Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy
20 oktober 2011
De complete bouw van een aangepaste, real-time confocale scanning imaging-systeem is beschreven. Dit systeem, dat gemakkelijk kan worden gebruikt voor video-rate microscopie en microendoscopy, zorgt voor een scala aan imaging-geometrieën en toepassingen die niet toegankelijk zijn met behulp van standaard commerciële confocale systemen, tegen een fractie van de kosten.
Deze video toont hoe je een video rate scanning confocale microscoop kunt bouwen met standaard componenten die je in de winkel kunt kopen. Een scannende confocale microscoop werkt door het gecoördineerde bewegen van twee scanspiegels om het licht te vertalen over het rastervlak. Het licht van de eerste spiegel wordt horizontaal gescand over de eerste set van relaislenzen, die het terug focussen op een stationair punt op de tweede scanspiegel. Dezelfde scanbeweging wordt vervolgens door de scan- en buislenzen verplaatst, waardoor de nu uitgebreide lichtbundel op de achterste opening van de objectieflens komt te liggen.
De tweede spiegel, waarvan de beweging langzamer is dan de eerste spiegel, scant gelijktijdig de Y-as en maakt scanactie boven en onder het geïllustreerde vlak mogelijk, waardoor een rechthoekig raster op het monstersoppervlak ontstaat. Het grootste voordeel van dit protocol boven het kopen van een commercieel verkrijgbare microscoop is de lage kosten en de mogelijkheid om het instrument aan te passen aan de specifieke behoeften van een beeldproject. Bij het werken met elke laser is het van vitaal belang om passende veiligheidsmaatregelen te nemen om oogletsel te voorkomen.
Zorg ervoor dat je altijd de juiste laserveiligheidsbril draagt wanneer dat mogelijk is. Toeschouwers en/of onderzoekers die niet actief aan het uitlijnen of werken met de straal zijn, moeten altijd een bril dragen. Verwijder alle glanzende en reflecterende horloges of sieraden.
Het belangrijkste is om ervoor te zorgen dat je de straal altijd volgt en controleert door zijn pad te beëindigen met behulp van een straalblok of een gemonteerde visitekaartje. Dit is vooral belangrijk bij het uitlijnen van spiegels, omdat de baan van de straal moeilijk te voorspellen kan zijn. Zorg er ook voor dat je je ogen nooit op hetzelfde niveau brengt als het straalpad.
Schakel de laser uit als je het vlak van de straal moet oversteken voordat je de microscoop monteert. Zorg ervoor dat alle apparatuur die nodig is voor de constructie beschikbaar is, inclusief het optische snedebord en 90-graads beugels, alle spiegels, lenzen en dichroiek, samen met de juiste klemmen en montagehardware, beide scanspiegels en de fotodetector. Het is ook handig om een functiegenerator bij de hand te hebben om de scanactie te testen en de spiegels tijdens het uitlijnen te manipuleren.
Het is ook ten zeerste aanbevolen om het snedebord vast te schroeven voor stabiliteit. Begin met de constructie van de microscoop door de pigtail fiber ator in de optische houder te plaatsen en deze constructie in het midden van het optische snedebord te plaatsen. Dit komt overeen met de oorsprong van de blauwe straal zoals hier getoond.
Schakel de lichtbron in. Gebruik de afstelschroeven om de straal grof af te stellen zodat deze zowel horizontaal als verticaal in een rechte lijn reist. Plaats een iris voor de fiber collator.
Stel vervolgens de hoogte van de iris zo in dat de straal er doorheen passeert. Beweeg vervolgens de iris weg van de ator langs het straalpad. Controleer de uitlijning van de straal.
Gebruik de twee afstelschroeven om de straal op de iris te herpositioneren indien nodig. Plaats de gemonteerde diic spiegel in het straalpad met de laserstraal gepositioneerd in het midden van de spiegel. Draai de spiegelhouder zodat de straal ongeveer 90 graden wordt gereflecteerd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de hoogte van de straal niet verandert.
