Name: Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Leer een video-rate confocale microscoop bouwen met standaard componenten voor neurobiologisch onderzoek. Dit kosteneffectieve systeem biedt flexibele beeldgeometrieën en real-time micro-endoscopie mogelijkheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Thorlabs bedanken voor hun ondersteuning van dit project. AJN wil de steun van een NSF Graduate Fellowship. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Institutes of Health via New Innovator Award van de NIH directeur Program verlenen nummer 1 DP2 OD007096-01. Informatie over de New Innovator Award Programma is op <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . De auteurs willen Tom Hayes bedanken voor het gebruik van de Harvard Electronics lab.

<ol><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Springer Verlag. 985-985 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li>
<li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li>
<li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li>
<li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li>
<li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+%28Cell-viZio%29+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li>
<li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Endoscopica%22%5BJournal%5D)">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li>
<li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li>
<li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+optics%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li>
</ol>

De productie van deze video-deze video werd gesponsord door Thorlabs, Inc

Deze video-rate imaging systeem maakt gebruik van een resonante galvanometrische spiegel werken op ongeveer 8 kHz. Resonant spiegels kan heel hard als draaien op volle kracht, en hun hoge toonhoogte kunnen hinderlijk of zelfs gevaarlijk zijn bij voldoende blootstelling tijden. Hoewel hier niet aangetoond, is het raadzaam om de resonante galvanometrische spiegel in een transparante kast schild om een ​​aanzienlijke vermindering van het systeem volume en / of passende horen beschermingsmiddelen, zoals oordoppen te dragen. Het resonante galvanometrische spiegel scans in een sinusvormige patroon. Echter, framegrabber kaarten te lezen in het signaal, uitgaande van een volledig lineaire sweep tarief in zowel de horizontale en verticale richting. Aangezien een sinusvormige vegen vertraagt ​​aan de randen van de scan, kan beeldcompressie artefacten worden waargenomen langs de snelle (horizontaal) beeld as. Een manier om dit probleem te minimaliseren is om opzettelijk rijden de resonante galvo spiegel scannen bereik aanzienlijk groter is dan derelais lens diameter. In dit te doen, zal alleen de bijna lineaire centrale oprit van het sinusvormige scan patroon doorkruisen van het monster, het minimaliseren van beeldvervorming. Een andere benadering zou zijn om na te bewerken verzamelde beelden om de snelle as lineariseren. Dit kan worden bereikt door beeldvorming een bekende fluorescerende patroon (zoals een rooster) en het gebruik van de bekende patroon afmetingen een verwerking script dat de verzamelde beelden unwarps te creëren. Deze bijzondere scanning systeem werd ontworpen voor het doel van de in vivo beeldvorming, die vaak vraagt ​​om een rechtopstaande georiënteerde video-rate microscoop. Voor cellulaire beeldvorming experimenten, zijn omgekeerde microscopen meer typisch gebruikt. De hier gepresenteerde ontwerp kan eenvoudig worden aangepast om een ​​dergelijke omgekeerde microscoop te bouwen, alles wat nodig is is een rotatie van de laatste 2 &quot;diameter spiegel. In plaats van het oriënteren van de spiegel om het scannen bundel naar beneden direct, kan de spiegel omhoog direct de balk. Het plaatsen van de objectief lens eent op dezelfde afstand van de spiegel, samen met een monster podium zou voor de beeldvorming in een omgekeerde geometrie. Als het imaging systeem wordt uitsluitend gebouwd voor microendoscopic imaging, is er geen reden om te &quot;vouwen&quot; de microscoop ontwerp verticaal helemaal. In plaats daarvan kan het hele scan systeem worden gebouwd op een enkele horizontale breadboard met het objectief gericht parallel aan de optische tafel. Merk op dat de microscoop in deze build een vaste pinhole configuratie gebruikt, terwijl dit biedt voor het grootste bouw eenvoud en het gemak van de aanpassing, gebruikers verlangen naar een meer veelzijdig systeem zou kunnen beraden over de integratie van een variabele pinhole, zoals te vinden in de meeste commerciële confocale microscopen. Doordat de gebruiker de grootte van het gaatje om te compenseren voor monsters van verschillende emissie-intensiteit aan te passen, dit kan de gebruiker de afweging tussen de signaalsterkte en de resolutie beter optimaliseren voor een bepaald monster. Het loice van het beeld vezels geselecteerd voor de microscoop is belangrijk. Wij raden u aan Sumitomo coherent beeld vezels vanwege hun nauwe vezelkern afstand en lage relatieve autofluorescentie. Image vezels vervaardigd door Fujikura is gebleken dat grote hoeveelheden autofluorescentie 10, die een zwakke fluorescentie signalen kunnen overweldigen door een monster en beperking van de uiteindelijke gevoeligheid van de microendoscope hebben. Sumitomo vervaardigd vezels, zoals de 8-30N die in deze configuratie, hebben een veel lager niveau dan de autofluorescentie Fujikura equivalenten. Terwijl leeched vezelbundels kan worden beschouwd als aantrekkelijk voor microendoscopy, hun ontwerp plaatst typisch individuele vezel kernen te ver uit elkaar, wat betekent dat de vezel kernen dun staal objecten, het weglaten van belangrijke regio&#39;s van potentieel belang. Ten slotte moet worden opgemerkt dat, terwijl de microscoop hier beschreven nuttig zal zijn in een verscheidenheid van in vitro en in vivo applications en kunnen worden gemaakt voor een fractie van de kosten van een full-featured commercieel systeem, heeft het geen functies zoals doorgelaten licht detectie, een oculair voor het bekijken, of een straalpad voor niet-confocale groothoek epifluorescentie. Hoewel het mogelijk is om een ​​systeem te bouwen met deze kenmerken uit het niets, kunnen lezers verlangen naar een dergelijk systeem willen een bestaand commercieel systeem om hun behoeften te voldoen in