Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Deze video demonstreert hoe men een confocale scannende microscoop met videoscansnelheid kan construeren met behulp van standaard commercieel verkrijgbare componenten. Een confocale scannende microscoop vertrouwt op de gecoördineerde beweging van twee scannende spiegels om de bundel over het rastervlak te verplaatsen; het licht van de eerste spiegel wordt horizontaal gescand over de eerste set relaislenzen, die het licht terugfocussen naar een stationair punt op de tweede scannende spiegel. Dezelfde scanbeweging wordt vervolgens via de scan- en tubuslenzen overgebracht, waardoor de nu uitgebreide lichtbundel op de achterapertuur van de objectieflens wordt geplaatst.

De tweede spiegel, waarvan de beweging traag is in vergelijking met de eerste spiegel, scant gelijktijdig de Y-as, waardoor scanning boven en onder het geïllustreerde vlak mogelijk wordt en een rechthoekig raster op het sample-oppervlak wordt gecreëerd. Het belangrijkste voordeel van dit protocol ten opzichte van de aanschaf van een commercieel beschikbare microscoop is de lage kostprijs en de mogelijkheid om het instrument aan te passen aan de specifieke behoeften van een imaging-project. Bij het werken met elke laser is het essentieel om passende veiligheidsmaatregelen te nemen om oogletsel te voorkomen.

Draag indien mogelijk altijd de juiste laserbeschermingsbril. Toeschouwers en of onderzoekers die niet actief de straal uitlijnen of ermee werken, moeten altijd een bril dragen. Verwijder alle glimmende en reflecterende horloges of sieraden.

Het belangrijkste is dat u de straal te allen tijde volgt en beheerst door het pad ervan af te sluiten met een straalblokkering of een gemonteerd visitekaartje. Dit is met name belangrijk bij het uitlijnen van spiegels, aangezien het pad van de straal moeilijk te voorspellen kan zijn. Houd daarnaast uw ogen nooit op gelijke hoogte met het straalpad.

Schakel de laser uit als u het vlak van de straal moet kruisen voordat u de microscoop assembleert. Zorg ervoor dat alle benodigde apparatuur voor de constructie beschikbaar is, inclusief de optische breadboard en 90 graden beugels, alle spiegels, lenzen en dichroïsche filters, samen met de juiste klemmen en montagehardware, beide scanspiegels en de fotodetector. Het is ook handig om een functiegenerator bij de hand te hebben om de scanactie te testen en de spiegels tijdens de uitlijning te manipuleren.

Het wordt daarnaast sterk aanbevolen om de optische tafel vast te bouten voor de stabiliteit. Begin de constructie van de microscoop door de pigtail fiber ator in de optische houder te plaatsen en deze assemblage in het midden van de optische tafel te positioneren. Dit komt overeen met de oorsprong van de blauwe straal, zoals hier wordt weergegeven.

Schakel de lichtbron in. Gebruik de stelschroeven om de straal grofweg zo af te stellen dat deze zowel horizontaal als verticaal in een rechte lijn loopt. Plaats een iris voor de vezelcollimator.

Pas vervolgens de hoogte van het irisdiafragma aan zodat de straal door het centrum gaat. Verplaats het irisdiafragma daarna langs het straalpad weg van de ator. Controleer de uitlijning van de straal.

Gebruik de twee stelschroeven om de straal indien nodig opnieuw op het irisdiafragma te positioneren. Plaats de gemonteerde diïedrische spiegel in het straalpad, waarbij de laserstraal in het centrum van de spiegel is gepositionneerd. Draai de spiegelhouder om de straal onder een hoek van ongeveer 90 graden te reflecteren, waarbij u ervoor zorgt dat de hoogte van de straal niet verandert.

Klem de spiegel aan de tafel door de schroeven op de houder aan te draaien. Plaats vervolgens de gemonteerde resonante galvanometrische spiegel in het pad van de laserstraal. Zorg er hierbij voor dat de laserstraal exact in het horizontale midden van het spiegeloppervlak is gepositioneerd.

Draai de spiegelhouder zodat de laserstraal in een hoek van 90 graden wordt gereflecteerd. Pas vervolgens de reflectie via de spiegel grofweg aan om dezelfde verticale hoogte van de laserstraal te behouden. Plaats daarna twee irissen direct voor de resonante gal.

