twee derde overblijven. Om voornamelijk het ventriculaire weefsel te isoleren, wordt het weefsel in een schone Petrischaal met ijskoud PBS-glucose geplaatst. Gebruik steriele microschaaren en pincetten om de harten voorzichtig fijn te snijden in stukjes van ongeveer één kubieke millimeter.Breng het weefsel over naar een conische buis van 50 milliliter en verwijder alle buffer behalve 10 milliliter. Voeg zeven milliliter collagenase-oplossing toe. Schud het mengsel van collagenase en weefsel zeven minuten lang bij 37 graden Celsius.Pipette voorzichtig 10 keer om de weefselstukjes uiteen te drijven. Laat de stukjes bezinken, aspireer vervolgens de vloeistof en gooi deze weg. Voeg zeven milliliter collagenase toe aan de weefselstukjes en laat dit nogmaals zeven minuten verteren.Pipetteer voor elke overgebleven stap voorzichtig 10 keer om de weefselstukjes uiteen te drijven. Nadat deze zijn bezonken, wordt het supernatant afgezogen en verzameld. Voeg in een aparte conische buis van 50 milliliter zeven milliliter collagenase toe aan de weefselstukjes en verteer deze opnieuw gedurende zeven minuten. Voeg aan elke supernatantbuis 10 milliliter stopoplossing toe met een verschillende serologische pipette na elke toevoeging van supernatant uit de digestie.Raadpleeg het geschreven gedeelte van het protocol ter voorbereiding op het gieten van fibrinagel-constructen. Plaats de eerder geconstrueerde doorns in de spuitbehuizingen van zes cc, waarbij de spuit van drie cc als zuiger wordt gebruikt om een nauwe afsluiting tussen de O-ringen en de Teflon-ringen te verkrijgen. Om één milliliter fibrinagel te maken, wordt oplossing F in een conische buis bereid door 112 µL van de fibrinogeen-stock toe te voegen aan 558 µL van 20 mM HEPES.Buffer in 0,9% zoutoplossing in een aparte conische buis. Maak een T-oplossing door 17 µL van de thrombine-stock en 1,3 µL van de twee normale calciumoplossing toe te voegen aan 135 µL DMEM. Centrifugeer in een derde conische buis de cellen en resuspendeer deze tot een concentratie van 29,4 miljoen cellen per ml, oftewel zes keer de gewenste uiteindelijke concentratie cellen in het construct.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de stap van de constructiefabricage. Na het mengen van de fibrinogeen- en thrombine-oplossingen vindt de polymerisatie van fibrine snel plaats. Daarom dienen personen snel te werken om een homogene oplossing te garanderen, terwijl men tegelijkertijd moet voorkomen dat er luchtbellen in de hydrogel terechtkomen bij het injecteren in de gietvorm.Wanneer u klaar bent om het fibrinengelconstruct te gieten, bereid dan een spuit van 1 milliliter voor met een naald van 18 gauge en een lengte van anderhalf inch. Houd daarnaast een naald van 21 gauge en een lengte van één inch gereed. Om één milliliter fibrinegelsolutie te maken, voegt u 667 µL F-solutie toe aan een centrifugebuis van 50 milliliter, gevolgd door 167 µL celoplossing.En tot slot 167 µL T-oplossing. Pipetteer het mengsel voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Op dit punt is de reactie gestart en moet de injectie van het construct onmiddellijk worden uitgevoerd.Gebruik de spuit en de naald van 18 gauge en zuig de fibrine-oplossing op. Zorg ervoor dat de spuit niet wordt omgedraaid om te voorkomen dat er luchtbellen in de naald terechtkomen. Vervang de 18 gauge naald door een 21 gauge naald.Tik voorzichtig tegen de spuit om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens de spuit in de mal, tussen de afsluitstop, waarbij u de groef in de Teflon O-ring volgt, en injecteer de oplossing in de mal. Kantel de mal om een volledige vulling te garanderen.Vul vervolgens de resterende mallen. Wikkel de mallen in parafilm in groepen van drie en plaats ze in de incubator of oven bij 37 °C. Incubeer de gels gedurende 20 minuten om het fibrine voldoende tijd te geven om volledig te polymeriseren.Vul elke kweekpot met 21 milliliters myocardiaal constructmedium per construct. Gebruik de steriele behuizing van een spuit van drie cc als zuiger om de mandrel met het construct in een grote Petrischaal met DMEM te duwen. Plaats het construct vervolgens in de monsterpot.Incubeer de potten twee weken bij 37 °C. Om de analyse van een fibrinestructuurklem te starten, bevestigt u de krokodillenklemmen van de kabel van de stimulator aan de draden van de elektroden in het bad. Zet het gegevensverzamelbord, de pulsgenerator en de krachttransducer aan.Stel de krachttransducer in op de 5G-stand en nul deze. Open een aangepast LabVIEW-programma dat de gegevens van de krachttransducer weergeeft en opslaat. Maak in de gegevensmap een nieuw leeg tekstbestand aan voor elk monster. Verwijder met een pincet het construct van de steun van het mandril door de constructring voorzichtig van de Teflon-steun te schuiven en deze over de vaste metalen paal in het krachtmetingssysteem te plaatsen.Mediumbad. Gebruik de pincet om het construct rond de paal van de krachttransducer weg te duwen en op te tillen. Plaats het andere uiteinde van het construct over de arm van de transducer en draai aan totdat de transducer een waarde aangeeft.Stel de hartstimulator in op 1,0 G. Zet de pulsspanning op 20 volt, de duur op zes milliseconden en de frequentie op één hertz. Start de elektrische pacing door op de aan/uitknop van de output te drukken.Start met de opname tot de golfvorm regelmatig wordt. Analyseer de golfvorm in MATLAB om de kracht van contractie en de snelheid van relaxatie te bepalen. Het cardiomyocyte-fibrineconstruct beslaat aanvankelijk de gehele breedte van de mal.Na twee weken kweken trekt het construct samen tot ongeveer een vijfde van de oorspronkelijke breedte. Elektrische stimulatie van het construct genereert gegevens over de twitchkracht, zoals hier getoond. Er worden twitchkrachten van ongeveer 1,3 millinewtons verwacht.De celviabiliteit van het construct is afhankelijk van de afstand van de cellen tot het oppervlak van het construct dat in contact staat met het kweekmedium, vanwege de diffusiebeperkingen van zuurstof in het construct. Aan het oppervlak van het construct werd met behulp van confocale microscopie een hoge celviabiliteit waargenomen. De uitgelijnde structuur van het construct is zichtbaar door kleuring voor myosin heavy chain in rood; Connexine 43, dat noodzakelijk is voor de celkoppeling tussen myocyten, is in groen weergegeven.Zodra de methode onder de knie is, zou het volledige protocol ongeveer vijf uur in beslag nemen. Het gedeelte betreffende de isolatie duurt ongeveer drie uur, terwijl het gedeelte voor de fabricage van het construct ongeveer twee uur in beslag neemt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de naald altijd naar beneden gericht te houden om te voorkomen dat er luchtbellen in het fibrinenetwerk terechtkomen.Bovendien zorgt het kantelen van de mal ervoor dat het naaldgat tijdens de injectie altijd op het hoogste punt blijft, waardoor wordt gegarandeerd dat het gietsel van de mal volledig wordt gevuld met de fibrine-oplossing. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe cardiomyocyten kunnen worden ingekapseld in ringvormige fibrine-hydrogels door eerst de cardiomyocyten uit neonatale ratten te isoleren en vervolgens de fibrine-oplossing via spuitgieten in de eenvoudig te assembleren cilindrische mallen te brengen.