plaats van te starten een geheel nieuw te bouwen te wijzigen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Deel Naam </td><td> Fabrikant </td><td> Item Number </td><td> Specificaties </td><td> Hoeveelheid </td></tr><tr><td> 515 nm Band Pass Filter </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Lens 25,4 mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Lens 25,4 mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Lens 25,4 mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Achromatische Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating </td><td> Edmund Optics </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz R High Frequency Optical Scanner </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGC Driver </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA fotosensor Module </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Stroombegrenzing aanbevolen </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Power Supply </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Voor gebruik met H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS Doelstelling </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios EA / XA framegrabber kaart </td><td> Matrox </td><td> Solios EA / XA </td><td> MIL software nodig; OEM interconnects aanbevolen </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 12V voeding </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> +12 V, 8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5x Microscoop Doelstelling Lens </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> 0,10 NA, 25,4 mm Focal Length </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Coherent beeld Fiber </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 Borgschroef en Hardware Kit </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 micrometer Gemonteerd Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td> Ideaal voor het bouwen van ruimtelijke filters </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 mm Cage Clamp Cube </td><td> Thorlabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 mm Cage System Cube, 4-Way </td><td> Thorlabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber pigtailed Laser Diode, FC / PC </td><td> Thorlabs </td><td> LPS-406-FC </td><td> Product verouderd; vervangen door LP405-SF10 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5-Minute Epoxy, een Ounce </td><td> Thorlabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 Axis Kinematische Optic Mount </td><td> Thorlabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Borgschroef en Hardware Kit </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Stelschroef en Hardware Kit </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adapter met externe RMS discussies en interne SM1 Threads </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adj. FC / PC en FC / APC collimator, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> Thorlabs </td><td> CFK-2X-A </td><td> f = 2,0 mm </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Verstelbare Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded </td><td> Thorlabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Aluminium Breadboard, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 schroefdraad </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Benchtop Laser Diode / TEC Controller </td><td> Thorlabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror </td><td> Thorlabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kinematische Mount voor Ø1 &quot;Optics </td><td> Thorlabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC Mount voor Thorlabs Fiber-pigtailed Laser Diodes </td><td> Thorlabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lens Mount voor Ø18 mm Optics </td><td> Thorlabs </td><td> LMR18 </td><td> Een borgring inclusief </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lens Mounts voor 2 &quot;Optics </td><td> Thorlabs </td><td> LMR2S </td><td> Met interne en externe schroefdraad; borgring inbegrepen </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini-serie Cage Vergadering Rod, 6 &quot;Long, Ø4 mm, Aantal 1. </td><td> Thorlabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Pedestal pijler Post, 8-32 Kranen, een&quot; Long </td><td> Thorlabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pillar Bericht Extension, Lengte = 0,5 </td><td> Thorlabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pillar Bericht Extension, Lengte = 0,75&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm dik </td><td> Thorlabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 Rotating Verstelbare Scherpstellen Element, L = 1&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O2 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm dik </td><td> Thorlabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 um gemonteerd Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris Low Drift Ø1 &quot;Kinematisch Mirror Mount </td><td> Thorlabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Een lage drift </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 Lens Tube, L = 1 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Een borgring inclusief </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 schroefdraad 30 mm Cage Plate, 0,35 &quot;Thick </td><td> Thorlabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 tot M25 Optische Component Threading-adapter </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A24 </td><td> Externe SM1 discussies en interne M25.5x0.5 Threads </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kleine Beam Diameter Galvo System </td><td> Thorlabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Kleine Spannen Fork </td><td> Thorlabs </td><td> CF125 </td><td> 1 / 25 &quot;verzonken slot, universeel </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Ruimtelijke Filter Systeem </td><td> Thorlabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole wordt apart verkocht </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-Cooled Mount voor 5,6 &amp; 9 mm Lasers </td><td> Thorlabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Verticale Beugel voor breadboard </td><td> Thorlabs </td><td> VB01 </td><td> Elk </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocale microscopie en microendoscopy