Klem de spiegel vast aan de tafel door de schroeven op de houder vast te draaien. Plaats vervolgens de gemonteerde resonante galvan metrische spiegel in de laserstraal. Zorg ervoor dat de laserstraal precies in het horizontale middelpunt van het spiegeloppervlak is gepositioneerd.
Draai de spiegelhouder zodat de laserstraal onder een hoek van 90 graden wordt gereflecteerd. Pas vervolgens de reflectie van de spiegel grof aan om dezelfde verticale hoogte van de laserstraal te behouden. Neem vervolgens twee irissen en plaats ze direct voor de resonante gal.
Gebruik vervolgens de laserstraal die wordt gereflecteerd van de resonante gal spiegel als referentie, stel hun verticale hoogte in zoals eerder. Gebruik nu de schroefgaten op het optische snedebord als gids voor het oog en klemp de twee irissen in een rechte lijn vast. Pas de eerste spiegel in de baan aan, wat de dichroiek is om de straal op de eerste iris te centreren.
Pas vervolgens de tweede spiegel in de baan aan. De resonante gal om de straal op de tweede iris te centreren. Pas deze twee spiegels iteratief aan totdat de straal is uitgelijnd door beide irissen.
Zorg ervoor dat de laserstraal die wordt gereflecteerd van de resonante gal spiegel nog steeds wordt gereflecteerd vanuit het ongeveer middelpunt van de spiegel. Als de straal wordt afgeweken, pas dan de fiber collator montage aan en herhaal de aanpassingen met de straal gecentreerd op beide open irissen. De volgende stap is het plaatsen van de twee relaislenzen die de eerste stationaire telecentrische vlak op de tweede stationaire telecentrische vlak zullen afbeelden.
Voor deze specifieke microscoop hebben de geselecteerde lenzen in de eerste relais dezelfde brandpuntsafstand F, dus de afstand tussen de twee spiegels hier is gewoon vier F. Voor deze opstelling is F gelijk aan 90 millimeter, dus de vier F-positie zal 360 millimeter van de scanspiegel verwijderd zijn. Om ervoor te zorgen dat de lenzen precies in het midden van het straalpad zijn gecentreerd, plaats je de eerste lens in het straalpad en kijk je naar de laserstraal op de volgende iris in het straalpad. Pas na de lens de hoogte van de lens aan zodat het verticale centrum van de straal op het centrum van de iris staat.
Pas vervolgens de horizontale straalpositie aan om de straal op de iris te centreren. Herhaal dit proces met de tweede lens. Vervolgens zal de scanspiegel worden ingesteld en zal de microscoop worden geroteerd om een eenvoudige plaatsing en uitlijning van onderdelen mogelijk te maken die anders verticaal zouden moeten worden aangepast.
Om de exacte positie van het tweede telecentrische vlak te vinden, steek je de resonante gal O in zijn scanunit en zet je hem aan.
Overzicht
Dit artikel beschrijft de constructie van een op maat gemaakt, real-time confocaal scan-beeldingsysteem dat microscopie en microendoscopie op videosnelheid mogelijk maakt. Het systeem biedt diverse beeldingsgeometrieën en toepassingen tegen aanzienlijk lagere kosten in vergelijking met standaard commerciële confocale systemen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Optische beeldvorming
Achtergrond
- Confocale microscopie is essentieel voor beeldvorming met een hoge resolutie.
- Standaardsystemen kunnen duur zijn en beperkt in hun aanpasbaarheid.
- Real-time beeldvorming is cruciaal voor dynamische biologische processen.
- Maatsystemen kunnen worden gebouwd met behulp van standaardcomponenten.
Doel van de studie
- Om de constructie van een kosteneffectieve confocale microscoop te demonstreren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het assembleren van het beeldvormingssysteem.
- Om de voordelen van aanpassing aan specifieke behoeften voor beeldvorming te belichten.
