Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

Het algemene doel van deze procedure is om de antibioticaresistentie van bloedkweekisolaten in minder tijd te identificeren en te beoordelen dan met conventionele methoden. Dit wordt bereikt door eerst het bloedkweekisolaat te identificeren met behulp van een nieuwe 16 s ribosomale DNA MultiPro PCR-assay.

Vervolgens wordt het isolaat zes uur lang geïncubeerd met een panel antibiotica. De volgende stap is het bepalen van de groei of groeiremming van het isolaat in aanwezigheid van het antibioticum met behulp van een kwantitatieve 16 s ribosomaal D-N-A-P-C-R-assay. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat de identificatie en antibioticagevoeligheidstest van een bloedkweekisolaat sneller kunnen worden verkregen via deze combinatie van kweek en PCR.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die met geautomatiseerde phoenix- of IIC-systemen, is dat er geen voorafgaande kweekstatus vereist is en dat de resultaten van de identificatie en antibioticagevoeligheidstesten op dezelfde dag beschikbaar kunnen zijn. De procedure zal worden gedemonstreerd door Vandy Hanson en GID ing, PhD-studenten van ons laboratorium. Verdun 100 µL bloedkweek die positief is voor microbiële groei in een reactiebuis met 900 µL 0,9% natriumchloride. Centrifugeer het monster vervolgens bij 13.400 ×g gedurende vijf minuten om de bacteriën na de centrifugatie te pelletteren.

Reese, resuspendeer het pellet in 100 µL steriel gedemineraliseerd water. Bewaar het monster bij vier °C tot verder gebruik. Zodra alle monsters gereed zijn, bereid je de real-time PCR-reactiemengsels voor om specifiek 16 s ribosomaal DNA van de bacteriën van belang te amplificeren.

Gebruik gedemineraliseerd water om de volumes aan te passen naar 20 µL per reactie. Pipetteer aliquots van 20 µL PCR-mix per putje in een 96-wells PCR-plaat. Voeg vervolgens vijf µL monster toe aan elk putje en seal de PCR-plaat.

Voer vervolgens de PCR uit op het A BI Prism 7, 900 HT real-time PCR-systeem. Om de resultaten te analyseren nadat de PCR is voltooid, gebruikt u eerst het tabblad analyse-instellingen om de CT-analyse aan te passen naar 0,1. Stel daarna de baseline-configuraties zo in dat deze beginnen bij cyclus zes en eindigen bij cyclus 15. Noteer de CT-waarde voor elk monster.

De afkapwaarde om een PCR-resultaat als positief te beschouwen kan over het algemeen worden vastgesteld op een CT-waarde van 35. In dit voorbeeld wordt het identificatieprofiel van een bloedkweek geïnfecteerd met E. coli getoond in twee reactiemengsels. Universele 16 s ribosomaal DNA-primers werden toegevoegd en genereerden twee amplificatiecurves met CT-waarden van 25,2 en 25,95.

De derde amplificatiecurve is afgeleid van de probe die specifiek is voor Coli. Andere specifieke probes genereerden geen detecteerbare signalen. Zodra de pathogeen is geïdentificeerd, kan antibioticatesten worden uitgevoerd.

Begin met het overbrengen van vijf milliliter bouillon uit een positieve bloedkweek naar een serumscheidingsbuis. Centrifugeer het monster 10 minuten lang bij 2000 ×g; gooi na de centrifugatie het scheidingsmiddel uit de buis. Breng vervolgens met een steriel wattenstaafje de bacteriën vanuit de gellaag van de buis over naar 0,9% natriumchloride totdat een oplossing met een troebeling van een 0,5 McFarland-standaard is verkregen.

Dit komt overeen met ongeveer 1,5 × 10⁸ colony forming units per milliliter. Verdun vervolgens de suspensie in dubbele concentratie Muller Hinton Two-bouillon om een concentratie van ongeveer 5 × 10⁵ colony forming units per milliliter te verkrijgen.

Pipetteer 50 µL van de suspensie per well in een microtiterplaat die al 50 µL per well van een selectie antibiotica bevat. Zorg ervoor dat er voor elk monster positieve groeicontroles worden opgenomen door wells met water in plaats van antibiotica te gebruiken. Dek de plaat af zodra dit is voltooid.

Incubeer de plaat vervolgens zes uur bij 37 °C om bacteriële groei mogelijk te maken. Zorg ervoor dat u een aliquot van de bacteriële suspensie bewaart bij 4 °C als negatieve groeicontrole. Breng na de incubatie van zes uur de inhoud van elke well en het monster van de negatieve controle over naar afzonderlijke steriele buisjes.

Na een centrifugatie van vijf minuten bij 16 000 ×g, worden 80 µL supernatant verwijderd en de pellets geresuspendeerd in 80 µL steriel gedemineraliseerd water. Verdun de monsters 1:10 in water voordat ze worden gebruikt voor 16S rDNA real-time PCR.

Bereid de PCR-mix voor met de IQ cyber green super mix en 16 s ribosomaal DNA-primers en verdeel 20 µL per putje in een 96-putjes PCR-plaat. Voeg vervolgens vijf µL van elk monster toe aan de putjes en seal de plaat.

Voer vervolgens de PCR uit om de resultaten te analyseren. Bereken eerst de cutoff CT-waarde. In het algemeen is de cutoff CT gelijk aan de CT van de positieve groeicontrole plus 0,5 maal de CT van de negatieve groeicontrole minus de CT van de groeicontrole.

Echter, voor piperacilline met tazobactam en CEF dazadi bij gramnegatieve staafjes, evenals voor amoxicilline, oxacilline en trimethoprim met sulfamethoxazol bij Staphylococcus aureus of amoxicilline bij Enterococcus spp., moet de vermenigvuldigingsfactor van 0,5 worden verlaagd naar 0,25. De gevoeligheid of resistentie van de stammen in elk monster kan worden bepaald door de CT van het monster te vergelijken met de cutoff ct.

Een CT-waarde boven de afkapwaarde duidt op gevoeligheid, terwijl een CT onder de afkapwaarde duidt op resistentie. Hier is een voorbeeld van een amplificatieplot voor antibiotica-gevoeligheid. De eerder geïdentificeerde E. coli-stam werd getest op gevoeligheid voor verschillende antibiotica, elk weergegeven door een aparte curve.

Monsters met een lage CT-waarde zijn monsters waarin groei heeft plaatsgevonden in de aanwezigheid van een antibioticum, wat duidt op resistentie tegen het geteste antibioticum. Omgekeerd vertegenwoordigt een hoge CT-waarde een monster waarin geen groei heeft plaatsgevonden, wat duidt op gevoeligheid voor het geteste antibioticum. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in negen uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.