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocale microscopie is uitgegroeid tot een onmisbaar hulpmiddel in de biologie en de biomedische wetenschappen, waardoor een snelle, hoge gevoeligheid en hoge-resolutie optische sectie van complexe systemen. Confocale microscopie wordt routinematig gebruikt, bijvoorbeeld om specifieke cellulaire doelwitten 1, monitor dynamiek studie in levende cellen 2-4, en de driedimensionale ontwikkeling van de hele organismen 5,6 visualiseren. Uitbreidingen van confocale beeldvormende systemen, zoals confocale microendoscopes, zorgen voor hoge resolutie imaging in vivo 7 en worden momenteel toegepast op de ziekte van beeldvorming en diagnose in klinische settings 8,9. Confocale microscopie biedt drie-dimensionale resolutie door het creëren van zogenaamde &quot;optische secties&quot; met behulp van eenvoudige geometrische optica. In een standaard wide-field microscoop, is fluorescentie gegenereerd op basis van een monster verzameld door een objectief en doorgegeven rechtstreeks naar een detector. Terwijl het accepterenstaat voor beeldvorming dunne monsters, dik stalen vertroebeld door fluorescentie gegenereerd boven en onder de doelstelling focal plane. In tegenstelling, confocale microscopie in staat stelt virtueel, optische sectie van de monsters, verwerpen out-of-focus licht om een ​​hoge resolutie drie-dimensionale representaties van de monsters te bouwen. Confocale microscopen bereiken prestatie met behulp van een confocale opening in de detectie stralengang. De fluorescentie verzameld uit een steekproef door de doelstelling is terug doorgestuurd via het scannen spiegels en door de primaire dichroïsche spiegel, een spiegel zorgvuldig geselecteerd om kortere golflengten, zoals de laser excitatie straal reflecteren, terwijl het passeren van de langere, Stokes-verschoven fluorescentie-emissie. Deze lange-golflengte fluorescentie-signaal wordt vervolgens doorgegeven aan een paar lenzen aan weerszijden van een pinhole die is gepositioneerd op een vliegtuig precies conjugaat met het brandvlak van het objectief. Fotonen verzameld uit de focale volume van het object worden gecollimeerdedoor het objectief en gericht door de confocale lenzen door het gaatje. Fluorescentie opgewekt boven of onder het brandvlak zal daarom niet goed gecollimeerd, en zullen niet door de confocale pinhole 1, het creëren van een optische gedeelte waarin alleen het licht van de microscoop focus is zichtbaar. (Afb. 1). Dus de pinhole werkt doeltreffend als een virtuele opening in het brandvlak, beperken de gedetecteerde emissie naar slechts een beperkte ruimtelijke locatie. Moderne commerciële confocale microscopen bieden de gebruikers volledig automatische bediening, waardoor voorheen complexe beeldvormende procedures relatief eenvoudig en toegankelijk. Ondanks de flexibiliteit en kracht van deze systemen, zijn commerciële confocale microscopen niet goed geschikt voor alle confocale beeldvorming taken, zoals veel in vivo imaging-toepassingen. Zonder de mogelijkheid om op maat gemaakte beeldvormende systemen te creëren om hun behoeften te voldoen, kan belangrijke experimenten uit te blijven van de reach voor veel wetenschappers. In dit artikel geven we een stap-voor-stap methode voor de complete bouw van een aangepaste, video-rate confocale imaging systeem van basis-componenten. De oprechten microscoop zal worden gebouwd met behulp van een resonante galvanometrische spiegel om het snel scannen as bieden, terwijl een standaard snelheid resonante galvanometrische spiegel zal de langzame as scan. Voor het maken van een precieze gescand balk in de objectieve lens focus, zullen deze spiegels worden geplaatst op de zogenaamde telecentrische vliegtuigen met behulp van vier relais lenzen. Confocale Detectie zal worden uitgevoerd met behulp van een standaard, off-the-shelf fotomultiplicatorbuis (PMT), en de beelden zullen worden vastgelegd en weergegeven met behulp van een Matrox framegrabber-kaart en de meegeleverde software.