Stel vervolgens hun verticale hoogte in zoals voorheen, waarbij de laserstraal die wordt gereflecteerd door de resonante gal-spiegel als referentie dient. Gebruik nu de schroefgaten op het optische breadboard als visuele gids om de twee irissen in een rechte lijn vast te klemmen. Stel de eerste spiegel in het pad, de dichroïsche spiegel, af om de straal in het midden van de eerste iris te centreren.

Stel vervolgens de tweede spiegel in het pad af. Gebruik de resonante gal om de bundel op de tweede iris te centreren. Pas deze twee spiegels iteratief aan totdat de bundel door beide irissen is uitgelijnd.

Controleer of de laserstraal die wordt gereflecteerd door de resonante gal-spiegel nog steeds vanaf het approximate midden van de spiegel wordt gereflecteerd. Als de straal afwijkt, pas dan de houder van de vezelcollimator aan en herhaal de afstellingen zodanig dat de straal gecentreerd is op beide open irissen. De volgende stap is het plaatsen van de twee relaislenzen die het eerste stationaire telecentrische vlak zullen projecteren op het tweede stationaire telecentrische vlak.

Voor deze specifieke microscoop hebben de geselecteerde lenzen in het eerste relais dezelfde brandpuntsafstand F, waardoor de afstand tussen de twee spiegels hier simpelweg vier F is. Voor deze opstelling is F gelijk aan 90 millimeter, dus de 4F-positie bevindt zich op 360 millimeter van de scanningspiegel. Om ervoor te zorgen dat de lenzen precies in het midden van het straalpad zijn gecentreerd, plaatst u de eerste lens in het straalpad en bekijkt u de laserstraalspot op de volgende iris in het straalpad. Pas vervolgens de hoogte van de lens aan zodat het verticale centrum van de straal samenvalt met het centrum van de iris.

Pas vervolgens de positie van de horizontale straal aan om de straal in het midden van het irisdiafragma te centreren. Herhaal dit proces met de tweede lens. Daarna wordt de scanspiegel geïnstalleerd en wordt de microscoop gedraaid om de plaatsing en uitlijning van onderdelen, die anders verticaal zouden moeten worden afgesteld, te vergemakkelijken.

Om de exacte positie van het tweede telecentrische vlak te bepalen, sluit de resonante galvo aan op de scaneenheid en schakel deze in. Gebruik een visitekaartje om het pad van de scanstraal door de twee lenzen te volgen. Het tweede telecentrische vlak bevindt zich op ongeveer vier F van de resonante galvo en kan worden geïdentificeerd als de locatie waar de scanstraal stationair lijkt te blijven.

Markeer het breadboard onder deze locatie met een potlood. Zodra het telecentrische vlak is geïdentificeerd, stelt u de ingang van de scanningspiegel in op nul volt en schakelt u de hardware voor de spiegelbesturing in, zodat de spiegel tot in zijn neutrale positie kan stabiliseren. Positioneer vervolgens de standaard Galil-scanningspiegel op de exacte locatie van het tele-vlak.

Pas de positie van de spiegel aan zodat de straal in het tele-vlak precies in het centrum van de scanningspiegel valt en draai de spiegelhouder vast. Draai nu de borgschroef van de galvo-spiegel los en roteer deze, zodat wordt gewaarborgd dat de straal verticaal voortplant. Schakel vervolgens de laser en de scanelektronica uit.

Koppel de vezel los en ontkoppel de scanningspiegels. Bevestig vervolgens het tweede breadboard aan het eerste met behulp van montagebeugels van 90 graden voor breadboards.

Draai tot slot de gehele microscoop voorzichtig zodat de nieuwe optische tafel plat ligt en gebruik de klem om de microscoop in positie te fixeren. Sluit de gal o en de laser hier opnieuw aan en vergeet niet de gal O terug te zetten naar nul volt. De rest van de voorheen verticale opstelling kan eenvoudig worden uitgevoerd op de platte optische tafel.

Vervolgens stellen we de tweede set relaislenzen op, formeel aangeduid als de scanlens en de tubuslens. Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor zeer belangrijke informatie over het kiezen van de juiste combinatie lenzen. Begin met het opstellen van de lenzen.

Leg eerst de spiegels klaar die nodig zijn om de straal naar de objectieflens te sturen. Plaats de eerste grote spiegel van twee inch dicht bij de rand van de breadboard en draai de spiegelhouder zodat de laserstraal ongeveer 90 graden wordt gereflecteerd. Pas de reflectie van de spiegel aan om dezelfde verticale straalhoogte te behouden.