encapsulation-cardiomyocytes-fibrin-hydrogel-for-cardiac-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

Werkwijzen voor het bereiden een injecteerbare gel matrix van gedecellulariseerde weefsel en het injecteren van het in rat...

Productie van biologisch verkregen Injecteerbare Materialen voor myocard Tissue Engineering

Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid...

Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.

Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce

Implantatie van een biograft myocardiaal infarct geïnduceerd door LAD ligatie in een knaagdier model behandelen conventioneel vereist twee open-hartoperaties. Om terug te dringen en de optimale omstandigheden voor fixatie van vaste en gelatineachtige biomatrices geassocieerd met cellen, hebben minimaal invasieve procedures ontwikkeld.

Cel-gebaseerde therapie voor hartfalen bij Rat: Dubbele Thoracotomie voor myocardinfarct en Epicardiale Implantatie van Cellen en Biomatrix

Dit protocol heeft tot doel de beperking van slechte celaanplanting voor stamcelbehandeling van hartinfarcten te verlichten door het gebruik van een hydrogelsysteem en een op fibrine gebaseerde lijm. Met deze aanpak kan contact tussen cel en weefsel na het infarct worden gehandhaafd, waardoor het therapeutische potentieel van heilzame agentia op de plaats van de blessure wordt vergroot.

Een Hydrogel Construct en fibrine-gebaseerde lijm Aanpak Therapeutics leveren in een Murine myocardinfarct Model.

Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Hierin presenteren wij een snelle, facile en goedkope methode voor het fabriceren van aangepaste Polydimethylsiloxaan mallen die kunnen worden gebruikt voor de productie van hydrogel gebaseerde gemodificeerde weefsels met complexe geometrieën. Daarnaast beschrijven we resultaten van mechanische en histologische evaluaties uitgevoerd op gemanipuleerde cardiale weefsels geproduceerd met behulp van deze techniek.

Aangepaste ontworpen weefselkweek mallen van Laser-geëtst meesters

Stamcelgebaseerde therapie is naar voren gekomen als een efficiënte strategie om gewonde hartweefsels te herstellen na een myocardinfarct. Wij bieden een optimale in vivo toepassing voor stamceltransplantatie met behulp van gelatinehydrogels die enzymatisch met elkaar verbonden kunnen zijn.

Intramyocardtransplantatie van MSC-Loading Injecteerbare Hydrogels na myocardinfarct in een Murine-model

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Leer cardiomyocyten van neonatale ratten inkapselen in fibrinehydrogel voor hartweefselengineering. Deze methode genereert samentrekkingskrachten van 1,3 mN en biedt een waardevol model voor cardiaal onderzoek.

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

Meer video's verkennen