De complete bouw van een aangepaste, real-time confocale scanning imaging-systeem is beschreven. Dit systeem, dat gemakkelijk kan worden gebruikt voor video-rate microscopie en microendoscopy, zorgt voor een scala aan imaging-geometrieën en toepassingen die niet toegankelijk zijn met behulp van standaard commerciële confocale systemen, tegen een fractie van de kosten.

Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Confocale microscopie is een onmisbaar instrument geworden in de biologie en de biomedische wetenschappen, waarmee snelle, hooggevoelige en hoge-resolutie optische ...

Deze video demonstreert hoe een confocale scanmicroscoop met videosnelheid kan worden geconstrueerd met behulp van standaard commercieel verkrijgbare componenten. Een confocale scanmicroscoop vertrouwt op de gecoördineerde beweging van twee scanmirrors om de straal over het rastervlak te verplaatsen; licht van de eerste mirror wordt horizontaal gescand over de eerste set relaislenzen, die het terug naar een stationair punt op de tweede scanmirror focust. Dezelfde scanbeweging wordt vervolgens via de scan- en tubuslenzen overgebracht, waardoor de nu uitgebreide lichtbundel op de achteropening van de objectieflens wordt geplaatst.De tweede spiegel, waarvan de beweging traag is in vergelijking met de eerste spiegel, scant gelijktijdig de Y-as, waardoor scanacties boven en onder het geïllustreerde vlak mogelijk zijn en er een rechthoekig raster op het sampleoppervlak wordt gecreëerd. Het belangrijkste voordeel van dit protocol ten opzichte van de aanschaf van een commercieel beschikbare microscoop is de lage kostprijs en de mogelijkheid om het instrument aan te passen aan de specifieke behoeften van een imagingproject. Bij het werken met elke laser is het essentieel om passende veiligheidsmaatregelen te nemen om oogletsel te voorkomen.Draag indien mogelijk altijd de juiste laserbeschermingsbril. Toeschouwers en/of onderzoekers die niet actief de straal uitlijnen of ermee werken, moeten altijd een bril dragen. Verwijder alle glimmende en reflecterende horloges of sieraden.Het belangrijkste is dat u de straal te allen tijde volgt en beheerst door het pad te beëindigen met een straalblokker of een gemonteerd visitekaartje. Dit is vooral van belang bij het uitlijnen van spiegels, aangezien het pad van de straal moeilijk te voorspellen kan zijn. Breng bovendien uw ogen nooit op dezelfde hoogte als het straalpad.Schakel de laser uit als u het vlak van de straal moet kruisen voordat u de microscoop assembleert. Zorg ervoor dat alle benodigde apparatuur voor de constructie aanwezig is, inclusief het optische breadboard en de beugels van 90 graden, alle spiegels, lenzen en dichroïsche filters, samen met de passende klemmen en montagehardware, beide scanningspiegels en de fotodetector. Het is daarnaast nuttig om een functiegenerator bij de hand te hebben om de scanactie te testen en de spiegels tijdens de uitlijning te manipuleren.Het wordt daarnaast sterk aanbevolen om de optische plaat vast te bouten voor meer stabiliteit. Begin met de constructie van de microscoop door de pigtail fiber ator in de optische houder te plaatsen en deze assemblage in het midden van de optische plaat te positioneren. Dit komt overeen met de oorsprong van de blauwe straal, zoals hier wordt getoond.Schakel de lichtbron in. Gebruik de stelschroeven om de straal grof af te stellen, zodat deze zowel horizontaal als verticaal in een rechte lijn loopt. Plaats een iris voor de vezelcollimator.Pas vervolgens de hoogte van de iris aan zodat de straal door het centrum gaat. Verplaats daarna de iris langs het straalpad weg van de ator. Controleer de uitlijning van de straal.Gebruik de twee stelschroeven om de straal op het diafragma te herpositioneren indien nodig. Plaats de gemonteerde diic-spiegel in het straalpad, waarbij de laserstraal in het midden van de spiegel is gepositioneerd. Draai de spiegelhouder om de straal onder een hoek van ongeveer 90 graden te reflecteren, waarbij u er zeker van bent dat de hoogte van de straal niet verandert.Klem de spiegel aan de tafel door de schroeven op de houder aan te draaien. Plaats vervolgens de gemonteerde resonante galvanometrische spiegel in het pad van de laserstraal. Let er hierbij op dat de laserstraal zich precies in het horizontale