Gebruikte methoden
- Gebruik van standaardcomponenten voor de assemblage van de microscoop.
- Stapsgewijze uitlijning van spiegels en lenzen.
- Afstelling van straalpaden voor optimale beeldvorming.
- Veiligheidsmaatregelen voor lasergebruik tijdens de constructie.
Belangrijkste resultaten
- Het geconstrueerde systeem maakt flexibele beeldvormingsgeometrieën mogelijk.
- Real-time beeldvormingsmogelijkheden werden succesvol gedemonstreerd.
- De kostenbesparingen ten opzichte van commerciële systemen waren significant.
- Aanpassingsopties werden gedurende het gehele assemblageproces benadrukt.
Conclusies
- Een aangepaste confocale microscoop kan worden gebouwd met gemakkelijk verkrijgbare componenten.
- Deze aanpak biedt flexibiliteit en kosteneffectiviteit voor onderzoekers.
- Veiligheidsmaatregelen zijn cruciaal tijdens de assemblage en het gebruik van het systeem.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Confocale microscopie met scansnelheid op videoniveau en microendoscopie maken optische doorsneden met een hoge resolutie in real-time mogelijk van complexe biologische systemen, wat dynamische studies in discovery- en translationeel onderzoek ondersteunt. Aanpasbare, kostenefficiënte platforms vergroten de toegang tot geavanceerde beeldvorming voor targetvalidatie en mechanische risicoreductie, vooral waar commerciële systemen aan flexibiliteit tekortkomen. Deze mogelijkheid versterkt het voorspellend vertrouwen en de continuïteit over vroege ontdekkingsfasen, screening en preklinische beslismomenten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt visualisatie met hoge gevoeligheid van specifieke cellulaire targets en subcellulaire structuren mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door dynamische monitoring van biologische processen in real time mogelijk te maken.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via driedimensionale beeldvorming van levende systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor voor downstream compound-screeningworkflows.
- Levert kwantitatieve, reproduceerbare optische doorsneden voor assay-standaardisatie.
- Maakt schaalbare imagingplatforms mogelijk die aanpasbaar zijn aan diverse assayformaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Biedt in vivo imagingmogelijkheden voor ziekte-relevante modelsystemen.
- Stemmi de imagingresultaten af op translationele biomarkerstrategieën bij toepassing op levend weefsel.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door directe visualisatie van biologische responsen mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit aanpasbare confocale imagingsysteem slaat een brug tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinisch onderzoek door een herbruikbaar, aanpasbaar platform voor resolutie-rijke beeldvorming te bieden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking via optische sectieing en dynamische beeldvorming.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assayontwikkeling en verbindingsevaluatie.
- Analytica: Biedt driedimensionale gegevens met een hoge resolutie voor vergelijkende analyse over verschillende experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Maakt continuïteit in in vivo beeldvorming mogelijk, van ontdekking tot preklinische validatie.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Biedt een flexibele beeldvormingscapaciteit die aanpasbaar is aan evoluerende R&D-behoeften.
Operationele en ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van imaging-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door directe visualisatie van biologische effecten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang binnen de R&D-pipeline.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in optische uitlijning en laserveiligheidsprotocollen.
- Vereist toegang tot standaard optische componenten en analytische infrastructuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare beeldresultaten.
- Aanpasbaar voor verschillende modelsystemen met geschikte hardwaremodificaties.
- Praktische beperkingen omvatten de complexiteit van de uitlijning en de noodzaak van strikte veiligheidsmaatregelen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Setting Up the Resonant Galvanometric Mirror and Relay Optics
4:56
Setting Up the Second Scanning Mirror and Rotating the Microscope
6:37
Setting Up the Scan, Tube, and Objective Lenses
8:17
Setting Up and Aligning the Confocal Pinhole and Detector
12:38
The Assembled System and Representative Images
13:43
Conclusion