Plaats vervolgens de andere spiegel van twee inch aan de tegenovergestelde rand van de breadboard om de bundel in een hoek van 90 graden te richten en gebruik de stelschroeven om deze te fixeren. Stel daarna twee irissen in en stel de twee spiegels zoals eerder beschreven af om de bundel te centreren. Plaats vervolgens de scannens op zijn brandpuntsafstand van de gal in het bundelpad en stel de horizontale en verticale positie ervan af.

Om de laserstraal op de eerste iris tussen de twee spiegels te centreren, plaatst u de grote tube lens van twee inch voorzichtig op de juiste afstand van de scanlens en past u de horizontale en verticale positie aan om de straal op de eerste iris te centreren. In deze opstelling bevindt de tube lens zich op een afstand van 75 millimeters plus 300 millimeters wanneer alle componenten zijn geplaatst.

Sluit de gal O aan op de uitgang van een standaard elektrische functiegenerator of besturingscircuit, en stel de piek-tot-piekspanningen in op één tot drie volt. Begin vervolgens met het scannen van de twee spiegels met behulp van een visitekaartje. Lokaliseer de laserstraal in het stationaire vlak, 300 millimeters na de tubuslens.

Plaats de objectieflens in het straalpad en zorg ervoor dat de achteropening van de objectieflens zo dicht mogelijk bij het stationaire vlak wordt gepositioneerd. Stel de monsterhouder in en controleer of de verplaatsbare Z-asbevestiging de bevestiging van de objectieflens niet raakt wanneer deze over zijn bereik wordt verplaatst. Om de confocale pinhole en detector in te stellen, begint u met het loskoppelen van alle stroomvoorzieningen en glasvezelkabels.

Draai de microscoopassemblage zodanig dat deze opnieuw op de optische tafel rust, terwijl de resonante scanningspiegel wordt vastgehouden. Nadat de vezel opnieuw is aangesloten op de collimator en de standaard scanningspiegel, en de stroom-, voedings- en besturingskabels zijn aangesloten, wordt er, zoals voorheen op de tafel, nul volt ingesteld op de besturingsspanning die de standaard scanning gal aanstuurt; plaats vervolgens een monster van een heldere kleurstof sandwich tussen twee dekglasplaatjes. Zet daarna de laserbron aan en stel de kleurstof scherp.

Stel het laservermogen zo in dat de fluorescentie zo helder mogelijk is met behulp van een visitekaartje. Volg de fluorescentie-emissie van het monster via de objectieflens door het scanningsysteem naar de dichroïsche spiegel, die de laserstraal reflecteert en de fluorescentie-emissie zal doorlaten. Zoek dit fluorescentiesignaal aan de andere zijde van de dichroïsche spiegel.

Dim nu de kamerverlichting. Plaats een spiegel achter de dichroïsche spiegel om de emissie in een hoek van 90 graden te reflecteren. Richt vervolgens met een iris en een spiegel de fluorescentiebundel zo recht en parallel mogelijk aan het breadboard.

Vervolgens wordt de confocale pinhole-unit opgezet met behulp van de spatial filter cage mount-assemblage van Thor Labs. Dit diagram geeft de opstelling weer. De scanningspiegel bevindt zich op stationaire vlakken die telecentrisch zijn ten opzichte van een stationair objectief.

Tussen de stationaire vlakken werken paren lenzen in het vlak van de achteropening om de gescande bundels door te geven. Het eerste paar lenzen heeft een gelijke brandpuntsafstand en vormt een één-op-één telescoop. Het tweede paar lenzen, formeel bekend als de scanlens en de tubuslens, hoeven geen gelijke brandpuntsafstand te hebben en dienen vaak als een bundel-uitbreidende telescoop om te garanderen dat de achteropening van het objectief wordt overvuld.

Het door het monster uitgezonden licht reist terug door het scanningsysteem en gaat door de dichroïsche spiegel. Een kortbrandpuntslens of een objectieflens focust het emissielicht door het confocale pinhole, waarna het door een lens wordt gecollimeerd. Een laatste lens focust de confocaal gefilterde emissie op een fotomultiplicatorbuis.

Plaats de ruimtelijke filtereenheid in lijn met het emissiepad, waarbij u erop let dat de eerste focusing-lenshouder gecentreerd wordt op de emissiestraal. In dit geval is een ruimtelijke filtereenheid met een pinhole-diameter van 100 microns gekozen. Monteer vervolgens een lens met een korte brandpuntsafstand in de eenheid en schuif de Z-translatiehouder totdat er een duidelijke focus op het pinhole-oppervlak waarneembaar is.