centrum van het spiegeloppervlak bevindt.Draai de spiegelhouder zodat de laserstraal onder een hoek van 90 graden wordt gereflecteerd. Stel vervolgens de reflectie van de spiegel grof bij om dezelfde verticale hoogte van de laserstraal te behouden. Plaats daarna twee irissen direct voor de resonante galvo.Stel vervolgens hun verticale hoogte opnieuw in, waarbij de laserstraal die wordt gereflecteerd door de resonante gal-spiegel als referentie dient. Klem nu de twee irissen in een rechte lijn vast, waarbij de schroefgaten op het optische breadboard als visuele richtlijn dienen. Stel de eerste spiegel in het pad, de dichroïsche spiegel, bij om de straal op de eerste iris te centreren.Stel vervolgens de tweede spiegel in het pad af. Gebruik de resonante galvo om de straal op de tweede iris te centreren. Stel deze twee spiegels iteratief bij totdat de straal door beide irissen is uitgelijnd.Controleer of de laserstraal die wordt gereflecteerd door de resonante gal-spiegel nog steeds vanuit het approximate midden van de spiegel wordt gereflecteerd. Als de straal afwijkt, pas dan de houder van de vezelcollimator aan en herhaal de afstellingen waarbij de straal gecentreerd is op beide open diafragma's. De volgende stap is het plaatsen van de twee relaislenzen die het eerste stationaire telecentrische vlak zullen afbeelden op het tweede stationaire telecentrische vlak.Voor deze specifieke microscoop hebben de geselecteerde lenzen in het eerste relais dezelfde brandpuntsafstand F, waardoor de afstand tussen de twee spiegels hier simpelweg vier F bedraagt. Voor deze opstelling is F gelijk aan 90 millimeter, dus de vier F-positie bevindt zich op 360 millimeter afstand van de scanningspiegel. Om ervoor te zorgen dat de lenzen precies in het midden van de straalpad liggen, plaatst u de eerste lens in het straalpad en kijkt u naar de laserstraalspot op de volgende iris in het straalpad. Pas vervolgens de hoogte van de lens aan zodat het verticale centrum van de straal samenvalt met het centrum van de iris.Pas vervolgens de positie van de horizontale bundel aan om de bundel in het midden van het diafragma te centreren. Herhaal dit proces met de tweede lens. Daarna wordt de scanningspiegel geïnstalleerd en wordt de microscoop gedraaid om de plaatsing en uitlijning te vergemakkelijken van onderdelen die anders verticaal zouden moeten worden afgesteld.Om de exacte positie van het tweede telecentrische vlak te bepalen, plaatst u de resonante gal O in de scaneenheid en schakelt u deze in. Gebruik een visitekaartje om het pad van de scanstraal door de twee lenzen te volgen. Het tweede telecentrische vlak bevindt zich ongeveer vier F vanaf de resonante gal O en kan worden geïdentificeerd als de locatie waar de scanstraal stationair lijkt te zijn.Markeer het breadboard onder deze locatie met een potlood. Zodra het telecentrische vlak is geïdentificeerd, stelt u de ingang van de scanningspiegel in op nul volt en schakelt u de hardware voor de spiegelbesturing in, zodat de spiegel naar zijn neutrale positie keert. Positioneer vervolgens de standaard scanning galil-spiegel op de exacte locatie van het tele-vlak.Pas de positie van de spiegel aan zodat de straal in het tele-vlak precies het centrum van de scanningspiegel raakt en draai de spiegelhouder vast. Maak nu de borgschroef los waarmee de gal-spiegel is vastgezet en roteer deze, terwijl u erop let dat de straal verticaal voortplant. Zet vervolgens de laser en de scanning-elektronica uit.Koppel de vezel los en verwijder de scanspiegels. Bevestig vervolgens het tweede breadboard aan het eerste met behulp van montagebeugels van 90 graden.Draai ten slotte de gehele microscoop voorzichtig zodat het nieuwe breadboard plat ligt en gebruik de klem om de microscoop in positie te fixeren. Sluit de gal o en laser hier opnieuw aan en vergeet niet de gal O terug te zetten naar nul volt. De rest van de voorheen verticale opstelling kan eenvoudig worden uitgevoerd op het platte breadboard.Vervolgens stellen we de tweede set relaislenzen in, formeel aangeduid als de scanlens en de tubuslens. Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor zeer belangrijke informatie over het kiezen van de juiste combinatie lenzen. Begin met het plaatsen van de lenzen.Plaats eerst de spiegels die nodig zijn om de straal naar de objectieflens te sturen. Plaats de eerste grote spiegel van twee inch dicht bij de rand van de optische tafel en draai de spiegelhouder zodat de laserstraal ongeveer 90 graden wordt gereflecteerd. Pas de reflectie van de spiegel aan om dezelfde verticale straalhoogte te behouden.Plaats vervolgens de andere spiegel van twee inch aan de tegenovergestelde rand van de breadboard om de straal in een hoek van 90 graden te richten en gebruik de stelschroeven om deze te fixeren. Stel daarna twee irisdiafragma's in en stel de twee spiegels zoals eerder beschreven af om de straal te centreren. Plaats vervolgens de scannens op zijn brandpuntsafstand van de gal in het straalpad en stel de horizontale en verticale positie ervan bij.Om de laserspot op de eerste iris tussen de twee spiegels te centreren. Plaats de grote tube lens van twee inch voorzichtig op de juiste afstand van de scanlens en stel de horizontale en verticale positie af om de straal op de eerste iris te centreren. In deze opstelling is de tube lens geplaatst op een afstand van 75 millimeters plus 300 millimeters wanneer alle componenten zijn gemonteerd.Sluit de gal O aan op de uitgang van een standaard elektrische functiegenerator of regelcircuit, en stel de piek-tot-piekspanningen in op één tot drie volt. Begin vervolgens met het scannen van de twee spiegels met behulp van een visitekaartje. Lokaliseer de laserstraal in het stationaire vlak, 300 millimeter na de tubuslens.Plaats de objectieflens in het straalpad en zorg ervoor dat de achteropening van de objectieflens zo dicht mogelijk bij het stationaire vlak wordt gepositioneerd. Stel de monsterhouder in en zorg ervoor dat de verplaatsbare Z-as houder de objectiefhouder niet raakt terwijl deze over zijn bereik wordt verplaatst. Om de confocale configuratie, het pinhole en de detector in te stellen, begint u met het loskoppelen van alle voedingen en glasvezelkabels.Draai de microscoopassemblage zo dat deze opnieuw op de optische tafel rust, waarbij de resonante scanningspiegel wordt vastgehouden. Nadat de vezel opnieuw is aangesloten op de collimator en de standaard scanningspiegel, en de voedings- en besturingskabels zijn aangesloten, stelt u de aansturingsspanning van de standaard scanning gal in op nul volt, zoals voorheen op de tafel; plaats een monster van een heldere kleurstofsandwich tussen twee dekglasplaatjes. Zet vervolgens de laserbron aan en stel de kleurstof scherp.Stel de lasersterkte zo in dat de fluorescentie zo helder mogelijk is, gebruik hiervoor een visitekaartje. Volg de fluorescerende emissie van het monster via de objectieflens en het scansysteem naar de dichroïsche spiegel, die de laserstraal reflecteert en de fluorescerende emissie doorlaat. Zoek dit fluorescentiesignaal aan de andere zijde van de dichroïsche spiegel.Dim nu de kamerverlichting. Plaats een spiegel achter de dichroïsche spiegel om de emissie in een hoek van 90 graden te reflecteren. Richt vervolgens, met behulp van een iris met een spiegel, de fluorescentiestraal zo recht en parallel mogelijk aan de breadboard.Vervolgens wordt de confocale pinhole-unit opgezet met behulp van de spatial filter cage mount-assemblage van Thor Labs. Dit diagram geeft de opstelling weer. De scanningspiegel bevindt zich in stationaire vlakken die telecentrisch zijn ten opzichte van een stationaire objectief.Samenstellingen van lenzen tussen de stationaire vlakken van het vlak van de achteropening dienen om de gescande bundels door te geven. Het eerste paar lenzen heeft een gelijke brandpuntsafstand en vormt een één-op-één telescoop. Het tweede paar lenzen, formeel bekend als de scanlens en de tubuslens, hoeven geen gelijke brandpuntsafstand te hebben en dienen vaak als een bundel-uitbreidende telescoop om ervoor te zorgen dat de achteropening van het objectief overvuld wordt.Het licht dat door het monster wordt uitgezonden, reist terug door het scansysteem en gaat door de dichroïsche spiegel. Een kortbrandpuntslens of een objectieflens focust het emissielicht door het confocale pinhole, waarna het door een lens wordt gecollimeerd. Een laatste lens focust de confocaal gefilterde emissie op een fotomultiplicatorbuis.Plaats de ruimtelijke filtereenheid in lijn met het pad van de emissiestraal, waarbij u er op let dat de eerste