Gebruik van de EpiAirway Model voor het karakteriseren van op lange termijn gastheer-pathogeen interacties

Het algemene doel van het volgende experiment is om een langdurige co-cultuur uit te voeren van Nontypeable Hemophilus influenza of NTHI met primaire menselijke respiratoire epitheliale weefsels met behulp van het epi luchtwegmodel. Dit wordt bereikt door de apicale oppervlakte te inoculeren met NTHI om de bacteriën toe te staan zich te hechten en de weefsels binnen te dringen als een tweede stap. De inserts worden elke 24 uur gewassen met voorverwarmd DPBS om normale slijmstroming na te bootsen en om mucine afvalproducten en eventueel cellulair puin te verwijderen.

Vervolgens worden de weefsels op het gewenste tijdstip geoogst en wordt de overleving van het totale celgeassocieerde of geïnternaliseerde NTHI bepaald. Ten slotte kan met deze methode stamspecifieke kenmerken van NTHI-overleving binnen de weefsels in de loop van de tijd worden geëvalueerd op basis van tellingen van levensvatbare bacteriën. Hoewel deze methode inzicht kan geven in langdurige infecties met nontypeable hemophilus influenza.

Het kan ook worden gebruikt in de studie van andere humane pathogenen zoals Moraxella Alis. Het demonstreren van deze procedure zal Dr.Doin zijn, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium. Verwijder de transportplaat uit de verpakking en bereid u voor om het experiment te beginnen. Spuit de transportplaat in met 70%ethanol en plaats de plaat in de bioveiligheidskast.

Pipetteer een milliliter van vier graden Celsius, epi luchtwegen, onderhoudsmedium in elk putje van een zesputjesplaat. Verwijder vervolgens de tape, open de plaat en verwijder het gaas dat de epi luchtweg-inserts bedekt. Gebruik een draaiende beweging, gebruik pincetten om een insert van de aros los te maken.

Plaats het insert in een van de putjes van de zesputjesplaat, indien nodig. Gebruik een steriele wattenstaafje om voorzichtig de aros van het insert te verwijderen, waarbij u de membraan niet aanraakt. Controleer of er geen luchtbellen onder de inserts zijn gevangen.

En plaats vervolgens de zesputjesplaat in een incubator. Was de inserts dagelijks als volgt, voorverwarm DPBS met calcium en magnesium en vul een tip met de DPBS. Gebruik vervolgens steriele pincetten om voorzichtig een insert op te pakken, pipet 200 microliter van de voorverwarmde DPBS op het weefsel.

Schudden de insert om de DPBS gelijkmatig te verdelen zonder het weefsel aan te raken. Kantel vervolgens de insert onder een hoek en plaats een P 1000 pipettip tegen de plastic ring die de membraan aan de onderkant van de insert vasthoudt. Aspirier vervolgens voorzichtig de bufferoplossing en plaats de oplossing in een cryobuisje voor later onderzoek.

Ten slotte aspireert u het basale onderhoudsmedium en vervangt u het door een milliliter vers medium. Voorverwarm meer DPBS met calcium en magnesium. Voeg drie milliliter van de voorverwarmde DPBS toe aan een 15 milliliter buis en suspendeer vervolgens enkele kolonies van nontypeable influenza of NTHI die 's nachts op chocolade-agar zijn gekweekt in de buis.

Vortex de buis nu krachtig gedurende ten minste 10 seconden en meet vervolgens de optische dichtheid. Blijf enkele kolonies van de NTHI toevoegen totdat de bacterieconcentratie een OD van 600 nanometer van ongeveer 0,7 bereikt. Was vervolgens elke EPI luchtweg-insert met voorverwarmde DPBS zoals eerder en voeg vervolgens 28 microliter van de bacteriesuspensie toe aan het apicale oppervlak van elke insert.

Vermijd het inoculeren van het basale onderhoudsmedium. Breng vervolgens de plaat terug in de incubator om de NTHI eerst voor te verwarmen en vervolgens oppervlaktedroog chocolade-agar platen. Verdun vervolgens het NTHI-inoculum serieel met steriele PBS met 0,1%gelatine of PBSG.

Druppel 10 microliter aliquots van het inocuulum op de platen en incubeer de platen vervolgens 's nachts bij 37 graden Celsius in 5%koolstofdioxide. De volgende dag bepaalt u de CFU's per milliliter door de verdunning die 15 tot 30 verschillende kolonies in elke druppel heeft te tellen, en berekent u terug naar uw werkelijke levensvatbare inoculum van NTHI om de totale celgeassocieerde bacteriën te oogsten. Spoel het apicale oppervlak van de epi luchtwegen drie keer met 200 microliter DPBS zonder calcium of magnesium.

Kanteel vervolgens de insert en spoel eventueel overgebleven onderhoudsmedium van de basale membraan. Plaats de gewassen insert in een nieuwe zesputjesplaat en voeg 250 microliter steriele 1%saponin-oplossing toe op het apicale oppervlak van elk weefsel. Breng de plaat terug in de incubator gedurende 10 minuten terwijl de plaat incubeert.

Stel buizen op voor seriële verdunning en vul elke verdunningsbuis met 900 microliter PBSG. Schrob vervolgens het weefsel van de membraan met een P 1000 pipettip met een heen-en-weergaande beweging, gevolgd door een cirkelvormige beweging om het weefsel van de randen van de insert te verwijderen. Gebruik vervolgens een steriele grote boring P 1000 pipettip en plaats de suspensie in een lege 1,5 milliliter einorbuis.

Voeg nu 250 microliter DPBS toe aan het apicale oppervlak van de insert en onderzoek vervolgens de insert met een omgekeerde fasecontrastmicroscoop om te bepalen of er nog weefsel over is om te oogsten. Voeg de suspensie toe aan de einorbuis en vul deze aan met 500 microliter DPBS. Vortex de celsuspensie gedurende één minuut.

Gebruik vervolgens een steriele één milliliter spuit voorzien van een 26 gauge naald. Aspirier de suspensie in de spuit door de naald. Laat de suspensie langzaam drie keer door de naald lopen, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.

Vortex vervolgens de suspensie nog een minuut krachtig. Gebruik vervolgens een grote boring pipettip om 100 microliter van de suspensie over te brengen in de eerste verdunningsbuis. Vortex de buis krachtig gedurende vijf seconden en maak vervolgens een tot 10 seriële verdunning. Plaat de verdunning op chocolade-agar platen.

Incubeer vervolgens de platen 's nachts bij 37 graden Celsius in 5%koolstofdioxide voor levensvatbare bacterietellingen om geïnternaliseerde bacteriën te