Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

Het algemene doel van deze procedure is om de antibiotica-gevoeligheid van bloedkweekisolaat in minder tijd te identificeren en beoordelen dan met conventionele methoden. Dit wordt bereikt door eerst het bloedkweekisolaat te identificeren. Met behulp van een nieuwe 16 s ribosomale, DNA MultiPro PCR-assay.

Vervolgens wordt het isolaat gedurende zes uur geïncubeerd met een panel van antibiotica. De volgende stap is om de groei of groeiremming van het isolaat in aanwezigheid van het antibioticum te bepalen met behulp van een kwantitatief 16 s ribosomaal D-N-A-P-C-R-assay. Uiteindelijk tonen de resultaten aan dat identificatie en antibiotica-gevoeligheidstesten van een bloedkweekisolaat sneller kunnen worden verkregen door deze combinatie van kweek en PCR.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die met behulp van geautomatiseerde Phoenix- of IIC-systemen, is dat er geen voorafgaande kweekstatus vereist is en dat resultaten van identificatie en antibiotica-gevoeligheidstesten binnen dezelfde dag beschikbaar kunnen zijn. Het demonstreren van de procedure zullen Vandy Hanson en GID ing PhD-studenten zijn uit ons laboratorium. Verdun 100 microliters van de bloedkweek positief voor microbieel groei in een reactiebuis met 900 microliters 0,9% natriumchloride. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 13.400 keer G om de bacteriën te bezinken na de centrifugatie.

Rees op, suspendeer het pellet in 100 microliters steriele gedemineraliseerd water. Installeer het monster op vier graden Celsius tot verder gebruik. Zodra alle monsters klaar zijn, bereid de real-time PCR-reactiemixen voor om specifiek 16 s ribosomaal DNA van de belangrijke bacteriën te versterken.

Gebruik gedemineraliseerd water om de volumes aan te passen tot 20 microliters per reactie. Pipetteer 20 microliters PCR-mix per putje in een 96-wells PCR-plaat. Voeg vervolgens vijf microliters monster toe aan elk putje en verzegel de PCR-plaat.

Voer vervolgens de PCR uit op het A BI Prism 7, 900 HT real-time PCR-systeem om de resultaten te analyseren zodra de PCR is voltooid, gebruik eerst het tabblad analyse-instellingen om de CT-analyse aan te passen naar 0,1. Vervolgens vernauw de baseline-configuraties om te beginnen met cyclus zes en te eindigen met cyclus 15. Noteer de CT-waarde voor elk monster.

De grenswaarde om een PCR-resultaat als positief te beschouwen, kan over het algemeen worden ingesteld op een CT-waarde van 35. In dit voorbeeld wordt het identificatieprofiel van een met e coli geïnfecteerde bloedkweek getoond in twee reactiemixen. Universele 16 s ribosomaal DNA-primers waren opgenomen en genereerden twee amplificatiecurven van CT 25,2 en 25,95.

De derde amplificatiecurve is afgeleid van de sonde specifiek voor Coli. Andere specifieke sondes genereerden geen detecteerbare signalen. Zodra de ziekteverwekker is geïdentificeerd, kan antibiotica-testen worden uitgevoerd.

Begin door vijf milliliter bouillon van een positieve bloedkweek over te brengen in een serumscheidingsbuis. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 2000 keer G na de centrifugatie, gooi het supan-middel uit de buis. Breng vervolgens met een steriele wattenstaafjes de bacteriën over van de gellaag van de buis in 0,9% natriumchloride tot een oplossing met een troebelheid van een 0,5 McFarland-standaard is verkregen.

Dit komt overeen met ongeveer 1,5 keer 10 tot de achtste kolonievormende eenheden per milliliter. Verdun vervolgens de suspensie in dubbele concentratie Muller Hinton. Twee bouillon om een concentratie van ongeveer vijf keer 10 tot de vijfde kolonievormende eenheden per milliliter te verkrijgen.

Pipetteer 50 microliters per putje van de suspensie in een microtiterplaat die al 50 microliters per putje van een selectie van antibiotica bevat. Zorg ervoor dat u positieve groeicontrollen voor elk monster opneemt door putjes met water in plaats van antibiotica te gebruiken. Dek de plaat af wanneer u klaar bent.

Bekijk vervolgens de plaat gedurende zes uur bij 37 graden Celsius om bacteriegroei mogelijk te maken. Zorg ervoor dat u een aliquot van de bacteriesuspensie bij vier graden Celsius bewaart als negatieve groeicontrole. Na de zes uur durende incubatie, breng de inhoud van elk putje en het negatieve controlemonster over in afzonderlijke steriele buisjes.

Na een centrifugatie van vijf minuten bij 16.000 keer. G, verwijder 80 microliters supernatant en hersuspendeer de pellets in 80 microliters steriele gedemineraliseerd water. Verdun de monsters 1 op 10 in water voordat u ze gebruikt voor 16 s ribosomaal, DNA real-time PCR.

Bereid de PCR-mix voor met behulp van de IQ cyber green supermix en 16 s ribosomaal DNA-primers en aliquot. 20 microliters per putje in een 96-wells PCR-plaat. Voeg vervolgens vijf microliters van elk monster toe aan de putjes en verzegel de plaat.

Voer vervolgens de PCR uit om de resultaten te analyseren. Bereken eerst de grenswaarde van de CT. In het algemeen is de grenswaarde van de CT gelijk aan de CT van de positieve groeicontrole plus 0,5 keer de CT van de negatieve groeicontrole minus de CT van de groeicontrole.

Echter, voor piperacilline piperacilline met tazobactam en CEF dazadi in gram-negatieve staven, evenals voor amoxicilline, oxacilline en trimethoprime met sulfamethoxazol in staphylococcus aureus of van amoxicilline. In enterococcus SPP, moet de vermenigvuldigingsfactor van 0,5 worden verlaagd tot 0,25. De gevoeligheid of resistentie van de stammen in elk monster kan worden bepaald door de CT van het monster te vergelijken met de grenswaarde van de CT.

Een CT-waarde boven de grenswaarde duidt op gevoeligheid, terwijl een CT-waarde onder de grenswaarde duidt op resistentie. Hier is een voorbeeld van een antibiotica-gevoeligheidsversterkingsplot. De eerder geïdentificeerde e coli-stam werd getest op gevoeligheid voor verschillende antibiotica, elk weergegeven door een afzonderlijke curve.

Monsters met een