brandpuntslenshouder gecentreerd is op de emissiestraal. In dit geval is een ruimtelijke filtereenheid met een pinhole-diameter van 100 microns gekozen. Monteer vervolgens een lens met een korte brandpuntsafstand in de eenheid en verschuif de Z-translatiehouder totdat er een scherpe focus op het pinhole-oppervlak kan worden waargenomen.Zorg ervoor dat de gehele unit is uitgelijnd langs de rechte lijn die door de fluorescentiestraal wordt bepaald. Klem de unit vast op de optische tafel. Gebruik nu de instelknoppen op de translatiepodium om de twee assen aan te passen en voer een 2D-zoekprocedure uit over het oppervlak van de pinhole-houder om het punt te vinden waar het fluorescentiesignaal door de pinhole maximaal is.Plaats vervolgens de coatinglens op de koopmontage na het pinhole. Gebruik een visitekaartje om het fluorescente ion te vinden dat door de confocale eenheid gaat en schuif de coatinglens langs de staven totdat de uitgezonden fluorescentie zo goed mogelijk is gecollationeerd. Stel de fotomultiplicatorbuis-assemblage in. Plaats een lens met een brandpuntsafstand van 50 millimeter in het pad van de fluorescentie-emisiebundel en bepaal het brandpunt.Markeer deze positie op de breadboard. Zet nu de laser volledig uit en positioneer de fotomultiplicatorbuis zodanig dat het venster zich zo dicht mogelijk bij het gemarkeerde brandpunt bevindt. Verbind vervolgens de assemblage met de focuslens met behulp van instelbare lenstubes.Wikkel donkere tape rond alle onbedekte straalpaden na het pinhole, zet de laser aan en houd het vermogen hiervan extreem laag. Zet de fotomultipliër aan terwijl u zorgvuldig de spanning op de oscilloscoop afleest. Terwijl de laserintensiteit wordt verhoogd, verhoogt u de spanning totdat er een piekachtige uitslag en/of een DC-offset op het scherm van de oscilloscoop te zien is.Bevestig dat dit signaal inderdaad afkomstig is van fluorescentie door het laservermogen uit te schakelen of de straalpad te blokkeren om een signaalverlies waar te nemen. Lijn ten slotte iteratief de pinhole uit voor een maximaal signaal op de oscilloscoop. Door eerst de Z-positie van de focuslens te manipuleren en vervolgens de YZ-translatiepodia aan te passen, is de hardware van de video-rate microscoop compleet.Schakel eerst de fotomultiplicatierbuis uit. Sluit nu de spiegels, de aangepaste regelkaarten en de computer aan zoals weergegeven in het bijbehorende geschreven protocol. Dit systeem kan worden aangepast voor het uitvoeren van confocale scannende micro-endoscopie.Vervang de tafel door een vezelhoudertafel; raadpleeg hiervoor de bijbehorende tekst of details. De voltooide rechtopstaande confocale scannende microscoop en micro-endoscoop moeten eruitzien zoals hier getoond. De laser- en emissiestralen zijn getekend als visuele hulpmiddelen.Tijdens een micro-endoscopische operatie houdt een vezelhouder de beeldoorvoervezel op zijn plaats voor experimenten. Deze vezelhouder kan eenvoudig worden vervangen door een XY-tafel voor diverse toepassingen. Het hier getoonde rechtopstaande microscopische platform is een representatief testbeeld van een kleine letter m, gedrukt op een wit visitekaartje, vastgelegd met een video rate frame grabber-kaart om beelden te genereren uit het binnenkomende signaal. Gebleekt.Het witte papier bevat fluorescerende stoffen die gemakkelijk worden geëxciteerd door UV- en blauw licht, wat resulteert in een heldere achtergrond achter het donkere vlak. Voor het opvangen van deze fluorescentie-emissie is een emissiefilter gekozen met een centrum op 515 nanometers. Een geringe vervorming van het beeld is waarneembaar, met name nabij de zijdelingse randen van het beeldkader.Deze vervorming is het gevolg van het sinusvormige scanpatroon van de gvo-spiegel van acht kilohertz en wordt in detail besproken in het bijbehorende document. Deze video toont voorbeeldgegevens van de videoscan-snelheid, verkregen door een visitekaartje te scannen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een confocale scanning-microscoop met videoscan-snelheid bouwt en uitlijnt.Vergeet niet dat werken met laserlicht extreem gevaarlijk kan zijn en dat er tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het verwijderen van alle reflecterende sieraden en het vermijden van werken op ooghoogte met de straalweg.