Zorg ervoor dat de gehele unit is uitgelijnd langs de rechte lijn van de fluorescentiestraal. Klem de unit vast op het optische broodbord. Gebruik nu de instelknoppen op de translatietafel om de twee assen aan te passen en voer een 2D-zoekopdracht uit over het oppervlak van de pinhole-houder om het punt te vinden waar het fluorescentiesignaal door de pinhole maximaal is.

Plaats vervolgens de coatinglens op de kooimontage na het pinhole. Gebruik een visitekaartje om het fluorescentie-ion te lokaliseren dat door de confocale eenheid gaat en schuif de coatinglens langs de stangen tot de uitgezonden fluorescentie zo goed mogelijk is gecollimeerd. Stel de fotomultipliërbuis-assemblage in. Plaats een lens met een brandpuntsafstand van 50 millimeter in het pad van de fluorescentie-emissiestraal en bepaal het brandpunt.

Markeer deze positie op de breadboard. Zet nu de laser volledig uit en positioneer de fotomultiplicatorbuis zodanig dat het venster zich zo dicht mogelijk bij het gemarkeerde brandpunt bevindt. Verbind vervolgens de assemblage met de focuslens met behulp van verstelbare lenstubes.

Wikkel donkere tape rond alle blootgestelde straalpaden na het pinhole, zet de laser aan en houd het vermogen extreem laag. Zet de fotomultiplicatorbuis aan terwijl u zorgvuldig de spanning op de oscilloscoop afleest. Terwijl de laserintensiteit wordt verhoogd, verhoogt u de spanning totdat er een piekachtige uitlezing en/of een DC-offset op het oscilloscoopscherm zichtbaar is.

Bevestig dat dit signaal inderdaad afkomstig is van de fluorescentie door het laservermogen uit te schakelen of de straalpad te blokkeren om een signaalverlies waar te nemen. Lijn tenslotte de pinhole iteratief uit voor een maximaal signaal op de oscilloscoop. Door eerst de Z-positie van de focuslens te manipuleren en vervolgens de YZ-translatietafel aan te passen, is de hardware van de video rate microscoop voltooid.

Schakel eerst de fotomultiplicatorbuis uit. Sluit nu de aangepaste besturingskaarten van de spiegels en de computer aan zoals weergegeven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Dit systeem kan worden aangepast voor het uitvoeren van confocale scannende micro-endoscopie.

Vervang de tafel door een vezelhoudertafel; zie hiervoor de bijbehorende tekst of details. De voltooide rechtopstaande confocale scannende microscoop en micro-endoscoop moeten eruitzien zoals hier afgebeeld. De laser- en emissiestralen zijn getekend als visuele hulpmiddelen.

Tijdens een micro-endoscopie-operatie houdt een vezelhouder de beeldvezel op zijn plaats voor experimenten. Deze vezelhouder kan eenvoudig worden vervangen door een XY-tafel voor specifieke toepassingen. Het hier getoonde rechtopstaande microscoopplatform is een representatief testbeeld van een kleine letter M die op een wit visitekaartje is gedrukt, waarbij een video-rate framegrabberkaart is gebruikt om beelden te genereren uit het binnenkomende signaal. Gebleekt.

Wit papier bevat fluorescentiekrachten die gemakkelijk worden geëxciteerd door UV- en blauw licht, wat resulteert in een heldere achtergrond achter het donkere. De letter M en een emissiefilter gecentreerd op 515 nanometers werden gekozen om deze fluorescentie-emissie op te vangen. Een geringe vervorming van het beeld kan worden waargenomen, vooral nabij de zijdelingse randen van het beeldkader.

Deze vervorming is het gevolg van het sinusvormige scanpatroon van de acht kilohertz gvo-spiegel en wordt in detail besproken in het bijbehorende document. Deze film toont voorbeeldgegevens van de videosnelheid die zijn verkregen door een visitekaartje te scannen. Na het bekijken van deze video zou u nu een goed begrip moeten hebben van hoe u een confocale scannende microscoop met videosnelheid bouwt en uitlijnt.

Vergeet niet dat werken met laserlicht uiterst gevaarlijk kan zijn en dat tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het verwijderen van alle reflecterende sieraden en het vermijden van werken waarbij de ogen zich op dezelfde hoogte als de straallijn bevinden.