video-rate-scanning-confocal-microscopy-and-microendoscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hoornvlies confocale microscopie is een niet-invasieve klinische techniek die kan worden gebruikt om C vezels schade te kwantificeren diagnosticeren en patiënten stratificeren met toenemende neuropathische ernst.

Corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de Small Fibre Pathologie kwantificeren Perifere Neuropathieën

In veel biologische en klinische situaties is het voordelig om cellulaire processen te bestuderen als ze zich ontwikkelen in hun eigen micro-omgeving. Hier beschrijven we de montage en het gebruik van een low-cost fiber-optische microscoop, die real-time beeldvorming kan bieden in celkweek, dierproeven en klinische studies de patiënt.

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Probe-based confocale laser endomicroscopy maakt real-time microscopie van de menselijke urinewegen tijdens cystoscopie, het verstrekken van dynamische, intravitale beeldvorming van pathologische toestanden, zoals blaaskanker met cellulaire resolutie. Endomicroscopy kan vergroten de diagnostische nauwkeurigheid van standaard wit licht endoscopie en zorgen voor intraoperatieve beeld leidraad voor chirurgische resectie te verbeteren.

Probe-based Confocale Laser Endomicroscopy van de urinewegen: De Techniek

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

We beschrijven een matrigel-plugtest om het angiogeen potentieel van een pool van factoren te illustreren die worden afgescheiden door kankercellen, met behulp van twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten, echografie en endomicroscopie. De matrigel, een buitencelmatrix (ECM)-nabootsende gel, wordt gebruikt om de gastheer (muis) te introduceren met angiogeen factoren die worden afgescheiden naar het geconditioneerde medium...

Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen

De assemblage en het gebruik van een multimodaal microendoscoop wordt beschreven, die oppervlakkige weefseldatagegevens kan co-registreren met fysiologische weefselparameters, waaronder hemoglobineconcentratie, melanineconcentratie en zuurstofverzadiging. Deze techniek kan nuttig zijn voor het evalueren van weefselstructuur en perfusie, en kan worden geoptimaliseerd voor individuele behoeften van de onderzoeker.

Multimodale beeldvorming en spectroscopie Fiber-bundel microendoscopy Platform voor niet-invasieve,<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Analyse

Hier gepresenteerd is het protocol van de Conpokal techniek, die confocale en atomaire kracht microscopie combineert in een enkel instrument platform. Conpokal biedt dezelfde cel, dezelfde regio, in de buurt van gelijktijdige confocale beeldvorming en mechanische karakterisering van levende biologische monsters.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

Extracellulaire blaasjes (EV's) dragen bij aan cellulaire biologie en intercellulaire communicatie. Er is behoefte aan praktische testen om de opname van EV's door de cellen te visualiseren en te kwantificeren. Het huidige protocol stelt de EV-opnametest voor door gebruik te maken van driedimensionale fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie, na EV-isolatie door een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat.

Extracellulaire vesikelopnametest via confocale microscoopbeeldvormingsanalyse

Dit manuscript beschrijft het ontwerp en de werking van een microtensiometer / confocale microscoop om gelijktijdige metingen van interfaciale spanning en oppervlaktedilatationale reologie uit te voeren terwijl de interfaciale morfologie wordt gevisualiseerd. Dit biedt de real-time constructie van structuur-eigenschap relaties van interfaces die belangrijk zijn in technologie en fysiologie.

Microtensiometer voor confocale microscopie visualisatie van dynamische interfaces

Tonen we de fabricage van een low-cost cryogene trap is ontworpen om de meeste gereflecteerde licht microscopen te passen. Dit lab-built cryogene stage maakt een efficiënte en betrouwbare correlatieve beeldvorming tussen de cryo-licht-en cryo-elektronenmicroscopie.

Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

Leer een video-rate confocale microscoop bouwen met standaard componenten voor neurobiologisch onderzoek. Dit kosteneffectieve systeem biedt flexibele beeldgeometrieën en real-time micro-endoscopie mogelijkheden.

Video-rate Scanning confocale microscopie en Microendoscopy

Meer video's verkennen